強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

CD11b磁性ミクログリア単離の全体的な目標は、汎用性の高いin vitro実験の目的で、比較的短期間で出生後のミクログリアの高純度の終末収率を達成することです。この方法は、神経炎症に関連するシグナル伝達メカニズムなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法が現在利用可能な方法と比較した場合の主な利点は、単離が約30分で完了し、純度、収率、生存率を犠牲にしないことです。

生後1〜2日のマウスの子犬から斬首したばかりの頭を層流フードに移すことから始めます。次に、4.5インチのまっすぐなマイクロ解剖ハサミを使用して、斬首によって形成された開口部に先端を挿入し、尾側から吻側に切断することにより、頭蓋骨と髄膜に小さな切開を行います。切開後、半球の片方を横に剥がします。

次に、湾曲したピンセットまたはフック状のピンセットを使用して、脳全体を取り除きます。2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを含む50ミリリットルのチューブに脳を移し、摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。培地を追加したり取り除いたりして、新鮮な成長培地で脳を洗います。

洗浄終了後、脳ごとに2ミリリットルの成長培地を加え、脳を粉砕して均質化します。脳組織が小さくならない場合は、開口部が小さいピペットに移行します。トリチュレーションの最後に、懸濁液が透明で目に見えるチャンクがなくなったら、懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーに通して、単一細胞培養物を作製します。

次に、8〜9ミリリットルの成長培地をT75フラスコ(脳ごとに2つのフラスコ)にピペットで入れ、各フラスコにミリリットルの脳ホモジネートを追加します。16日目に単離されるまで細胞を増殖させます。16日後、増殖培地をフラスコから新鮮な50ミリリットルのチューブに移します。

各T75フラスコに0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルを追加します。.次に、眼窩シェーカーでフラスコを室温で5分間振とうします。増殖培地を0.4倍gで5分間遠心分離します。

5分間振とうした後、遠心分離した培地を最低4ミリリットル加えてトリプシンEDTA反応を停止し、すべての細胞が剥離していることを確認するために回転させます。次に、細胞を70マイクロモルの細胞ストレーナーに通して、単一細胞培養を作成します。細胞数をカウントし、gの0.4倍で5分間スピンダウンします。

次に、5ミリリットルのポリスチレンチューブを取り、推奨培地を1ミリリットル加え、半月板に印を付けます。2.5ミリリットルまでの推奨ミディアムを追加し、このメニスカスにも印を付けます。次に、培地を取り出し、ペレットを推奨される培地の500マイクロリットルに再懸濁します。

この混合物を5ミリリットルのポリスチレンチューブに移し、次に1ミリリットルのマークに希釈します。次に、懸濁細胞1ミリリットルごとに50マイクロリットルのラット血清を加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション中に、25マイクロリットルの成分Aと25マイクロリットルの成分Bを混合して選択カクテルを調製します.5分が経過したら、選択カクテルの50マイクロリットルを細胞に加え、室温でさらに5分間インキュベートします。

ミクロスフェアを45秒間ボルテックスします。次に、サンプル1ミリリットルあたり80マイクロリットルのマイクロスフェアを加え、室温で3分間インキュベートします。次に、ポリスチレンチューブの2.5ミリリットルマークまで推奨培地を追加します。

チューブを磁気ホルダーに室温で3分間入れます。インキュベーション後、磁石の中にある15ミリリットルのポリスチレンチューブに培地をゆっくりと注ぎます。磁気分離をさらに3回繰り返し、そのたびに推奨媒体を2.5ミリリットルマークまで追加します。

最後の磁気分離後、3ミリリットルの増殖培地を加え、セルカウンターを使用して細胞の数をカウントします。治療のためにポリD-リジンコーティングされたプレートに細胞をプレート化します。主に星状細胞を含む15ミリリットルのチューブからの負の画分をT75フラスコにプレートします。

摂氏37度のインキュベーターで少なくとも6時間のインキュベーションを行った後、インキュベーターに戻る前に、陰性画分を含むフラスコ内のすべての増殖培地を交換してください。この画像は、緑のチャネルのミクログリアのマーカーであるIBAと赤のチャネルのアストロサイトのマーカーであるGFAPをプローブした単離されたミクログリア培養の免疫細胞化学を示しています。ヘキスト染色により、細胞核の存在が明らかになります。

GFAP陽性細胞が存在しないことは、CD11b陽性選択キットを用いて単離されたミクログリアも高純度であることを示しています。単離されたミクログリア培養物から得られたこれらの免疫ブロットタンパク質について、GFAP(約51キロダルトンのバンドとして現れる)とIBA1(約15キロダルトンのバンドとして現れる)についてプローブしました。β-アクチンは負荷制御として使用され、約42キロダルトンで現れます。

古い単離キットの問題点は、ここに見られるように、赤チャネルでPE蛍光が観察されることでした。修正された手順では、ここの赤いチャネルに見られるように、磁気ビーズから自家蛍光は生成されません。この手順で単離したミクログリアは、シグナル伝達研究に使用することができます。

ウェスタンブロット分析により、新たに改良された方法で単離されたミクログリアからFynおよびphospho-srcチロシンY416を検出できることが示されました。ミクログリア分離からの負の画分には、シグナル伝達研究に使用できるアストロサイトが含まれています。ウェスタンブロッティングは、ネガティブフラクションにGFAP陽性細胞が含まれていることを示しています。

ウェスタンブロット解析により、GFAP陽性細胞からFynおよびphospho-srcチロシンY416を検出できることが示されています。この手順に続いて、マルチチャンネル蛍光顕微鏡法、ウェスタンブロッティング、定量PCRなどの他の方法を実行して、遺伝子発現とタンパク質シグナル伝達に関する質問に答えることができます。このビデオを見れば、この迅速分離技術をミクログリア実験の目的でどのように活用するかを十分に理解できるはずです。