Name: クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ逐次塩抽出法によるバルククロマチンへのタンパク質結合プロファイルの特性評価と、遺伝的・化学的・環境的操作による結合変化の評価手法。この迅速かつ低コストな方法は、エピジェネティック調節因子のクロマチン親和性を測定し、ChIPの代替として初心者にも利用可能です。

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癌のこの作品 V 学者賞 (V2014 ~ 004) と V 学者プラス賞 (D2016-030) V がん研究財団と、アメリカがん社会制度研究助成 (ACS IRG グラント 58 006 53) からパデュー大学中心に支えられ研究。E. g. p. は、Borch 大学院基金賞パデュー大学医薬品化学および分子薬理部によって支えられました。

1。 準備 0.5%、60 mM Tris pH 8.0、2 ミリメートルの EDTA、60 mM KCl <ol><li>準備 100 mL の低張性溶液バッファー a: 0.3 M ショ糖 NP 40。4 ° C でストア 。
	注: HEK293T など、いくつかの細胞溶解のより少なく厳しい条件が必要です。核は簡単に分離、変更バッファー a: 25 mM HEPES pH 7.6、25 mM KCl、5 mM MgCl 2、0.05 ミリメートルの EDTA、0.1 %np-40、および 10% グリセロールを使用します</li>。
	<li>2 x mRIPA ソリューションの 250 mL の原液を準備: 100 mM Tris pH 8.0、デオキシ コール酸ナトリウム NP-40、および 0.5% 2% します</li>。
	<li>5 M nacl 100 mL 原液を準備します</li>。
	<li>ごとに六つの塩の集中の 1 x mRIPA 溶液 50 mL を準備 2 x mRIPA と 5 M NaCl 水溶液を使用して: 0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM と 500 mM の NaCl。実験を開始する前に氷のすべてのソリューションをクールな</li>
	希望の条件の下で細胞の <li>成長します 。
	注: 蛋白質をノックダウンの効果を判断するには場合、ノックダウンのラインのための SSE は野生型細胞と比較する必要があります。これらの SSE は、サイド バイ サイド実行する必要があります。化学剤や刺激を使用しての例については、セクション 3-5 を参照してください</li>。
</ol> 2。基本的なシーケンシャル塩抽出 <ol><li>収穫 800 万セルそれぞれの条件し、5 mL の氷冷 PBS で 2 回洗って 。
	注: 同等のタンパク質濃度を持っている細胞の数と同じ数を持つことが重要です。セルの正確な数は、個々 のセルの行または特定の蛋白質のために最適化する必要があります。持っていることが重要だ、蛋白濃度の増加は平衡バインディングに依存して溶出曲線の観察を防ぐため、あまりにも多く。ただし、あまりにも少数の細胞とされない場合があります、曲線を検出する十分なタンパク質とクロマチン ペレットは困難に分離し、分数間に失われることができます</li>。
	<li>1 mL のバッファー A + プロテアーゼ阻害剤で細胞を再停止、1.5 mL のマイクロ遠心チューブ、および 4 ° C で 10 分間で下回転トップに転送</li>
	<li>は 4 ° C で 5 分間 6000 × g で遠心分離によって核を分離します 。
	注: この手順後核封筒まだそのままでなければなりません。ペレットが完全に中断されます再核封筒がそのままの場合ただし、封筒を分離するか、クロマチンが解放されると、ペレットは再度中断します。核封筒がない場合そのままバッファー A インキュベーション後、バッファー A の変更を使う</li>
	ペレットを再懸濁の前に核ペレットに <li>追加 200 μ mRIPA 0 mM NaCl + プロテアーゼ阻害剤。15 回を 1 mL ピペットでピペッティングによって各サンプルを均質化します。ペレットを容易に中断する再、戻それは厚さと粘着とピペットに困難なサンプルになると、核が溶解させます。 ただし。
	<ol>の先端に餌を描く、遠心分離機管の底面に対してピペット チップの端をタップするために <li>。一度、核からの DNA をリリース ピペッティングことが壊れますので、ペレットは完全に分解しない</li>
	</ol></li> <li>3 分の氷の上のすべてのサンプルをインキュベートすべての試料をホモジナイズ時 
	メモ: インキュベーション時間を興味の蛋白質によって最適化する必要があります</li>。
	<li>4 ° C で 6500 x g で 3 分のサンプルを遠心分離によって分離クロマチン ペレット</li>。
