Name: の検出のための磁気スターラー方法旋毛虫幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ磁気スターラー法による肉試料中の旋毛虫幼虫検出の標準手法。消化・濾過・沈降を経て顕微鏡で観察し、食品安全と寄生虫学診断の正確性を確保する実践的プロトコルを解説します。

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1.準備<ol><li> 試料捕集 注：磁気攪拌方法は、単一のまたはプールされた筋肉試料のために使用することができます。 <ol><li>適切な好みのサイトからサンプルを収集し、適切な量の9インチ国の要件やICT、OIEやISOの勧告を参照してください。 <ol><li>欧州連合（EU）のために、例えば、国内の豚の筋張った部分への移行でダイアフラム柱から1グラムのサンプルを取ります。すべての筋肉サンプルは、すべての脂肪と筋膜の自由であることを確認してください。 </li></ol></li><li>舌がテストされている場合は、試験前に表面層を除去します。 </li><li>サンプルが凍結している場合は注意してください、ほとんどの旋毛虫の幼虫として耐凍結されていないと死の後ほどく、消化に耐性が低いと減少し、アッセイ感度が得られ、容器の壁に固執する傾向があります。 注：凍結した場合は、lのサンプルサイズを倍増沈降時間を東と増加（下記参照）。 </li></ol></li><li> 消化液の調製 <ol><li> 3Lのガラスビーカーに48°C - 46で予熱水道水の2リットルに25％塩酸（16±0.5ミリリットル）を追加します。不完全消化の温度結果の低すぎます。温度が高すぎるペプシンの酵素特性を無効にします。 </li><li>ビーカーに攪拌棒を置き、予熱したプレート上のソリューション攪拌（46から48°C）を。 </li><li> （1：10,000 NF、1：12,500 BP、2000 FIP 1）酸性溶液にペプシンの10±0.2グラムを追加します。 注：ペプシンの品質が最も重要と酵素活性がプロデューサーによって認定されなければならないのです。実験室の安全上の理由及びペプシン活性を維持するために、消化液の成分を添加する順序は、に付着されなければなりません。 </li></ol></li><li> 筋肉試料調製 <ol><li>ブレンダーやグラインダーで筋肉サンプルの100グラムに切り刻みます。 BLENを容易にするために鼎は、サンプルに2 mLの水を予熱追加し、2のための最大速度でブレンド - 3秒。 </li><li>第二ブレンドする前に、ブレンダーを開き、下部にブレンドボウルエッジマージンの一番上にある任意の筋肉のサンプルを転送し、ブレンド繰り返します。肉の目に見える片がなくなるまで3秒 - 2のバーストとブレンド進みます。 注：あまりにも多くのブレンドは、サンプル6における旋毛虫の幼虫の存在を損傷することができますが少なすぎるとブレンドは、不完全な消化をもたらす可能性があります。 </li></ol></li></ol> 2.手順<ol><li> マッスルサンプル消化 <ol><li>シリンダ内に消化液の1 Lを転送します。ビーカーにひき肉を移し、スプーンやフォークでの消化液に広めます。徹底的に3Lのビーカーに予熱した消化液500mLでブレンダーの蓋、ブレードとブレンダーボウルをすすぎます。 注：不完全なすすぎは、SENSの損失につながることができますitivity。 </li><li>アルミホイルでビーカーを覆い、44の一定温度に保つ - 46°Cを、温度計を監視します。 </li><li>肉粒子が消えるまで飛散することなく、深い渦を作成するために、30分間の消化液を攪拌します。試験された肉の種類（野生動物の肉など ）に応じて、60分の最大まで消化時間を増加させます。 </li></ol></li><li> 濾過および消化液の沈降 <ol><li>未消化組織の量を決定するために、ゼロにスケールを調整し、使用前にふるいを計量し、その重量に注意してください。ふるいは、沈降漏斗に到達する旋毛虫の幼虫を妨げる可能性があり、清潔で、任意の組織粒子を欠いているでなければなりません。分離漏斗を垂直に平準化されていることを確認してください。 </li><li>消化後、慎重に分離ガラス漏斗に180μmの篩を通して消化液を注ぎます。分離ガラス漏斗の幅はbはしないでください良い幼虫の沈降を可能にする長さの55％よりも電子も大きいです。任意のオーバーフローを避けるように注意してください。 </li><li>感度の損失を回避するために、徹底的にスクイズ洗浄瓶から水道水の約200ミリリットルのガラスビーカーやふるいをすすぎ、沈降ガラス漏斗にすすぎ水を移します。慎重に3リットルのビーカーの縁を洗浄するために注意してください。ふるいを持ち上げて、徹底的にふるい下の面積をすすぎます。 </li></ol></li><li> 未消化組織量の決意 注：メソッドの実行中にエラーが原因で、筋肉組織が十分に筋膜と難消化性である結合組織として、篩上に残ることができます。未消化組織の量は、最初の10分間の沈降段階（2.5参照）の間に決定されます。残留水は、未消化の組織の決定された重量に影響を与えることができるので、これは、ふるいを乾燥させるために約30分を許可します。 <ol><li>規模で紙タオルを置き、undigesでふるいの重量を量りますテッド組織。 </li><li>未消化の組織とのふるい重量からろ過する前にふるいの重量を引きます。出発試料の重量の5％以下がふるい（ 即ち 、5 gで/ 100gで、出発物質）のままであれば、消化プロセスが十分考えられます。 </li><li>未消化組織の量が5％を超える場合は、新鮮な筋肉サンプルを使用してテストを繰り返して。残りの組織は、主に未消化の筋肉組織と新鮮なサンプルで構成されている場合は利用できません、再び未消化の遺骨を消化し、元のサンプルに加えて調べます。 </li></ol></li><li> 消化液の沈降 <ol><li> 30分間分液漏斗中で濾過消化液を保管してください。放置した場合、 旋毛虫の幼虫は、漏斗の底に沈降します。 </li><li>凍結したサンプルを使用する場合、60分の最大沈降時間を増加させます。 </li><li>沈降が完了したら、完全にストップコックを開き、（筋肉サンプルは、以前に凍結していた場合は80 mL）で消化液の少なくとも40 mLの迅速測定シリンダーにオフに実行させるための分液漏斗の。 </li><li>まず、シリンダ内に流体の半分をさせ、その後、完全に消化液10mLを通過できるように反対方向にコックを開きます。最後に、別の10 mLのための反対方向にコックを開きます。この手順は、 旋毛虫の幼虫は、活栓の中に閉じ込めていないことを保証します。 注：十分な速度、感度を低下させる、分液漏斗中に残っている幼虫を回避するために必要とされます。 </li></ol></li><li> シリンダ内の消化液の沈降 <ol><li>幼虫が沈降することを可能にするために10分間シリンダー内の堆積物を残します。 10 mLの堆積物を乱すことなくピペットで吸引することにより、30 mLの上清を取り除きます。 </li><li>試料中の組織の繊維の量を減少させるために、沈殿物を30mLの水道水を追加し、さらに10メートル残します液体が透明になるまでに。繰り返します。 </li><li>上清を除去し、10 mLのを転送するグリッドペトリ皿や幼虫計数盆地に堆積物を洗浄しました。 10mLの水道水でシリンダーを洗浄した後、サンプルに水を追加します。 注：サンプル中の破片の大量旋毛虫幼虫 （ 図1）の識別を防止することができるように必要であれば、さらなる洗浄工程が行われるべきです。 </li></ol></li><li> 顕微鏡検査 <ol><li>すぐに洗浄工程後の試料を検査するために15 20Xの倍率で調節可能な強度のサブステージ送信光源とtrichinoscopeまたはステレオ顕微鏡を使用してください。 </li><li>グリッドペトリ皿に試料を注いだ後、グリッドによって系統的グリッドディッシュ/盆地を調べます。何の容疑者構造が見つからない場合は、静かに任意の旋毛虫ラを可能にするために、循環方式でグリッド化ペトリ皿や幼虫計数流域内の流体を移動させます潜在的に見過ごされたrvaeは、ペトリ皿の中心に蓄積します。検査を繰り返します。 </li><li> 100X - 疑わしい構造が見つかった場合、40に倍率を上げます。ピペットでシャーレ/盆地から旋毛虫の幼虫を削除し、90％エタノールでチューブに集めます。 </li><li>完全な皿が検討された後、シャーレ/盆地の穏やかに振盪から出発し、手順を繰り返します。少なくとも3回、またはそれ以上の幼虫までの手順を繰り返します発見されました。 </li><li>幼虫の数をカウントします。筋組織の量に相関は、試験の結果、グラム（LPG）あたりの幼虫として存在します。 </li><li>あまりにも多くの幼虫が確実に幼虫の数を決定するために、消化液中に存在している場合は、メスシリンダーに幼虫を含む流体を返すスクイーズ洗浄瓶から水道水ですすぎ、そして底に沈殿する幼虫を残します。 </li><li> 10分間の沈降時間の後、所定容量の上清を低減する（ 例えば10mL）で。正確な量を決定するために、ピペットで新しいシリンダーに上清を移します。 </li><li>激しく振盪による流体に均一に幼虫を一時停止します。揺れ運動中に、ペトリ皿に20μLの幼虫の懸濁液の12滴を追加します。 </li><li>顕微鏡で各液滴を調べます。 240μL中の幼虫の数を決定し、最高と最低のカウントを削除します。上清の総容量（ 例えば 10ミリリットル）に幼虫の数を推定。 注：ステレオ顕微鏡の品質は、 旋毛虫幼虫の同定のために最も重要です。 </li><li>幼虫はピペットでチューブに回収された場合、幼虫はピペット壁に固執しませんでしたが、チューブに移していることを慎重に確認してください。 注：プールされたサンプルからの正旋毛虫の発見は、起源のカーカスに戻ってプールからトレースする必要があります。正の死体がアイデンなるまでここでは、プールのサイズを徐々に減少させるべきですtified。サンプルサイズはまた、感度を高めるために、このプロセスの間に増加することができます。集団サンプルの検査が陽性または不確実な結果を生成する場合には、さらに20グラムのサンプルは、各ブタから採取されます。 5匹のブタから​​20gのサンプルをプールし、記載された方法を用いて検査されます。このように5匹のブタの20グループからのサンプルを検討します。 旋毛虫は 5匹のブタからのプールされた試料中に検出されたときに、20gのサンプルは、グループ内の個々のブタから収集され、原点のプラスのカーカスが検出されるまで、それぞれを別々に検討します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

