Name: 強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶCD11b磁気分離法で生後マウスから高純度ミクログリアを約30分で分離する手法。神経炎症のシグナル伝達機構を研究する神経科学の実験に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NS088206とES026892：この作品は、国立衛生研究所（NIH）補助金によってサポートされていました。 AKにAGKとディーンズ教授職にW.ユージンとリンダ・ロイド寄附も認めています。

動物やプロトコル手順の使用は、アイオワ州立大学（エイムズ、IA、USA）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、監督されました 1.混合グリア培養の成長<ol><li> 5.5インチのオペレーティングハサミで素早くの1- 2日齢の仔を刎ねる、そして氷上で50 mLチューブにすぐに頭を置きます。この断頭は、安楽死のモードであることに注意してください。 </li><li> 層流フードでは、頭蓋骨と4.5インチのストレートマイクロ解剖ハサミを使用して髄膜に小さな切開部を作ります。吻側端（鼻）に尾側端部から切断し始めます。断頭により形成された開口部を使用することによって皮膚の下に取得します。 <ol><li>切開をした後、側に半球の1を剥離。次いで、脳全体を除去するために、湾曲したまたはフックピンセットを使用します。 </li></ol></li><li> 0.25％トリプシンethylenediaminetetraacetを含む新しい50mLチューブ中脳（複数可）を浸し37℃の水浴中で15分間、酢酸（EDTA）を食べました。脳あたりトリプシンEDTAの2ミリリットルを使用してください。 </li><li>追加および除去することにより、新鮮な増殖培地（10％FBS、DMEM / F12、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム、および1％非必須アミノ酸）と脳（単数または複数）を洗浄メディア。この4倍を繰り返します。 </li><li>各脳のために、増殖培地を含有する2つのT-75フラスコにプレート。そのため、チューブに脳あたりの成長培地の2ミリリットルを追加します。したがって、T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mLに等しくなります。 </li><li> 最大から最小にするために、異なる開口サイズのピペットと脳（複数可）を粉砕することによりホモジナイズします。脳組織は、次のピペットへの遷移を小さくなっていないことが表示されている場合。粉砕の最後に、懸濁液は可視チャンクと、明らかです。 <ol><li> 25 mlピペット、5mLのピペット、次いで10mLのピペットを順次使用。 </li></ol></li><li>各homogを渡し単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通してenous脳サスペンション。 </li><li>各ホモジナイズ脳、ステップ1.5（T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mL）に記載されているように、増殖培地を含むプレート2つのT-75フラスコのために。 </li><li> 6日後に増殖培地を変更し、16日目に分離するまでに成長。 </li></ol>ミクログリア細胞の単離2 <ol><li> 16日後、フラスコから成長培地を除去し、新鮮な50mLチューブに入れ。各T-75フラスコに3mlの0.25％トリプシンEDTAを加えます。オービタルシェーカー上でRTで5分間フラスコを振ります。 <ol><li>遠心分離5分間0.4×gで除去し、増殖培地と後の工程でトリプシンEDTA反応を停止するために使用します。 </li></ol></li><li> 5分間振とうした後、トリプシンEDTA反応を停止させる（新鮮または2.1.1から使用される媒体）増殖培地を4mLの最小値を加えます。 </li><li>確実にするために粉砕すること、すべてのCellsは切り離されています。 </li><li>粉砕後、単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡す細胞計数を行い、次いで5分間0.4×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>すべての100×10 6個の細胞（約15×T-75フラスコ）のために、細胞ペレットを再懸濁するために推奨培地（2％FBS、DPBS（カルシウム及び塩化マグネシウムを含まない）、1mMのEDTA）1mLのを使用。 注：すべての次のステップは、1 mLの分離に合わせて調整されています。 </li><li> 、5mLのポリスチレンチューブに乗り推奨メディアの1 mLを加え、メニスカスをマーク。 2.5 mlまでの推奨メディアを追加しても、このマークを付けます。推奨メディアを捨て、5mLのポリスチレンチューブに再懸濁した細胞を移します。 </li><li>浮遊細胞のすべての1 mLのためのラット血清の50μLを追加します。 RTで5分間インキュベートします。 </li><li>これらのコンポーネントは、プロプライエタリである成分Aの25μLと成分Bを25μLを混合することにより選択カクテルを調製します。 </li><li> 50を追加1;細胞に選択カクテルL。 RTで5分間インキュベートします。 注：純粋な文化のために、繰り返しステップ2.9（推奨しますが、必須ではありません）。 </li><li> 45秒間ボルテックスマイクロスフェア。サンプルの1ミリリットルあたりのマイクロスフェアの80μLを追加します。 RTで3分間インキュベートします。 </li><li>推奨メディアを追加することにより、ポリスチレンチューブに2.5mLの体積をもたらします。 </li><li>室温で3分間磁石にチューブを入れてください。純度を高めるために、インキュベーションを調整します。ゆっくりと、まだポリスチレンチューブ中に磁石を15 mLのチューブに推奨メディアを注ぎます。 </li><li>手順を繰り返し2.12 3回。追加の磁気インキュベーションは、純度を高めるために行うことができます。 </li><li>増殖培地の3ミリリットルを追加し、細胞カウンターを用いて細胞の数を数えます。 </li><li>従って、ポリ-D-リジン（PDL）の治療のためにコーティングされたプレートにプレート細胞。 inPDL被覆プレートに播種した後、細胞を48時間処置します。これは、細胞が分離のストレスから回復することができます。 注：チェ以前に15記載のように免疫細胞化学を用いて培養の純度をCK。 </li><li>増殖培地中のT-75フラスコ中で、主にアストロサイトを含有する陰性画分を（15 mLチューブに回収）、プレート。 </li><li> 37℃のインキュベーター中でのインキュベーションの少なくとも6時間後、培地を変更し、それはO / Nを成長させ。治療のために次の日アストロサイトを分割します。 </li></ol>