	<li>きれいな 1.5 mL 遠心分離機に転送清管。これは 0 mM 分数になります。この 0 mM mRIPA ソリューションの核溶解洗浄ステップとして機能およびクロマチンに関連付けられていない任意の緩やかな蛋白質を削除できます</li>。
	クロマチン ペレット ペレットを再懸濁の前に <li>を追加 200 μ L mRIPA 100 mM の NaCl + プロテアーゼの阻害剤。上下に 15 回ペレットをピペッティングによるクロマチン ペレットを分割します 。
	注: でペレット戻回数と一致する重要です</li>。
	<li>3 分間氷の上加温。この潜伏ステップにより、複数のサンプルがある場合、特に重要である平衡状態に到達するすべてのサンプル</li>。
	<li>6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します</li>。
	<li>は残りの塩濃度 2.6 2.10 を繰り返します 。
	注: 400 mM の NaCl 後、mRIPA ペレットべきはっきりと取れ、管の下部に滞在されません。ペレットを分離した上清中の遠心分離機管の蓋に配置できます</li>。
	<li>蛋白質のローディング x 4 の追加 70 μ L 各分画に染めるし、西部のしみの分析の SDS アクリルアミドゲルに各画分の 30 μ L をロードします 。
	注: 蛋白質の結合プロファイルを決定する、それが重要ライセート、ロードよりもむしろ等しい蛋白質濃度と同等のボリュームをロードします</li>。
	<li>膜に転送することによって標準的な西部のしみを実行し、興味の蛋白質の一次抗体を使用します</li>。
	<li>は、クロマチンから溶出する蛋白質を量的に表わすことでは、赤外蛍光 IRDye 二次抗体にしみと、撮像素子と画像のしみを孵化させなさい。開発の他のメソッドを使用できますが、お勧めします蛍光や赤外線撮像、自然の中より定量的である</li>。
	<li>使用 ImageJ または同様のソフトウェアごとの塩分濃度で溶出蛋白質に対する強度を計算します。塩分濃度に対するバンド強度をグラフ化、興味の蛋白質の溶出パターンを判定できます</li>。
</ol> 3。存在下で連続塩抽出、&#34; リーダー &#34; 阻害剤 <ol><li>細胞 (400 万) の 2 つのセットを収穫し、標準の SSE のように核を分離します</li>。
	<li>は再 mRIPA 0 mM の NaCl を 200 μ l 添加の両方のセットを中断し、3 分間インキュベートします。これは、核内蛋白質の除去のため、します</li>。
	<li>追加 200 μ L mRIPA 0 mM NaCl ペレット。コントロール セットに 1 つのサンプルと DMSO に阻害剤 (1 mm (+) JQ1 2 μ L) を追加します</li>。
	<li>撹拌機、ペレットで 15 回をピペッティングし氷上で 5 分間インキュベート</li>
	<li>6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します</li>。
	<li>すべての塩濃度に 3.3 4 を繰り返し、標準的な西部のしみを実行します</li>。
</ol> 4。逐次塩抽出の存在下、&#34; ライター &#34; 阻害剤 <ol><li>(10 μ M サハ) 阻害剤で細胞を治療または 3 h の DMSO</li>
	<li>各治療のため 400 万セルを収穫します</li>。
	<li>阻害剤のすべてのバッファーに追加でサンプルの標準 SSE を実行します</li>。
</ol> 5。シーケンシャル塩抽出次 DNA 損傷 <ol><li>1 のための 1 μ M ドキソルビシンとセルを扱う</li>
	<li>3 h を回復するようにしセル上のメディアを変更</li>
	<li>800 万セルを収穫し、基本的な SSE を実行します</li>。
</ol> 6。非逐次塩抽出 <ol><li>1200 万セルを収穫し、PBS で洗浄します</li>。
	<li>分割細胞マイクロ遠心チューブあたり 200 万セルが存在するようにします</li>。
	<li>再バッファー A の 500 μ L で中断し 10 分間インキュベート</li>
	<li>6000 x g に遠心分離によって核を分離</li>
	<li>MRIPA バッファー + 塩化ナトリウムの各 200 μ L でペレット再中断します</li>。
	<li>1 mL ピペット チップで 15 回のピペッティングによって各サンプルをホモジナイズしてください</li>。
	<li>氷上 3 分加温</li>
	<li>は、クロマチンを 6500 × g で遠心分離によって分離し、チューブをきれいに清を転送します。ローディングの染料の 70 μ L を追加し、西部のしみの分析のための SDS ページのゲルの 30 μ L を実行します</li>。
</ol>

