研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

ビブラトームを用いた準備および切断。切断操作中に脳を固定するため、3つのアガロースブロックが必要です。コンタミネーションを避けるため、オートクレーブ滅菌済みの器具セットを使用してください。

アガーを除去します。フィルターペーパー上で乾燥させた後、医療用シアノアクリレート接着剤を用いて金属プレートに接着してください。スパチュラを使用して脳を取り出し、調製液を満たしたペトリ皿に慎重に配置します。

次に、ろ紙で脳を軽く乾燥させます。金属プレートを医療用シアノアクリレート接着剤で覆います。ピンセットとスパチュラを使用して、脳を標本ホルダー上の適切な位置に配置します。

事前に準備した2枚のアガーを使用して、両側から機械的に固定します。この時点で、脳をアガーブロックの横に配置し、さらに2つのブロックで固定して、スライス中の損傷を防ぎます。メタルプレートをビブラトームにセットし、組織を冷たい作製用培地で覆います。

その後、スライディングバイブラトームを用いて、組織を350 µm厚のOHSCで水平に切片化します。切断した切片は、壊れたパステールピペットの背面を用いて回収し、ペトリ皿に移します。脳切片は冷たい調製培地中に保持してください。

双眼顕微鏡を用いてスライスを光学的に評価します。15番のラウンドブレードを備えたメスを用いて、海馬領域を分離し、内皮質へと進入します。背側海馬と腹側海馬の間の海馬中央部から、細胞構築が維持されているスライスのみを採取することが重要です。

品質の低いOHSCは直ちに廃棄してください。得られたスライスを2〜3枚、孔径 0.4 µm の細胞培養インサートに移します。パスツールピペットを用いて、細胞培養インサートの上部から調製培地を吸引してください。

1ウェルあたり1mLの培地を入れた6ウェル培養プレートにインサートを設置します。6ウェルプレートを、5%CO2を含む完全加湿状態で35°Cでインキュベートし、2日ごとに細胞培養培地を交換します。ラット組織の場合は培養後6日、マウス組織の場合は14日後に、スライス工程自体に伴う炎症反応が消失します。

実験を開始できます。神経保護研究の代表的な結果を示します。画像Aは、いかなる処理も行わず、in vitroで9日間培養液中に保持した、対照切片として用いる非損傷のOHSCを示しています。

共焦点レーザー走査顕微鏡で確認したところ、対照群のOHSCでは良好な神経保存が認められました。Isolectin B4陽性のミクログリア細胞は主に分子層と網状層に局在し、分枝状の表現型を示していました。歯状回の顆粒細胞層では、Isolectin B4陽性のミクログリア細胞はごくわずかしか見られず、Propidium Iodide陽性の核は実質的に認められませんでした。

画像Bに示されているもう一組のOHSCを、培養液中で6日間維持した後、50 µMのNMDAを用いて4時間的に病変を誘導しました。その後、さらに3日間、培養液中で維持しました。NMDAによる病変誘導後、活性化したIsolectin B4陽性のミクログリア細胞が大量に蓄積し、歯状回の全層にわたって神経損傷部位に付着しました。

定量分析の結果、歯状回の顆粒細胞層において、病変を誘導したOHSCでは対照条件と比較してIsolectin B4陽性のミクログリア細胞数が多いことが明らかになりました。同様に、NMDAで病変を誘導したスライスでは、顆粒細胞層におけるPropidium Iodide陽性の変性ニューロン数が著しく増加していました。腫瘍浸潤研究のサンプル結果です。

すべての画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて撮影した、OHSCを用いた腫瘍浸潤SSの結果を示している。赤色はOHSCの細胞構築を、緑色は腫瘍細胞を示している。画像Aは、4日間の浸潤を許容したU138グリオーマ細胞の典型的な浸潤パターンを示している。

明確で球状の独立した腫瘍が観察され、OHSCの構造は維持されており、歯状回とアンモン角がはっきりと確認できます。画像Bは、LN229神経膠腫細胞によって4日後に形成された異なる浸潤パターンを示しています。この場合、OHSCの大部分を覆うネットワークが形成されているため、個々の腫瘍を明確に区別することはできませんが、歯状回とアンモン角に形態的な変化はなく、細胞構築は維持されています。

さらに、LN229細胞はU138細胞よりも浸潤性が高いと結論付けることができます。画像CおよびDは、浸潤から4日後のLN229細胞における同様の腫瘍浸潤の結果を示しています。左側では、腫瘍塊が視野のほぼ全体を覆っていることが観察されます。

画像Dは、対応するプロピジウムヨード染色を示しています。このスライドでは、Cornu Ammonisが見られなくなり、歯状回も歪んでいるため、細胞構築はもはや維持されていません。このような結果となった原因としては、実験開始時にOHSCが完全に無傷ではなかったこと、適用した腫瘍細胞数が多すぎたこと、あるいは浸潤時間が長すぎたために、観察された構造の消失を招いたことが考えられます。

したがって、このような浸潤結果は破棄すべきです。器官培養海馬スライス培養は、神経接続が維持されており、脳の生理学的特性を反映した非常に優れたin vitroモデルとなります。一つのモデルから複数のスライス培養を得ることができるため、一匹の動物の組織で複数の条件を検証することが可能であり、結果の再現性も非常に高いです。

高いアクセシビリティを持つため、臓器培養海馬スライスは、多種多様な実験タイプに非常に適しています。これには、電気生理学的研究や神経発生の研究だけでなく、神経保護、腫瘍浸潤、および腫瘍細胞と健全な脳組織との相互作用に関する実験も含まれます。