クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出
2017年10月2日
クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。
シーケンシャル塩抽出手順の全体的な目標は、バルククロマチンへのタンパク質結合プロファイルを特徴付け、タンパク質またはその環境が操作されたときに結合がどのように変化するかを評価することです。この方法は、エピジェネティックな調節因子とクロマチンの相対的な親和性を測定し、遺伝的、化学的、および環境的な操作によってそれらの相互作用がどのように変化するかを評価するために使用できます。この手法の主な利点は、クロマチン結合タンパク質の結合プロファイルを迅速かつ安価に評価できることです。
クロマチン分野に初めて足を踏み入れる人は、クロマチン免疫沈降法(ChIP)に苦労することがよくあります。シーケンシャルソルト抽出は、経験の浅い科学者でも同じ質問の多くに答えるために使用できる古い手法です。手順を開始するには、目的の各細胞株から8,000,000個の細胞を採取します。
各細胞サンプルを5ミリリットルの氷冷PBSで2回洗浄します。各サンプルと1ミリリットルの低張緩衝液をプロテアーゼ阻害剤と共に再懸濁します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
懸濁液を上から下まで 4 °C で 10 分間回転させ、次に懸濁液を 6 、 000 G の同じ温度で 5 分間遠心分離します。上清を捨てます。マイクロピペットに1ミリリットルの先端を装備します。
ペレットに200マイクロリットルの塩を含まない修飾リパバッファーとプロテアーゼ阻害剤を加えます。ピペットの先端を微量遠心チューブの底に軽くたたいて、ペレットを先端に引き込みます。ペレットを15回上下にピペットで動かします。
ペレットが砕けると、サンプルは厚くなり、粘着性になります。この方法で各サンプルを均質化し、サンプルを氷上で3分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏4度で6500Gで3分間遠心分離します。
上清をきれいな1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。各ペレットに、100ミリモルの塩化ナトリウムとプロテアーゼ阻害剤を含む200ミリリットルの修飾リパバッファーを追加します。ペレットを15回上下にピペットで動かします。
ペレットが最初はピペットチップに引き込むのが難しい場合は、チューブの底にあるチップを軽くたたきます。このプロセスを各サンプルに対して繰り返し、サンプルを氷上で3分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で6500Gで3分間遠心分離します。
上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。塩化ナトリウム濃度を上げながら、改質したリパ緩衝液にサンプルを抽出し続けます。ペレットがチューブの底に留まらなくなったら、上清をデカントする前に、ペレットを遠心分離管のキャップに入れます。
連続塩抽出後、各サンプルについて、5つの上清画分のそれぞれに70ミリリットルの4倍のタンパク質ローディング色素を加えます。各画分30マイクロリットルをSDSアクリルアミドゲルにロードします。標準的なウェスタンブロットでは、タンパク質をメンブレンに移し、適切な一次抗体で染色します。
ブロットを赤外線色素で標識した二次抗体でインキュベートし、ブロットをイメージングします。画像解析ソフトウェアを使用して、各塩濃度のバンド強度を計算します。塩濃度に対するバンド強度をプロットして、目的のタンパク質の溶出パターンを決定します。
タンパク質ARID1aおよびPolybromo 1の逐次塩抽出は、それぞれ200ミリモルおよび300ミリモルの塩濃度で一貫した溶出を示しました。同じタンパク質のノンシーケンシャル塩抽出では、一貫性の低い結果が示されました。インキュベーション時間は、検査するタンパク質ごとに最適化する必要があります。
したがって、SSEを使用して、さまざまなインキュベーション長後の溶出プロファイルを調べました。転写活性化因子であるPolybromo 1は、3分間および10分間インキュベートした場合、同様の溶出プロファイルを示しました。転写抑制因子であるPolycomb Repressive Complex 1は、BMI1で示され、クロマチンから放出されるのに3分以上を要した。
タンパク質間相互作用は、溶出プロファイルの変化を調べることにより調査しました。阻害剤の存在下では、タンパク質4を含有するブロモドメインは、阻害剤がない場合よりも低い塩濃度で言及した。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で細胞を処理した場合、ヒストンパターンの違いが観察され、クロマチンの風景が変化しました。
細胞がゲノムストレスを受けたときのタンパク質結合の変化は、溶出プロファイルにも反映されました。ここで、溶出に必要な塩濃度の増加は、ポリブロモ1がドキソルビシンによるDNA損傷後にクロマチンにより強く結合することを示唆しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜3時間で完了します。
この手順を試行する際は、各サンプルの処理にできるだけ一貫性を持たせることを忘れないでください。この手順は、クロマチン結合タンパク質のメカニズムと制御を解明するための研究の初期段階で使用できます。これにより、不要なゲノムワイドな研究にかかる時間と費用を節約できます。
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概要
逐次塩抽出法は、バルククロマチンへのタンパク質結合プロファイルを特性評価し、さまざまな操作によってこれらの結合がどのように変化するかを評価するために設計されています。この方法は、エピジェネティック制御因子のクロマチンに対する親和性を評価するのに特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- クロマチン生物学
- タンパク質相互作用
- エピジェネティクス
背景
- 逐次塩抽出法は、クロマチン結合タンパク質を研究するための手法です。
- これは、クロマチン免疫沈降（ChIP）に代わる、迅速でコスト効率の高い代替法となります。
- この手法は、経験の浅い研究者でも容易に実施可能です。
- 遺伝的、化学的、および環境的要因によってタンパク質の相互作用がどのように変化するかを評価することができます。
研究目的
- クロマチン結合タンパク質の結合プロファイルを特性評価すること。
