組換え α β γ Synucleins 携帯無料試金蛋白質ホスファターゼ 2 a 触媒サブユニット活性を刺激します。

組換えα、β、およびγシヌクレインは、セルフリーアッセイにおいてプロテインホスファターゼ2A触媒サブユニットの活性を刺激します。こんにちは、私はSovanarak Lekです。テキサス工科大学ヘルスサイエンスセンター・エルパソ、ポール・L・フォスター医学部の医学部生です。

このビデオでは、リコンビナント・シヌクレインタンパク質を用いたプロテインホスファターゼの2色比色アッセイについて実演します。バッファーおよび試薬の調製。p-ニトロフェノールリン酸バッファーの調製。

50 mLのpNPP緩衝液を調製するには、ビーカーに入れた25 mLの超純脱イオン水にTrizmaベースを溶解させます。清潔な撹拌子を加え、マグネチックスターラーに載せます。Trizmaが溶解後、撹拌を継続しながら塩化カルシウムを加えます。

pHを7.0に調整します。溶液をメスシリンダーに移します。超純脱イオン水を用いて、最終的な全量を50 mLにします。

マラカイトグリーン溶液の調製について。マラカイトグリーン溶液には、A、B、Cの3種類の溶液が必要です。溶液Aは4 M 塩酸です。溶液Bはモリブデン酸アンモニウムと溶液Aを混合したものです。溶液Cは0.045% マラカイトグリーンシュウ酸塩です。

溶液Dを調製するため、Bを1部、Cを3部の割合（1:3）で混合します。室温で1時間撹拌します。最後に、溶液Dを22 µmのメンブレンフィルターでろ過し、4 °Cで保存します。

遮光してください。アクチベーターの調製。アクチベーターは1% Tween 20溶液です。

10 µLのTween 20を990 µLの超純水にピペッティングします。Tween 20が完全に溶解するまでボルテックスミキサーで撹拌します。これでマラカイトグリーンとTween 20の作業溶液が調製されました。

溶液Dに活性化剤を1:100の比率で添加します。スレオニンリン酸化ペプチドを調製します。2 mMのpTストック溶液を調製するには、1 mgのpTに550 µLの超純脱イオン水を加えます。

リンコープペプチドが完全に溶解するまでボルテックスします。直ちに使用するために氷上に置きます。余分なpT分注液は−20 °Cで保存してください。

シヌクレインの調製。1 mgのシヌクレインを超純水に再懸濁し、最終濃度を1 mg/mLにする。緩やかにボルテックスして溶解させる。

直ちに使用し、未使用の分注試料は-80°Cで保存してください。リン酸標準液の調製。リン酸標準液のステップ1。

1 mM リン酸塩ストック溶液を調製するために、ビーカーにスターラーバーを入れ、超純脱イオン水にリン酸カリウムを溶解させます。メスシリンダーに移し、最終容量を100 mLに合わせます。これで10 mM溶液となります。

大型シリンジを用いて、溶液全体を22 µmフィルターでろ過します。これを1:100に希釈し、アッセイ標準試料として使用する1 mMリン酸溶液を調製します。リン酸標準試料ステップ2。

表に従って、適切な量のリン酸と超純脱イオン水を1.5 mlチューブに加えます。これにより、150、300、600、1,200、および2,400 pmolのリン酸を含むチューブが作成されます。分注した液は-20°Cで保存してください。

PP2A活性測定。氷上で1.5 mLチューブを用いてPP2Aアッセイを準備する。pNPP緩衝液を43 µL添加する。

1 µLのヒト組換えPP2Acを加えます。シヌクレインを加え、PP2AとシヌクレインをNutatorを用いて4 °Cで30分間インキュベートします。次に、16 µLの2 mM pTを加えます。

ウォーターバスを用いて30 °Cで10分間インキュベートします。フラットボトム96ウェルプレートに、各リン酸標準液25 µLを低濃度から高濃度の順にデュプリケートで添加します。同じ96ウェルプレートの標準液の隣に、各PP2Aアッセイ液24 µLをデュプリケートでピペッティングします。

Tween 20を含む溶液Dを75 µLずつ、各サンプルおよび標準液にピペットで分注します。MGTを添加すると、遊離リン酸が存在する場合、ウェルの色が変化します。光度分析を行います。

630ナノメートルに設定した分光光度計で分析します。代表的な結果です。ここでは、代表的なPP2Aアッセイと、標準曲線をに示すグラフを示します。

左側はリン酸標準液です。ウェルに含まれるリン酸量が多いほど、緑色の色が濃くなります。右側は、異なるモル濃度でα、β、またはγシヌクレインとともにインキュベートしたPP2Aです。

濃度が高いほど、PP2A触媒サブユニットの活性を刺激する効果が高くなりました。ここでは、α-シヌクレイン、β-シヌクレイン、およびγ-シヌクレインのさまざまな濃度に対するPP2A活性のグラフ表示を示します。α-シヌクレイン、β-シヌクレイン、およびγ-シヌクレインはすべて、1〜2 µMの濃度においてPP2A活性の有意な刺激剤となりました。

0.5 µMの濃度において、PP2A活性を有意に刺激したのはα-シヌクレインとβ-シヌクレインのみでした。図3は、マウス脳内におけるPP2Acと内因性シヌクレインの相互作用を示しています。Aでは、リコンビナントα、β、およびγ-シヌクレインをポジティブコントロールとして示しています。

Bにおいて、PP2Ac特異的抗体1D6を用いて共免疫沈降を行ったところ、PP2Acが回収され、さらに相当量の相互作用するα-synucleinも回収されましたが、β-synucleinはほとんど回収されませんでした。また、共免疫沈降においてPP2Acと共に回収されたγ-synucleinはありませんでした。この共免疫沈降データは、α-synucleinがin vivoにおけるPP2Acの内因性モジュレーターであることを示唆しています。

このビデオの制作にご協力いただいたすべての方々に感謝いたします。それでは、最後にこちらの方々をご紹介します。Ruth Perez、Sonavarak Lek。

ハビエル・バルガス。皆様の大きな成功を祈っております。それでは、ご武運を。