<ol><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+from+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derive+from+progenitors%2C+originating+from+the+yolk+sac%2C+and+which+proliferate+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li>
<li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+new+roles+for+the+synaptic+stripper%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li>
<li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li>
<li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration%2C+through+a+mechanism+involving+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84(2011).</li>
<li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li>
<li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson%27s+Disease%3A+Foe+and+ally%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li>
<li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li>
<li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting%3A+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li>
<li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li>
<li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li>
<li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+epigenetic+regulation%2C+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

古いミクログリアの単離方法は、種々のタンパク質に適していない限られた回復を有するウェスタンブロットによって分析し、RNAは、定量RT-PCRにより解析します。差動付着および軽度のトリプシン処理の方法は、低ミクログリア収率13、14、15を有する2つの一般的なアプローチです。列ベースのCD11bのアプローチは、低い回収率を有しているが、差動付着および軽度トリプシン処理13、14、15、16、17を超える純度を達成します。独自のカラムフリーのCD11bアプローチは大幅タンパク質に適して、単離された収率を改善し、RNAは、例えば、ウェス...

ミクログリアのc-kit + / CD45-から分化中胚葉起源のMybの非依存常駐マクロファージは、卵黄嚢1,2の血島前駆細胞をerythromyeloidれます。発生学的ミクログリアは、中枢神経系（CNS）のコロニーを形成した後、それらは、分枝形態3にアメーバからの遷移します。そのダイナミックな波及効果は、潜在的な侮辱4のための健全な脳実質を探るため、これらの成人ミクログリアは、監視者として分類されています。ミクログリアのみCNS細胞集団の約10％に寄与するものの、お互いの中のタイルへの能力は実質4、5の最大スキャンを保証します。そのようなαシヌクレイン6,7およびアミロイドβ8、又はP等の危険関連分子パターン（DAMPS）そのようなリポ多糖（LPS）9としてathogen関連分子パターン（のPAMPs）は、古典的アメーバ様活性状態への復帰及び一酸化窒素の産生、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン1βによって特徴付けられる炎症反応を促進するミクログリアを活性化（IL-1β）、IL-6、IL-12、およびケモカインCCモチーフリガンド2 9、10、11。病原αシヌクレインを蓄積してきたパーキンソン病などの神経炎症条件において、神経変性サイクルをさらにミクログリア7の古典的な活性化を促進し、より凝集αシヌクレインを放出するドーパミン作動性ニューロンの死から作成されます。周辺のマクロファージと同様に、ミクログリアはそれらに強力を与える、あるいは抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10の存在下で活性化する能力をも有していてもよいです神経の修復を促進し、炎症2、11の減衰IAL。別にCNSにおける免疫学的役割から、ミクログリアは、開発中のシナプスを剪定することにより、神経回路の重要な調節因子として記載されています。例えば、Cx3cr1- KOマウスは、低密度ミクログリア及び樹状突起棘、未熟シナプス、及び後進CNS 12の電気パターンの過剰につながる減少シナプス剪定を有します。 CNSの恒常性にこれらの生理学的な複雑さとミクログリアの多様な機能的役割を理解することは、神経変性疾患を標的に治療薬を探索するために重要です。 神経免疫学の分野では、in vitroの実験が原因機構研究のための大きな可能性を非常に望ましい、低メンテナンスコスト、およびより少ない時間と労働集約的であるために。 Furthermo再、細胞集団を単離する能力は、所定の条件の下で、それらの標的細胞の機能性を描くことが重要です。多数のミクログリアの分離方法が存在するが、それらは幅広い実験13、14、15のために比較的高い数値と純度を得る能力によって制限されています。例えば、分化11B（のCD11b）のクラスタは、単球、マクロファージおよびミクログリア16の一般的な表面マーカーです。 CD11bを利用することによって、磁気分離の方法は、第一〜99.5％の純度および新生児脳17あたり〜1.6×10 6ミクログリアを得たカラムベースの手法として説明しました。我々の研究室では、最近、我々はフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートモノクローナル抗体のCD11bをタグ付けすることによってポリスチレンチューブ中で行わカラムフリーのCD11b磁気分離法15を 、開発しました。二重特異性secondaPEとPEおよびデキストラン複合体にRY抗体。一度結合し、デキストラン被覆磁性粒子は抗体複合体のデキストラン端に結合する、導入されます。最後に、ポリスチレンチューブは、ミクログリアを単離するための磁石内に配置されます。このアプローチは、新生児の脳当たりしかし〜97％までの純度を低下させるコストで〜3.2×10 6ミクログリアの収量を倍増しました。 本明細書において、我々は、迅速かつ精製カラムフリーのCD11b磁気分離プロトコル（ 図1）を実証します。 CD11bを磁気分離キットの価格は同じであるので、この改良された方法は、私たちの元の列フリー法と同様に実現可能なまま。終了時間は、細胞生存および収率を最大に重要であることができる半分に低減されます。注目すべきは、この最適化された方法により達成純度は〜&gt; 99％、当研究室が開発した15元の列のない方法で達成純度を超える顕著な改善です。最も重要なことは、CD11bを-PE光から離れるインキュベートする必要性を排除し、蛍光顕微鏡検査のために赤色チャネルの使用を可能にする、利用されません。最後に、元のCD11bの方法のように、高収率および高純度の星状細胞の画分は、この改良された方法で得られます。アストロサイトは、彼らの恒常性維持機能が病態生理学18との関係で不可欠であるという考えにつながる、CNSの中で最も多数のグリア細胞です。これらのグリア細胞は、神経膠に彼らの捜査の可能性を例示する、栄養サポートを提供し、血液脳関門を形成する神経伝達物質の恒常性の維持、傷害、神経保護に対応してグリアの傷を形成し、学習と記憶、および神経炎症などの多様な生理機能に役割を果たしています生物学19。ミクログリアとアストロサイトの形態と機能はG、共焦点顕微鏡、ウェスタンブロッティング、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を介して確認されていますriess亜硝酸塩アッセイ、およびルミネックス多重サイトカインアッセイ。このプロトコルにより提供される改良は、in vitroの実験のために重要であるすべては、ミクログリアやアストロサイトの純度、赤チャネルの利用可能性を持つ蛍光顕微鏡のより広範なアプリケーションに関連する自信を増加し、時間を節約できます提供しています。

<table><tbody><tr><td>EasySep CD11b Separation Kit II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Fisher</td><td>Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (DPBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたcd11b磁気分離