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</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

塩の抽出でタンパク質とクロマチンの相互作用の評価は何十年も14,15; に採用されている一般的な方法ただし、それが最適化されていない体系的にする前に、フル ・ ユーティリィティを明らかにします。このフレームシーケンシャル方式が蛋白質または環境が変更されるとき、クロマチンの結合の変化を区別するために迅速かつ安価な方法を提供する方法を示します。SSE は高い適応性、最適化、および重要なは、それは技術的には簡単で、特殊な機器は必要ありません。開始する前に最適化する必要がある重要な側面は、: 細胞数、低張バッファー条件とインキュベーション時間を開始します。
細胞数の最も重要な側面は、すべてのサンプルとの間に整合性があることです。BAF 錯体を見るとき、; これらの複合体の連結方法の良いプロファイルを与える 800 万の細胞を用いたただし、セルの数 (またはバッファーの量) は興味の蛋白質の豊富さによって調整する必要があります。少ない細胞を用いた 400 mM と 500 m...

真核細胞における DNA の規制は、細胞内および細胞外刺激に対する応答を調整するタンパク質の品揃えによってしっかりと制御されている複雑で高度なシステムです。DNA がヒストン octamers フォーム ヌクレオソーム DNA に沿って分布やタイトなコイル1に圧縮する疎にラップされました。DNA とヒストンのこの構造の配置は、クロマチン、読み取り、書き込み、およびヒストン2ポスト並進変更 (PTM) を消去するタンパク質のネットワークによって規制されていると呼ばれます。アセチル化などいくつかのヒストン Ptm、ヒストンと DNA の2間の相互作用を変更することで、沈殿するアミノ酸の料金を変更します。また、ヒストン Ptm は転写制御因子、クロマチンの remodelers、DNA 損傷修復機構とゲノム3の特定の領域に DNA 複製機械を採用になります。
クロマチンの相互作用を研究するためのほとんどのメソッドは小規模な相互作用プローブまたは大規模なゲノムワイドな解析を含みます。結合試験体外はしばしば電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA)、等温滴定型熱量測定、蛍光偏光、ペプチド プルダウンなどのアッセイのヒストン ペプチドや DNA と個々 の遺伝子組換えドメインを利用します。これらの試金は通常個々 のタンパク質ドメインに焦点を当てる、彼らは、パズルの小さなピースの理解を容易にするが、多蛋白質の役割ではおろか、マルチ ドメイン蛋白質の共同の性質を理解する私たちを許可して複合体。ほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種合成による複雑さの別の層が追加されます。この蛋白質の不均一性クロマチン風景の動的な性質との組み合わせで難しく、体内へのバインド クロマチン蛋白質の相互作用クロマチン体外を要約します。
生体内での方法を行った進歩;ただし、彼らはしばしば高価な時間のかかる作業、技術的に困難です。4の大幅な最適化が必要ですしかし、クロマチン免疫沈降 (チップ seq) を配列することによって続いて、遺伝子、ヒストン修飾とタンパク質の局在を決定するため便利です。タンパク質が多い相互作用; を維持するクロマチンへの架橋しかし、これは人工の相互作用を作り出すことができる、5をマスキング エピトープを引き起こす可能性があります。さらに、特異性の高い抗体や DNA のせん断とチップ qPCR が頻繁に利用可能な事前既知のバインディングのサイトを使用して IP 条件の大規模な最適化 immunoprecipitations (IP) が必要です。チップの条件の最適化後、試料の加工は高価とシーケンス分析して数ヶ月に数週間が必要です。この方法は貴重なクロマチンの局在を特定するためゲノム、コストの間で蛋白質をバインドおよび時間のコミットメントでは、小さな変化が大域結合特性に与える影響についての仮説を生成するこのメソッドを使用する法外です.
本稿で我々 は逐次塩抽出 (SSE) 試金を使用してクロマチン結合蛋白質の大域結合プロファイルを確認し、蛋白質、複雑なまたはグローバル PTM のプロファイルに変更することができます相互作用を変更する方法を区別する方法について説明します。塩抽出の一般的に、広く使用されている手法ですが、この逐次法が高い再現性で汎用性の高い方法を示す.SSE の複雑なまたは単一のドメインも 1 つサブユニットが一括クロマチン複合体の全体的な親和性に貢献する方法を特徴付けることができます。蛋白質の結合はヒストン マーク ターゲット チップ seq と他のゲノム広い調査を使用して確認することができます興味深い仮説を提供するクロマチン環境の変化によって影響がかどうかを決定するため、SSE を使用もできます。
我々 はもともとこのメソッドから Wu et al., Polybromo1 の機能を調べるため、適応 (PBRM1) PBAF クロマチン remodeler6、7の結合に。この手法を使用すると、我々 は複雑な改造 PBAF クロマチン内クロマチンの結合のための PBRM1 の役割を決定、[この関数7六つの個人 bromodomains の相対的な寄与を決定します。
ここで化学剤によるクロマチンからタンパク質の変位を確認する似たようなクロマチン複合体の変更の相対結合親和性を評価するために、異なったセルタイプにクロマチンの結合を探索するこのメソッドを最適化する方法について説明し、クロマチンの風景に変更後のクロマチンの結合の効果を決定します。