結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

この顕微手術技術の全体的な目標は、結腸直腸腫瘍細胞を盲腸壁に注入して、マウスに再現性のある転移性結腸直腸腫瘍を誘導することです。この方法は、循環腫瘍細胞生物学の分野における主要な質問に答えることができ、その主な利点は再現性が高く均一な腫瘍であり、信頼性の高いステージ予測と循環腫瘍細胞予測を可能にします。非外傷性鉗子を使用して、6〜8週齢の免疫不全マウスの盲腸を慎重に外部化することから始めます。

盲腸のブラインドエンドを腹部に配置して、ポーチが頭蓋を向けるようにします。盲腸内注射は、30ゲージのカネラを装着した標準的な1ミリリットルの注射器を装着し、マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクションポンプに腫瘍細胞を装填します。次に、非外傷性鉗子を使用して盲腸の先端を慎重につかみ、温かい生理食塩水で湿らせた2番目の鉗子を使用して、下向きのストロークで盲腸を優しく滑らかにします。

次に、動物を双眼手術用顕微鏡下で移動し、カネラを盲腸と直接平行にして盲腸の上にある状態で、2つの非外傷性鉗子を使用して、盲腸の外側の端の両端で組織を慎重に伸ばします。壁のベルト全体または漿膜を浸透点を超えて穿孔しないように注意しながら、盲腸をゆっくりとカネラの上に引っ張り、カネラを血管の上と壁のベルトの内側の薄い半透明の膜の下に置きます。カネラが所定の位置にあるとき、フットスイッチを使用して、20秒間にわたって20マイクロリットルの細胞を注入します。

薄い半透明の漿膜の内層の間、壁内血管と筋筋の上。すべての細胞が注入されたら、カネラを慎重に取り外し、盲腸の下にドライスワップを置きます。人工腹膜播種を防ぐために、漏れた細胞を徹底的な蒸留水ですすぎで溶解し、盲腸を腹腔に穏やかに戻します。

急速に吸収されるランニング縫合糸で腹壁を閉じ、外科的創傷クリップで皮膚を閉じます。次に、マウスを摂氏38度に設定された加熱マットの上に置き、完全に横臥するまで監視します。循環腫瘍細胞を単離するには、適切な実験エンドポイントで、15ミリリットルの円錐形チューブにチューブあたり5ミリリットルの密度勾配培地を満たし、腫瘍担体動物から収集した全血サンプルを密度勾配層に慎重に移します。

遠心分離により細胞を分離し、単核細胞を含む界面を慎重に回収します。単核細胞を新しい15ミリリットルチューブにピペットで移し、2回目の遠心分離を行います。続いてPBSでのチューブ洗浄。

2回目の洗浄後、ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、EDTAを添加し、各サンプルに4マイクロリットルの抗アンプキャンプ抗体を加えて、暗闇で氷上で20分間インキュベートします。次に、疎水性バリアペンを使用して、サンプルごとに1つの滅菌6センチメートルのペトリ皿に約1センチメートルの円を描き、各円に700マイクロリットルのピッキングバッファーを追加し、続いて50マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。顕微鏡を使用して細胞の密度を確認し、サンプルを約5分間沈殿させます。

次に、アンプキャンプ陽性の細胞滴をスクリーニングし、マイクロマニピュレーターを使用して目的の細胞を15マイクロリットルの適切なバッファーに移し、その後の目的のダウンストリーム分析を行います。このモデルで結腸直腸細胞を使用すると、腫瘍細胞注射後35日以内に、原発腫瘍のサイズが約10ミリメートルで、肝臓、肺の転移、および循環腫瘍細胞がほぼ常に存在するマウスが確実に増えます。さらに、循環腫瘍細胞は、下流の分析のために容易に単離することができます。

この技術を習得し、適切に実施すれば、10分以内に実施でき、治療研究と分子研究の両方に使用できる均一な転移性腫瘍の形成を促進します。このモデルの限界には、細胞溶解への依存性があり、これには独自の限界があり、マウスの免疫不全性も含まれており、これらはいずれも変異型結腸直腸癌細胞の使用によって克服できる。その単純さのために、このモデルはおそらく結腸直腸癌の現在利用可能なモデルへの貴重な補遺です。