磁気撹拌法を容易に行うことができますが、厳密に技術的な詳細に付着していないと、このように消費者の健康を危険にさらす、感度不足につながります。重要管理点は、上記のテキストで強調表示されています。また、適切な機器の使用は、テストの成功した結果のために重要です。すべての血管が表面に幼虫の付着を低減するために、シリコンでコーティングされたガラスピペットの先端で作られるべきです。 消化法の感度は、筋肉の幼虫密度とテストした筋肉試料の量に依存します。 3の幼虫密度について-筋肉組織の5 LPG、100％の感度が報告されたが、1 LPGの下の感度は40％13に低下しました。試験された宿主動物種に応じて、試験の感度は、使用されるサンプルの量を増加させることによって改善することができます。私野生生物におけるnfection負担は、したがって、より大きなサンプルサイズが14を使用している、通常低いです。好発部位はまた、宿主動物によって異なります。ここでは、そのような舌のようないくつかの筋肉組織の下部消化は、より大きなサンプルサイズ15をもたらすことができ、考慮される必要があります。 また、磁気撹拌法は、内部統制が含まれていないことを理解することが重要です。したがって、ドキュメントへのサンプリングから、品質保証管理が正確かつ正確な結果を得ることが不可欠です。筋肉試料中の旋毛虫の幼虫を検出するための実験室での性能の品質は、習熟度テストで各アナリストの定期的な参加によって監視されるべきです。 方法のさらなる制限は、顕微鏡による筋肉の幼虫の最終識別ステージは非常に主観的とょんであること、調べアナリストによる幼虫の形態の知識にvily依存。 この問題を回避するための興味深い代替法は、ラテックス凝集試験によって幼虫検出したフィルタの分離に磁気攪拌方法/です。しかし、EUの法律に従って、この方法は、そのようなイノシシ4として、国内の豚のではなく、感染のリスクが高い動物用食肉のテストのために同等とみなされています。モノクローナル抗体を用いた幼虫抗原の同定は、試験より客観的になりますが、研究室に肉16グラム当たり幼虫の数を決定する可能性を否定しています。 磁気攪拌方法のさらなるバリエーションは、機械的補助プールされた試料分解法/沈降技術、機械的補助プールしたサンプルの発掘を含みますフィルタ分離技術、および最大35グラムの技術のプールされたサンプルの自動消化法上のestion法/。これらの技術は、すべての肉や旋毛虫の幼虫の視覚化および計数の人工消化に基づいていますが、濾過および沈殿の工程に使用される装置が異なるされています。 孤立した幼虫は、さらに分子検査（ 例えば 、マルチプレックスPCR）17によって種レベルで同定することができます。 EU法によると、全ての陽性サンプルは、 旋毛虫種の決意のための国家リファレンス研究施設やEURLPに転送する必要があります。