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム、結晶2.5 Kg AR(ACS)</td><td>Avantor / Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖、結晶500 G AR&uml;(ACSの)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、粒状 500 g AR&uml;(ACSの)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R)塩基、一次標準および緩衝液、>=99.9%(滴定)、結晶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA(エチレンジニトリロ)四酢酸、二ナトリウム塩、二水和物125 G AR(ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE、100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液溶液 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、6-水和物、結晶 500 g AR&uml;(ACSの)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール、1L</td><td>アムレスコ</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム塩、100g</td><td>アムレスコ</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ リサーチプラスピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5424 R 冷蔵微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>二次マウス IgG HRP リンク</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>二次ウサギIgG HRP結合</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1抗体</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1抗体</td><td>ベチル</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a抗体</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4抗体</td><td>ベチル</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>ケイマン・ケミカル・カンパニー</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>ケイマン・ケミカル・カンパニー</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン</td><td>AK サイエンティフィック</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>マクロン</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>ミニトランスブロットセル</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>ミニゲルタンク</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>PBS-T の 5% 溶液としてウェスタンブロットのブロッキング溶液として使用</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS ランニングバッファー (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder、10 to 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>メチルアルコール、無水マクロ</td><td>ン</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン kEDTA、1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム、250g UN1687</td><td>アムレスコ</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 500g UN1325</td><td>アムレスコ</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>グリシン、電気泳動用、>=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTopマイクロ遠心チューブ、ポリプロピレン</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L ピペット チップ</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris プレキャスト ゲル 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン ヘミスルフェート、5 MG</td><td>RPI 研究製品</td><td>22035-0.005</td><td>プロテアーゼ阻害剤溶液に使用されます。</td></tr><tr><td>アプロチニン、10 MG</td><td>RPI研究製品</td><td>20550-0.01</td>プロ<td>テアーゼ阻害剤溶液に使用されます。</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A、5 MG</td><td>RPI研究製品</td><td>30100-0.005</td>プロ<td>テアーゼ阻害剤溶液に使用されます。</td></tr><tr><td>OVCA429細胞</td><td>カレン・カウデン・ダール博士からの贈り物</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A 培地</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X)非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. 出典</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax Life</td><td>Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Powerソース</td>: <td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