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

ミクログリアは、中枢神経系傷害への一次対応者です。しかし、多くの神経炎症の調節におけるその役割については不明のまま。ミクログリアは、炎症性ストレスを調査中で、マクロファージと同様に機能する中胚葉細胞です。古典（M1型）および代替（M2型）マクロファージの活性化にも良く、これらの表現型は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病などの神経炎症の状態で持っている根本的な相互作用を理解するための努力にミクログリアに拡張されました。 試験管内の実験では初代ミクログリアを利用生体内環境に拡張することができる迅速かつ信頼性の高い結果を提供しています。これはin vivoでの実験を超える明らかな利点ですが、最適な純度の十分な収量を達成しながら、ミクログリアを分離することが課題となっています。現在使用されている一般的な方法は、どちらかは、低回収率、低純度、またはその両方に苦しみます。ここで、我々はDEM時間の半分の量の高い細胞の回復と強化された純度を実現し、カラムフリーのCD11b磁気分離法の改善onstrate。私たちは、神経炎症および神経変性を研究する目的のための主要なミクログリアの分離の非常に有用なモデルとして、この最適化された方法を提案します。

ミクログリアはIIは、高純度を持っているのCD11b陽性選択キットを用いて単離し初代マウスミクログリアは、上述したプロトコルを用いて単離し、単離の純度を確認するために、ポリ-D-リジンでコーティングしたカバースリップ上に播種しました。十千個の細胞をウェルあたり播種し、免疫細胞化学分析は、単離されたミクログリアの純度を確認するためにアストロサイトのマーカーとして小膠細胞およびグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のマーカーとしてのイオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1）を用いて行きました。単離された培養物は、培養物が純粋ミクログリアた単離されたことを示唆し、GFAPの発現（ 図2A）なしIBA1を発現しました。この方法を使用して〜97％の純度を達成し、プライマリミクログリアの分離のための他の以前に発表された方法とは異なり、我々は半分の時間で〜&gt; 99％の純度を得ました。さらに番目の純度...