属旋毛虫の線虫は、世界中の肉食動物と雑食哺乳類、鳥類、爬虫類の横紋筋で検出することができます。これらの人獣共通線虫は、豚、馬から人間の生または半生肉や肉派生した製品を達することができ、ゲームの動物が摂取されています。この人獣共通感染症は疾病の徴候や症状、 例えば下痢、発熱、眼窩周囲浮腫および筋肉痛や、心筋炎、血栓塞栓症や脳炎1できるだけ合併症によって特徴づけられる、ヒトに重篤な疾患であることができます。 旋毛虫は野生と家畜における旋毛虫感染の最も普及している病原体であると世界中のヒトへの感染の大部分の原因となります。ヨーロッパ、北と西アフリカ、西アジアでは、 旋毛虫britoviは、ヒトへの感染の別のソースです。また、10他の分類群は、あまり一般的原因として報告されています<html>およびヒト疾患の薬剤は、通常、野生動物2に、世界のさまざまな地域で発見されています。そのようなイノシシ、クマ、セイウチやアナグマなどの野生動物に加えて、豚肉は、世界中のヒトへの感染の最も重要なソースを表します。 旋毛虫症を防ぐための最善の方法は、のコアに茶色にピンクから肉の色を変更するには、すなわち 、1分間&gt; 65°C（安全な温度に生の肉製品を食べることを控えるようにし、任意の肉を調理するために、特にゲームの肉であります肉製品）3。欧州連合（EU）と米国農務省は肉4、5でのT. spiralisの幼虫を殺すために使用することができ豚肉製品の冷凍調理時間と温度を指定しました。また、肉と肉製品中の旋毛虫の不活性化のための提言は、旋毛虫症に関する国際委員会によって発行されました&quot;外部参照&quot;&gt; 6。ヨーロッパでは、 旋毛虫感染のリスクが無視できる商業豚の群れにおける制御住宅事情の導入に加えて、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物4から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。 食品の安全性のために、消化アッセイは肉3,7における旋毛虫幼虫の直接検出のための唯一の信頼性のある手順です。消化アッセイのいくつかのバリエーションがあっても、磁気攪拌方法は、国際的に認められた基準法3、4、7です。このアッセイは、横紋筋組織における旋毛虫の幼虫の検出に基づいています。筋肉サンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化した後、 トライchinella幼虫を顕微鏡で識別されます。貿易債務と国内法に応じて、磁気撹拌法の一般的なプロトコルの小さな変動が多数あります。ここでは、技術的な詳細は、EUの要件4、ISO仕様8、ICTガイドライン6、および寄生虫（EURLP）のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所の経験や旋毛虫のためのドイツのリファレンスラボラトリーに基づいています。