クロマチン ターゲット蛋白質の結合特性の解明は、クロマチンの複雑な性質およびほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種の性質のために非常に挑戦することができます。これらのハードルを克服するために我々 は、クロマチン結合複合体の相対結合親和性を評価するためのシーケンシャル塩抽出 (SSE) アッセイを適応しています。結合 2 つ関連複合体、複合体サブユニットが失われたまたは個々 のドメインを無効にするとときの親和性の変化、変化の親和性の差を評価する非専門家によるこの簡単でわかりやすい分析を使用できます。親和性クロマチンの風景に変更しました。順番に塩の量を増やすことで一括クロマチン再懸濁、クロマチンから特定のタンパク質の溶出プロファイルできたら。これらのプロファイルを使用して、我々 はクロマチン修飾複合体の変化やクロマチン環境に変更が結合の相互作用に与える影響を確認することができます。他のin vitroとin vivoアッセイと SSE をカップリング、個々 のドメインとクロマチン環境の様々 な複合体の機能タンパク質の役割を判断できます。

本稿では、利点と我々 は文学6から適応している一般的に使用される連続塩抽出 (SSE) メソッドのアプリケーションを示しています。図 1ARID1a と PBRM1 の溶出パターンを検出することにより非連続的にタンパク質を抽出する SSE の再現性を比較する.一貫して、ARID1a、BAF サブユニットが 200 mM で主に塩化ナトリウムと PBRM1、排他的な PBAF サブユニットを示して、主に 300 mM の NaCl を示して遵守します。図 1 aは、800 万 OVCA429 細胞と SSE の 3 つの独立した複製を示しています。図 1 bは、200 万セルから分離した核が塩バッファーで再懸濁非シーケンシャル塩抽出を示しています。両方の方法を締結 ARID1a た 200 mm と 300 mM で PBRM1 を示して、SSE は...