- さまざまな操作がタンパク質結合に及ぼす影響を評価すること。
- クロマチン研究分野の研究者に簡便な手法を提供すること。
使用方法
- 目的の各細胞株から8,000,000個の細胞を回収する。
- クロマチン結合タンパク質を単離するための連続的な塩抽出を行う。
- タンパク質のクロマチンへの結合親和性を評価する。
- 異なる条件下における結合プロファイルの変化を評価する。
主な結果
- 本手法により、タンパク質の結合プロファイルを効果的に特性評価できます。
- 環境要因によって結合親和性がどのように変化するかを実証しています。
- 結果は、この手法が熟練した研究者と初心者の研究者の双方にとって有用であることを示しています。
- エピジェネティック調節因子とクロマチンの相互作用に関する知見を提供します。
結論
- 逐次塩抽出法（Sequential Salt Extraction）は、クロマチン相互作用を研究するための有用なツールです。
- この手法は効率的であり、さまざまな研究アプリケーションへの適用が可能です。
- これにより、クロマチン生物学におけるタンパク質結合ダイナミクスの理解が深まります。
よくある質問
産業界における重要性
連続塩抽出法（Sequential Salt Extraction: SSE）は、クロマチン結合タンパク質の親和性を迅速かつ費用対効果高く評価するための手法であり、エピジェネティクスに焦点を当てた創薬における初期段階のターゲットバリデーションを可能にします。遺伝的、化学的、または環境的な摂動がタンパク質とクロマチンの相互作用をどのように変化させるかを定量化することで、SSEはリソース集約的なアッセイに移行する前に、クロマチン修飾複合体のメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、直接的な結合効果と間接的な細胞応答を区別することにより、リード化合物同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：複合体のサブユニットが喪失したりドメインが不活性化したりした際の相対的な結合親和性の変化を測定し、クロマチン結合に対する個々のタンパク質の機能的な寄与を明らかにします。
- 科学的価値：塩濃度を段階的に上昇させた際の溶出パターンをプロファイルすることで、特異的なクロマチン結合と非特異的な結合を区別し、標的検証における偽陽性を低減します。
- 実用的価値：専門的なChIPの知識がない研究者でも定量的な結合データを生成することを可能にし、初期段階の仮説検証を加速させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：クロマチン景観の変化に対する化合物の影響をスクリーニングするための定量的なリードアウトとして機能する、再現性の高い溶出プロファイルを生成します。
- 運用の価値：標準的なウェスタンブロットの設備と画像解析を利用するため、ラボ間でのアッセイの標準化を促進し、技術的なばらつきを低減します。
- 運用の価値：基本的な遠心分離機と電気泳動装置のみで実施可能であり、エピジェネティック修飾因子のスクリーニング・カスケードへの導入障壁を下げます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：クロマチン環境の変化（例：HDAC阻害剤によるもの）とタンパク質結合の変化を関連付け、疾患関連システムにおけるバイオマーカーに沿ったメカニズム研究を支援する。
- 科学的価値：ゲノムストレス下（例：ドキソルビシン誘発DNA損傷）での結合の変化を評価し、病理生理学的条件下でのターゲットエンゲージメントの予測モデルに情報を提供する。
- 運用上の価値：発見段階から前臨床段階までのクロマチン相互作用の連続性について、直交的な検証を提供することで、細胞および生化学的アッセイを補完する。
パイプラインおよびワークフローの統合
SSEは、ターゲットバリデーションからリード最適化に至るディスカバリーの連続的なプロセスに組み込まれており、エピジェネティクスプログラムにおける生化学的な結合アッセイと細胞の表現型リードアウトとの間のメカニスティックな架け橋となります。
- 探索生物学： 複雑な改変がクロマチン結合にどのように影響するかを定量化することで、仮説検証を支援し、パスウェイの解明およびエピジェネティック標的の生物学的リスク低減を可能にする。
- スクリーニング： 塩濃度依存的な溶出プロファイルを定量的なアウトプットとして提供し、スクリーニングキャンペーン全体で化合物誘発性のクロマチン状態の変化を比較できるようにする。
- 分析： 塩濃度に対してプロットされたバンド強度データを生成し、構造活性相関の議論に寄与する算出可能な結合親和性の変化を提示する。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの結合変化を細胞内のクロマチンランドスケープの修飾へと結びつけ、機能的リードアウトと組み合わせることで、トランスレーショナルバイオマーカーとの整合性を支援する。
- エンタープライズ再利用： 複数のクロマチン標的に適用可能な標準化された低コストの機能であり、エピジェネティック創薬パイプラインにおけるプラットフォームの再利用を促進する。
運用および組織への影響
- 科学的価値：制御された塩溶出により、直接的なクロマチン結合と間接的な細胞内効果を区別することで、ターゲット検証における予測信頼性を向上させます。
- 運用の価値：汎用的な実験設備を用いて再現性のある定量的な結合プロファイルを提供し、チーム間での標準化を促進します。
- 戦略的価値：初期の結合評価における低スループットなChIPへの依存を減らし、初期のエピジェネティクスプロジェクトにおける資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：環境摂動に対する定量的な結合耐性に基づき、クロマチン修飾複合体ターゲットのリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 正確な溶出プロファイルの解釈を行うため、クロマチン生物化学およびウェスタンブロット定量に関する専門知識が必要です。
- 冷却遠心機、マイクロ遠心チューブ、および標準的なSDS-PAGE/ウェスタンブロット装置へのアクセスが必要です。
- サンプル間のばらつきを最小限に抑え、比較可能な塩抽出結果を得るために、標準化された細胞回収およびライシスプロトコルが必要です。
- クロマチン修飾複合体によって結合放出キネティクスが異なるため、各標的タンパク質に対するインキュベーション時間の最適化が必要です。
- 相対的な親和性の比較に限定されており、絶対的な結合定数を求めるには、検証のための直交的な生物物理学的手法が必要です。