<table><tbody><tr><td>ナイフ、ハサミ、ピンセット</td><td></td><td></td><td>サンプルの切断と非消化性組織の除去</td></tr><tr><td>ブレンダー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>鋭利なチョッピングブレード付き</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td></td><td></td><td>サーモスタット制御の加熱プレート付き</td></tr><tr><td>攪拌ロッド</td><td></td><td></td><td>テフロンコーティング、長さ約5cmの</td></tr><tr><td>円錐形ガラス分離漏斗</td><td></td><td></td><td>容量は少なくとも2Lで、できればテフロン安全プラグが取り付けられています。幅は、幼虫の沈降を良好にするために、長さの55%を超えてはなりません。</td></tr><tr><td>スタンド、リング、クランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふる</td><td></td><td></td>い <td>メッシュサイズ 180ミクロン、外径 11 cm、ステンレス鋼メッシュ付き</td></tr><tr><td>漏斗</td><td></td><td></td><td>内径は12&nbsp以上;cm、ふるいを支えるために</td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td></td><td></td><td>容量3 L</td></tr><tr><td>ガラス測定シリンダー</td><td></td><td></td><td>容量50〜100mL、または遠心分離管</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td>サブステージ透過光源付き 調整可能な強度または水平テーブル</td></tr><tr><td>付き旋</td>毛鏡 シャー<td></td><td></td><td>レ直径9 cm、下側に10 &timesにマークされています。尖った器具またはトリシノスコープ用の幼虫計数盆地を使用した10mm四方の検査領域</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td>ビーカーを覆う蓋</td></tr><tr><td>25% 塩酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプシン</td><td></td><td></td><td>強度:1:10,000 NF (米国ナショナルフォーミュラリー) 1:12,500 BP (英国薬局方)および2,000 FIP (F&eacute;d&eacute;ration internationale de pharmacie)、または最低660ヨーロッパ薬局方単位/ mL</td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>70-90%エチル</td><td></td><td></td>アルコール</tr><tr><td>水道水</td><td></td><td></td>で安定化液体ペプシン<td>46-48°Cに加熱。C 使用前のC</td></tr><tr><td>バランス</td><td></td><td></td><td>少なくとも 0.1 g に正確</td></tr><tr><td>金属トレイ</td><td></td><td></td><td>容量 10 から 15 L、残りの消化液を収集するために</td></tr><tr><td>ピペットとピペットホルダー</td><td></td><td></td><td>異なるサイズ (1、10、25 mL)</td></tr> <tr><td>温度計</td><td></td><td></td><td>0.5 & deg;C、少なくとも20°Cの温度範囲。Cから70&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>サイフォン</td><td></td><td></td><td>水道水用</td></tr></tbody></table>

の検出のための磁気スターラー方法<em&gt;旋毛虫</em筋肉試料中&gt;幼虫

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

旋毛虫症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、属旋毛虫の線虫の幼虫に感染した動物の生や加熱が不十分な肉の消費によって引き起こされます。ヒトへの感染の最も重要な情報源は、世界中のゲーム肉と豚肉や豚肉製品です。多くの国では、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物の死骸からの筋肉試料の人工的な消化によって、感染動物の識別に基づいています。 肉の消化が、磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられているに基づいていくつかの方法があります。この方法は、筋肉のサンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化後の顕微鏡による旋毛虫の幼虫の検出を可能にします。この方法は、特殊で高価な装置を必要としないが、内部対照を使用することができません。そのため、厳しい品質管理がapplieする必要がありますテストを通して、D。本研究の目的は、寄生虫のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所と旋毛虫のためのドイツの国立リファレンス研究所の経験に基づいて、アナリストに詳細な取扱説明書及び方法の重要管理点を提供することにあります。

<html>消化の後、感染性筋幼虫の形状は、識別をより困難に、変えることができます。典型的な形はしっかり巻か幼虫、軽くコイル状幼虫またはC字形または完全に解か幼虫（ - 2C図2B）が挙げられます。グラム当たり見つかった幼虫の数は大幅に変えることができ、1幼虫から数百幼虫の範囲とすることができます。 感染筋幼虫の形態は、 図2Aに示されています。 旋毛虫の幼虫長く、幅約0.3ミリメートル0.7〜1.5mmです。食道が狭く、わずかに丸みを帯びた端部を有します。キューティクルがスムーズです。体腔、stichosomeの前半では、構造は、45〜55大細胞（stichocytes）の列に囲ま細長い管から構成され、観察することができます。直腸は、任意の突起なしにも丸みを帯びているか、10、11の付属します。 トン&quot;&gt;その他の構成は、 旋毛虫の幼虫のほか、筋肉の消化後に見つけることができるいくつかの例は、 図3Aに示されている- 。。3F野生動物は、多くの場合、他の寄生虫に感染しているか、テストのために利用可能な筋肉サンプルは、アニメーションによって摘出プロセス中に汚染されていますまたは構造/生物無生物。幼虫の長さは、前部と後部の外観が終了し、stichosomeヘルプの発生が異なる線虫属12を区別します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> 図1：（A） が不足し、（B）、十分なすすぎ工程後旋毛虫幼虫の顕微鏡検査。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">大きい方がまし表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のrsion。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> 図2： 感染性旋毛虫幼虫の形態は、幼虫（A）の直腸、Stichosomeと食道を表示しています。 （B）きつく巻かれ、軽く幼虫と（C）の移動コイル状を示す消化後の筋肉の幼虫の可能な形状は、幼虫を解か。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> 図3： マグネティックスターラー法による筋サンプルの消化後の偶発病変の例。 （A）の毛のような毛イノシシで見つかったミミズ。 （B）イノシシからAlariaアラタ 。 （C）イノシシから筋線維。 （D） ブタ肺虫属のsp。イノシシから。イノシシ（F）に見られる（E）植物繊維： 回虫属 。イノシシから幼虫。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