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

CD11b磁気マイクログリア分離の全体的な目的は、多目的なin vitro実験のために、出生後のマイクログリアを高純度かつ高収量で、比較的短時間で回収することです。本手法は、神経炎症に関連するシグナル伝達機序など、神経科学分野における重要な疑問の解明に寄与します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、純度、収量、生存率を損なうことなく、分離に約30分しかかからない点にあります。まず、斬首した直後の生後1〜2日のマウス幼マウスの頭部を、層流クリーンベンチに移します。次に、4.5インチのストレートマイクロ解剖用鋏を用い、斬首によってできた開口部に鋏先を挿入し、尾側から吻側に向かって切開して、頭蓋骨と髄膜に小さな切開を加えます。切開後、片側の半球を側方に剥離します。次に、湾曲またはフック状のピンセットを使用して、脳全体を取り出します。脳を2 mLの0.25% trypsin EDTAを含む50 mLチューブに移し、37 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。新鮮な増殖培地を加えて除去することで、脳を洗浄します。洗浄後、脳1つにつき2 mLの増殖培地を加え、脳を摩砕してホモジナイズします。脳組織が細かくなっていない場合は、より口径の小さいピペットに切り替えてください。摩砕の終わりに、懸濁液が透明になり塊が見えなくなったら、その懸濁液を70 µmのセルストレーナーに通して、単一細胞培養液を作成します。次に、8〜9 mLの増殖培地をT75フラスコに分注します（脳1つにつき2本のフラスコを使用）。各フラスコに1 mLの脳ホモジネートを添加します。16日目の単離まで細胞を培養します。16日後、フラスコから増殖培地を新しい50 mLチューブに移します。0.25% trypsin EDTAを3 mLずつ、各T75フラスコに加えます。次に、オービタルシェーカーを用いて室温で5分間、フラスコを振盪させます。その後、培養液を0.4 ×gで5分間遠心分離します。5分間振とうした後、トリプシンEDTA反応を停止させるために、遠心分離した培養液を最低4 mL加え、すべての細胞が確実に剥離するようにピペッティングを行います。次に、細胞を70 µmのセルストレイナーに通して、シングルセル懸濁液を作成します。細胞数を計測し、0.4 ×g で5分間遠心分離します。次に、5 mLのポリスチレンチューブを用意し、推奨培地を1 mL加えて液面をマークします。さらに推奨培地を2.5 mLまで加え、この液面も同様にマークします。その後、培地を除去し、ペレットを500 µLの推奨培地で再懸濁します。この混合液を5 mLのポリスチレンチューブに移し、1 mLの標線まで希釈します。次に、懸濁細胞1 mLあたり50 µLのラット血清を加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの間に、コンポーネントAを25 µLとコンポーネントBを25 µL混合して、セレクションカクテルを調製します。5分が経過した後、セレクションカクテルを50 µL細胞に添加し、さらに室温で5分間インキュベートします。マイクロスフェアを45秒間ボルテックスします。次に、サンプル1 mLあたり80 µLのマイクロスフェアを加え、室温で3分間インキュベートします。続いて、ポリスチレンチューブの2.5 mLの標線まで推奨培地を加えます。チューブを磁気ホルダーに設置し、室温で3分間静置します。インキュベーション後、磁石に設置したまま、培地を15 mLポリスチレンチューブにゆっくりと注ぎ出します。この磁気分離をさらに3回繰り返し、その都度、推奨される培地を2.5 mLの標線まで加えます。最後の磁気分離の後、3 mLの増殖培地を加え、細胞計数器を用いて細胞数を計測します。処理のために、細胞をポリ-D-リシンコートプレートに播種します。主にアストロサイトを含む15 mLチューブからの陰性画分を、T75フラスコに播種します。37°Cのインキュベーターで少なくとも6時間インキュベートした後、ネガティブ分画を含むフラスコのすべての培地を交換し、インキュベーターに戻します。