血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

このマイクロ流体実験の全体的な目標は、リアルタイムビデオ顕微鏡を使用して、流動条件下で反応性表面上のフィブリン形成における血小板沈着を同時に測定することです。この方法は、輸血された血液の凝固促進特性に対する血小板濃縮物調製の影響に関する輸血医学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、血小板機能と流れ中の凝固の同時分析を容易にし、両方のプロセス間の相互作用を調べることができることです。

この方法は、接触経路によって誘導される血小板凝固に関する洞察を提供できますが、脂質化組織因子でコーティングすることにより、外部経路の研究にも適用できます。手順を実演するのは、研究所の技術者であるロザリー・デヴルーです。マイクロ流体フローチャンバーのセットアップを開始するには、再構成したばかりのコラーゲン0.8マイクロリットルを、8つの直線平行チャネルを持つ新しい使い捨てマイクロ流体バイオチップの一方の端で各チャネルの長さの6分の5にピペッティングし、マイクロチップのこの端を出口としてラベル付けします。

バイオチップを摂氏4度で、加湿して密封した容器で少なくとも4時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、ブロッキングバッファーを塗布した混合バイオチップ内の同数のY字型チャンネルにコード化されたチャンネルを充填します。マイクロチップを容器に室温で1時間戻します。

次に、長さ8センチメートルのチューブと長さ2センチメートルのチューブの両端にピンを配置し、使用中のチャネルごとに長さ46センチメートルのチューブの両端にピンを配置します。次に、Nanopumpソフトウェアを使用して、接続されたチューブ内のすべてのポンプ流路系を蒸留水ですすぎ、シリンジコネクタピン内のシリンジをすすぎ、他のすべてのチューブをブロッキングバッファーで満たします。次に、コード化されたバイオチップを実験室用シザージャッキを使用して自動顕微鏡ステージに固定し、ミキシングバイオチップを顕微鏡ステージと同じ高さに固定します。

8センチメートルチューブのピンを使用して、これらのチューブをミキシングバイオチップインレットに固定し、各チューブの自由端をHEPES緩衝生理食塩水のバイアルに入れます。次に、コード化されたバイオチップを46センチメートルのチューブでミキシングバイオチップに柔軟で直線的に接続します。シリンジコネクタピンをリンスポンプのルアー対応チューブに取り付けます。

次に、ピンを2センチメートルのチューブの自由端に接続し、チューブのもう一方の端をコード化されたバイオチップの出口に固定します。次に、すべてのチューブとチャネルを1ミリリットルのHBSですすいでください。灌流ポンプを準備するには、Microfluidic Perfusion Pump Driverソフトウェアを開き、シリンジアイコンをダブルクリックしてポンプを初期化します。

使用するシリンジの種類を選択し、すすぎポンプとそれに接続されている2センチメートルのチューブを外します。切断された 2 cm チューブとシリンジコネクタピンを厚肉廃棄物チューブのルアーロックに接続し、シリンジを使用して厚肉チューブに標準ペプシン溶液を充填します。次に、厚肉チューブの開放端をKocherクランプで固定します。

チューブをコード化されたバイオチップの出口に固定します。2つのチューブをミキシングフローチャンバーから一緒に外し、HBSの容器を廃棄します。排気されたクエン酸ナトリウム容器で血液サンプルを取得した後、チューブを遠心分離し、血小板が豊富な血漿を新しい遠心分離チューブに移します。

容器を多血小板血漿で再度スピンダウンします。次に、上清の血小板が少ない血漿を別の遠心チューブに移します。次に、21ゲージの針を使用してクエン酸ナトリウム容器の底に穴を開け、詰められた赤血球が新しい円錐形のチューブに滴下できるようにします。

詰まった赤血球が全て採取されたら、分離した詰めた赤血球を血小板の少ない血漿と組み合わせ、輸血用に調製した血液銀行血小板を注入して、ヘマトクリット値が40%、10倍から5倍までのサンプルを1マイクロリットルあたり2.5ミリリットルの最終体積まで加えて、全血球計算を求めます。次に、13マイクロリットルの蛍光色素標識フィブリノーゲンをポリスチレン円錐管に加えます。再構成された血液の1ミリリットルが続きます。

さらに1ミリリットルの血液を2マイクロリットルの蛍光血小板染料と混合し、標識した血液サンプルを一緒に加えます。次に、混合血液サンプルを静かに反転させ、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。灌流アッセイを開始する前に、顕微鏡の光学系を最初のチャネルの底部に付着したコラーゲン繊維に焦点を合わせます。

集録ソフトウェアを使用して、選択したチャンネルの関心領域を定義します。予め温めた凝固緩衝液1ミリリットルを1ミリリットルのシリンジに装填し、シリンジを灌流ポンプに取り付けます。2回目の穏やかな反転の後、血液を2ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジを灌流ポンプに取り付けます。

次に、シリンジコネクタピンを使用して、両方のシリンジを8センチメートルのチューブの1つに取り付け、コネクタとチューブを毎分400マイクロリットルでプライミングします。すべてのチューブが凝固バッファーまたは血液で満たされたら、両方のチューブのもう一方の端をミキシングバイオチップのY字型チャネルの分割脚に固定します。次に、廃液チューブの出口にあるKocherクランプを取り外し、凝固バッファーの場合は毎分4.4マイクロリットル、再構成された血液の場合は毎分44マイクロリットルで灌流を開始します。

10秒ごとに30分間リアルタイムで画像を記録し、30分後または信号が飽和状態になったときにポンプと画像取得を終了します。次に、すべてのチューブとシリンジをバイオハザード廃棄物として廃棄します。このビデオは、血小板血栓とフィブリン沈着の蓄積の優れた例を提供します。

灌流の開始時に、血小板は反応性表面に付着し、記録された緑色蛍光が着実に増加しました。この接着段階では、フィブリンがわずかに形成されるだけであることを示す紫色の蛍光はほとんどありません。凝固が始まると、激しい蛍光フィブリンは急速に沈着し、血小板緑色の蛍光はほぼ同じ速度で蓄積します。

したがって、凝固開始の瞬間は、血小板凝固剤電位の決定要因として外挿することができます。再構成された血液へのコーントリプシン阻害剤の添加は血小板接着に影響を与えませんが、凝固は灌流実験の全期間にわたって開始されません。再構成されたサンプル中の血小板の数を増やすと、接着、蓄積、および凝固の速度が直線的に増加します。

血小板濃度が上昇すると発症の瞬間が大幅に短縮され、凝固を引き起こすには活性化された沈着血小板の閾値数が必要であることが示唆されています。さらに、コラーゲンのみでコーティングされたチャネル、または組換え脂質組織因子との組み合わせのチャネルのペア分析では、凝固の全体的な速度も血小板蓄積も条件間で異なることはありませんが、凝固の開始は有意に速くなります。このビデオを見れば、血小板機能と凝固を同時に分析するために、二重標識再構成血液を用いたマイクロ流体フローチャンバー実験を行う方法について十分に理解できるはずです。

開発後、この技術は、輸血医学の分野の研究者が血小板と流れ下での凝固との間の相互作用を探求する道を開きました。このビデオでは、標準化された実験のデモンストレーションに焦点を当てました。しかし、表面コーティング、シールド応力、またはカルシウム濃度の変化を導入することで、関心のある特定の研究課題に答えることができます。