多くの国で人間の旋毛虫症の予防は、世界的な磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられるの消化、の方法による感受性動物から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

この診断法の全体的な目的は、食中毒性の人獣共通感染寄生虫であるTrichinellaに寄生した食肉または食肉製品を特定することです。本手法は、食肉中のTrichinella幼虫を直接検出するためのゴールドスタンダードです。この技術の主な利点は、操作が容易であり、特殊な装置を必要としないことです。一般的に、この方法に不慣れな方は、内部コントロールが使用できず、試験全体を通して厳格な品質管理を適用する必要があるため、苦労することがあります。手順の実演は、私の研究室の技術者であるNora Thabenが行います。こんにちは！消化用の筋肉試料を準備するため、試料100 gramsをブレンダーまたはグラインダーに入れます。そして、混合を促進させるために、あらかじめ加熱した水を2 mL加えます。最大速度で2〜3秒間ホモジナイズします。2回目のホモジナイズを行う前に、ブレンダーを開け、ブレンダー容器の縁に付着した筋肉サンプルを底に移動させます。混合を繰り返し、肉の破片が見えなくなるまで2〜3秒間の断続的なブレンディングを続けます。この手順を開始する前に、テキストプロトコルに従って3リットルのビーカーに消化液を準備してください。予熱した消化液1リットルをフラスコに移します。挽肉をビーカーに移します。その後、スプーンまたはフォークを使用して、消化液の中で肉を分散させます。ブレンダーのボウル、蓋、ブレード、およびフォークを、残りの消化液で十分にすすいでください。温度計で監視しながら、ビーカーをホットプレートに置き、44から46 °Cの一定温度に保ちます。その後、ビーカーをアルミホイルで覆います。肉の粒子が消失するまで、飛散しないように注意しながら、深い渦を作るようにして消化液を30分間攪拌します。筋肉サンプルの消化後、消化液をろ過し、未消化組織の量を測定する必要があります。天秤をゼロ点に調整し、清潔な180 µmの篩を量り、その重量を記録します。分液漏斗が垂直に設置されているか確認してください。幼虫を十分に沈降させるため、分離用ガラス漏斗の幅は長さの55%を超えないようにしてください。消化液を篩（ふるい）を通して分離用ガラス漏斗に慎重に注ぎ、溢れないようにしてください。感度の低下を防ぐため、ガラスビーカーと篩を約200 millilitersの水道水で十分にすすいでください。その後、洗浄水を分液漏斗に移します。ふるい（シブ）を持ち上げ、洗浄ボトルを用いてふるいの下の領域を十分に洗浄します。この洗浄水も同様に分液漏斗に回収してください。沈殿操作の間、乾燥させるためにふるいを分離漏斗に載せたままにします。沈殿操作を開始するには、濾過した消化液を分離漏斗に入れ、Trichinella幼虫が漏斗の底部に沈殿するまで30分間保持します。沈殿が完了したら、分離漏斗のコックを全開にし、消化液を少なくとも20 milliliters、メスシリンダーに速やかに排出させます。次に、ストップコックを反対方向に完全に開き、消化液を10 mL通過させます。最後に、再びストップコックを反対方向に開き、さらに10 mLをメスシリンダーに流し入れます。幼虫を沈殿させるため、シリンダー内の消化液 40 mLを10分間静置します。未消化組織の量を測定します。沈殿漏斗から篩を取り出し、ペーパータオルで水分を拭き取ります。未消化組織を含む篩の重量から、ろ過前の篩の重量を差し引きます。ふるいの上に残る試料の重量が開始時の5%以下であれば、消化プロセスは十分であるとみなされます。未消化の組織量が5%を超える場合は、新しい筋肉試料を用いて消化を繰り返してください。新しい試料が入手できない場合は、残った材料を再度消化してください。