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

段階的塩抽出法の全体的な目的は、バルククロマチンに対するタンパク質の結合プロファイルを特性化し、タンパク質またはその環境を操作した際に、その結合がどのように変化するかを評価することです。この手法では、エピジェネティック制御因子のクロマチンに対する相対的な親和性を測定し、遺伝的、化学的、および環境的な操作によってそれらの相互作用がどのように変化するかを評価できます。この技術の主な利点は、クロマチン結合タンパク質の結合プロファイルを評価するための、迅速かつ安価な方法であることです。クロマチン研究の分野に入ったばかりの方は、クロマチン免疫沈降（ChIP）に苦労することがよくあります。連続塩抽出法は、経験の浅い研究者であっても、ChIPと同様の多くの疑問に対する答えを得るために利用できる古くからある手法です。この手順を開始するには、目的の各細胞株から8,000,000個の細胞を回収してください。各細胞サンプルを氷冷PBS 5 mLで2回洗浄します。各サンプルをプロテアーゼ阻害剤を含む低張バッファー 1 mLで再懸濁します。細胞懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。懸濁液を4 °Cで10分間、上下に反転させて混合し、次いで同温度で6,000 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄します。マイクロピペットに1 mLチップを装着します。ペレットに、プロテアーゼ阻害剤を含む塩除去修飾RIPAバッファーを200 µL加えます。マイクロ遠心チューブの底にピペットチップを軽く当て、ペレットをチップ内に吸い上げます。ペレットを15回ピペッティングします。ペレットが崩れるにつれて、サンプルは粘り気のある濃厚な状態になります。各サンプルをこのように均質化し、氷上で3分間インキュベートします。その後、4°Cで6500 Gにて3分間遠心分離します。上清を清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。各ペレットに、100 mM塩化ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤を含む修飾RIPAバッファーを200 µL加えます。ピペットでペレットを15回吸い上げ、混ぜ合わせます。最初にペレットをピペットチップで吸引するのが難しい場合は、チューブの底でチップを軽く叩いてください。この操作を各サンプルに対して繰り返し、サンプルを氷上で3分間インキュベートします。その後、サンプルを4 °C、6500 Gで3分間遠心分離します。上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。塩化ナトリウム濃度を上げて調整したRIPAバッファー溶液を用いて、サンプルの抽出を継続します。ペレットがチューブの底に留まらなくなった場合は、上清を捨てる前に、ペレットを遠心チューブのキャップ内に移動させてください。連続塩抽出後、各サンプルの5つの上清分画それぞれに、4倍濃縮タンパク質ローディングダイを70ミリリットル加えます。各分画を30マイクロリットルずつSDSアクリルアミドゲルにロードします。タンパク質を膜に転写し、適切な一次抗体で染色することで、標準的なウェスタンブロッティングを行います。ブロットを赤外線染料標識の二次抗体でインキュベートし、ブロットをイメージングします。画像解析ソフトを用いて、各塩濃度におけるバンド強度を算出します。バンド強度を塩濃度に対してプロットし、目的タンパク質の溶出パターンを決定します。ARID1aおよびPolybromo 1タンパク質の段階的塩抽出（Sequential Salt Extraction）では、それぞれ200および300 millimolarの塩濃度で一貫した溶出が認められました。一方、同一タンパク質の非段階的塩抽出では、結果の一貫性が低くなりました。インキュベーション時間は、解析対象の各タンパク質に合わせて最適化する必要があります。したがって、SSEを用いて、インキュベーション時間を変化させた後の溶出プロファイルを検討した。転写活性化因子であるPolybromo 1は、3分間および10分間インキュベートした際に同様の溶出プロファイルを示した。BMI1で指標とした転写抑制因子であるPolycomb Repressive Complex 1は、クロマチンから放出されるまでに3分以上の時間を要した。溶出プロファイルの変化を調べることにより、タンパク質間相互作用を検討した。阻害剤が存在する場合、bromodomain containing protein fourは、阻害剤がない場合よりも低い塩濃度で溶出した。細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理した際、ヒストンのパターンに差異が観察され、クロマチンのランドスケープが変化した。細胞がゲノムストレスを受けた際のタンパク質結合の変化は、溶出プロファイルにも反映されていました。ここでは、溶出に必要な塩濃度の増加により、DoxorubicinによるDNA損傷後、Polybromo 1がクロマチンにより強固に結合することが示唆されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで2〜3時間で完了させることができます。この手順を試みる際は、各サンプルの取り扱いにおいて可能な限り一貫性を保つようにしてください。この手順は、クロマチン結合タンパク質のメカニズムと制御を解明するための研究の初期段階で利用でき、不必要なゲノムワイド研究に費やす時間とコストを削減することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。...

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

ゲノム標的分子の直接の標的を同定することは、主要な課題です。 DNA結合分子はゲノムを従事する方法を理解するために、我々は、クロマチン（COSMIC）を単離するための小分子の架橋に依存する方法を開発しました。...

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

MyoDは、多くの完全に分化した非筋肉細胞株の筋原性分化転換を誘導する強力な能力を持つ筋原性転写因子です。この分化転換に関与するエピジェネティックなメカニズムは、ほとんどわかっていません。ここでは、MyoDパートナーを網羅的に特性評価するためのダブルアフィニティー精製法とそれに続く質量分析法について説明します。...

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

ここでは、タンパク質-DNA相互作用の近塩基対分解能を達成するためのプロトコルを提示します。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP-exo)によって選択的に濃縮されたDNA断片のエキソヌクレアーゼ処理と、それに続くハイスループットシーケンシングによって得られます。...

ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 -  DNA相互作用を同定します

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

このプロトコルは出芽のイースト、Saccharomycesのcerevisiaeからの原産のchromatinの文脈の興味の単一コピー遺伝子座を浄化するために場所特定の組換えに基づいて位置特定のchromatinの隔離方法を示す。...

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

学ぶ逐次塩抽出法によるバルククロマチンへのタンパク質結合プロファイルの特性評価と、遺伝的・化学的・環境的操作による結合変化の評価手法。この迅速かつ低コストな方法は、エピジェネティック調節因子のクロマチン親和性を測定し、ChIPの代替として初心者にも利用可能です。

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

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