この画像は、単離したミクログリア培養細胞の免疫細胞化学染色の結果であり、緑色チャンネルでミクログリアのマーカーであるIBAを、赤色チャンネルでアストロサイトのマーカーであるGFAPを検出しています。Hoechst染色は細胞核の存在を示しています。GFAP陽性細胞が存在しないことは、CD11bポジティブセレクションキットを用いて単離されたミクログリアにおいても、高い純度であることが示されています。単離したミクログリア培養物から得られたこれらの免疫ブロットタンパク質を、約51 kDaのバンドとして現れるGFAPと、約15 kDaのバンドとして現れるIBA1で検出しました。ローディングコントロールとしてベータアクチンを使用し、約42 kDaに検出されています。従来の分離キットの問題点は、ここに示されているように、レッドチャンネルでPE蛍光が観察されることでした。改良された手順では、こちらのレッドチャンネルに見られるように、磁気ビーズからの自己蛍光は発生しません。この手順で分離されたミクログリアは、シグナリング研究に使用することが可能です。ウェスタンブロット解析により、新たに改良した手法で単離したミクログリアからFynおよびリン酸化srcチロシンY416が検出できることが示されました。ミクログリア分離後の陰性分画にはアストロサイトが含まれており、シグナル伝達研究に使用可能です。ウェスタンブロッティングにより、この陰性分画にGFAP陽性細胞が含まれていることが示されています。ウェスタンブロット解析により、GFAP陽性細胞からFynおよびリン酸化srcチロシンY416が検出可能であることが示されています。この手順に続き、マルチチャンネル蛍光顕微鏡、ウェスタンブロット、定量PCRなどの他の手法を用いることで、遺伝子発現やタンパク質シグナリングに関する疑問を検討することができます。このビデオを視聴することで、マイクログリアの実験目的でこの迅速分離技術をどのように活用すべきかについて、十分に理解できるはずです。

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用してマウスの子犬の脳からミクログリアを含むCD11b細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。脳組織をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得ると、抗CD11b抗体でコーティングされたマイクロビーズとインキュベートした後、磁気カラムベースの分離によりCD11b+細胞集団を精製します。...

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

このビデオは、磁気細胞ソーティングを使用してマウス脳の脱髄病変からミクログリア細胞を抽出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、ミクログリア細胞を含む病変のある脳組織を解剖し、特定の酵素で組織を処理して単一細胞懸濁液を取得し、ミクログリア受容体特異的磁気ビーズを利用してミクログリア細胞を単離することを含みます。...

磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

ビデオは、新生児マウスの脳から細胞を分離して培養する方法を示しました。これには、脳の酵素的および機械的解離が含まれ、続いてニューロン成長因子を欠く成長培地で培養して、混合グリア集団が得られました。...

新生児マウス脳からの混合グリア細胞培養物の取得

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット...

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ...

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。...

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

学ぶCD11b磁気分離法で生後マウスから高純度ミクログリアを約30分で分離する手法。神経炎症のシグナル伝達機構を研究する神経科学の実験に応用可能です。

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

さらに動画を探す