消化液をシリンダーに入れて10分後、10 mLの沈殿物をかき乱さないように、ピペットで上清を30 mL吸引して取り出します。サンプル中の組織繊維の量を減らすため、沈殿物に30 mLの水道水を加え、さらに10分間放置します。液が透明になるまでこの洗浄を繰り返します。液体が透明になったら、上澄み液を取り除き、洗浄した10 millilitersの沈殿物を格子付きペトリ皿に移します。シリンダーを10 millilitersの水道水ですすぎ、その水を洗浄済み沈殿物に加えます。洗浄後、直ちに強度調節可能な下ステージ透過光照明を備えたトリキノスコープまたは実体顕微鏡を用いて、サンプルを観察します。15〜20倍の倍率で、ペトリ皿をグリッドごとに系統的に検査します。疑わしい構造物が見つからない場合は、見落とされた可能性があるTrichinella幼虫が皿の中心に集まるように、皿の中の液体を円を描くようにゆっくりと動かします。その後、検査を繰り返してください。疑わしい構造が見つかった場合は、倍率を40〜100倍に上げます。ピペットでディッシュからTrichinella幼虫を取り除き、容器に回収します。ディッシュ全体を検査した後、ディッシュを軽く振る操作から始めて、顕微鏡検査の手順を繰り返します。この手順を少なくとも3回、あるいは幼虫が見つからなくなるまで繰り返します。筋肉組織1gあたりの幼虫数を算出してください。消化液中の幼虫が多すぎて幼虫数を正確に決定できない場合は、幼虫を含む液体をメスシリンダーに戻します。シャーレを洗浄ボトルを用いて水道水ですすぎ、幼虫が底に沈殿するまで待ちます。10分間の沈殿後、メスシリンダーの底から幼虫を1 mLずつ新しいシリンダーに移し、消化液を規定量まで減少させます。激しく振とうして、幼虫を10 millilitersの中に均一に懸濁させます。振とうしながら、幼虫懸濁液を20 microlitersずつ12滴、ペトリ皿にピペットで分注します。各20-microliterの液滴を顕微鏡で観察し、テキストプロトコルに記載されている方法で幼虫の総数を算出します。Trichinella幼虫を顕微鏡で検査する前に、幼虫の同定を妨げる可能性のある不純物を除去するため、各サンプルを十分に洗浄することが重要である。Trichinella幼虫の全長は0.7から1.5 mm、幅は約0.3 mmである。食道は細く、末端はわずかに丸みを帯びている。スティコソーム（stichosome）は体腔の前半分にある構造で、45～55個の大きな細胞の列に囲まれた細長い管で構成されています。直腸はまた、突出部や付属器官のない円形をしています。消化後、感染力を持つ筋 larvae の形状は様々であるため、同定がより困難になります。典型的な形態には、強く巻いた状態や軽く巻いた状態で移動する幼虫、C字状の幼虫、または完全に直線状に伸びた幼虫が含まれます。筋肉の消化後には、Trichinellaの幼虫以外の構造物が見つかることがあります。イノシシにおける偶発的な所見の例としては、ミミズの剛毛状の毛、吸虫のAlaria alata、筋線維、Metastrongylus属の線虫、植物線維、および回虫Toxocaraの幼虫などが挙げられます。適切に行えば、この手法を習得した後は約2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、最も重要な管理点（クリティカルコントロールポイント）を考慮した、磁気スターラー法による肉中のTrichinella幼虫の検出方法について十分な理解を得ることができるはずです。

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Research

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Immunology and Infection

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