初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

iPS細胞由来のヒト脳オルガノイドを生成するための本プロトコルの全般的な目的は、ヒトの早期神経発達障害をモデル化することです。この手法は、新規神経新生におけるシンテソームや繊毛の役割、および原発性小頭症など、ヒトの脳発達分野における重要な疑問の解決に寄与します。本技術の主な利点は、患者のiPS細胞由来の脳オルガノイドから再現性のある結果を得ることができる、堅牢で迅速なモデルであることです。

本手順の実演は、ケルン分子医学センターの私の研究室のポストドクターであるElke Gabrielが行います。まず、滅菌済みハサミで先端をカットした2 mmのチップを装着した200 µLマイクロピペットを用いて、ニューロスフェアを回収します。次に、100 mLディッシュ内のパラフィンフィルム上に、ニューロスフェアを約5 mmの間隔で配置します。

そして、残っている培地をできる限り注意深く取り除きます。次に、個々のニューロスフィアにEHSマトリックスを1滴ずつ加えます。EHSマトリックスの滴とニューロスフィアを、37 degrees celsiusで15分間インキュベートします。

その後、ニューロスフィア培地で洗浄しながら、パラフィンフィルムからニューロスフィアを慎重に洗い出します。続いて、ニューロスフィアをさらに4日間培養し、2日目に新鮮なニューロスフィア培地を2 mL加えます。この手順では、各スピナーフラスコのサイドアームから脳オルガノイド培地を100 mLずつ加えます。

培地をインキュベーターにて37°Cで少なくとも20分間プレウォームさせます。次に、ニューロスフェアがすべて分離していることを確認してください。2つ以上のニューロスフェアがEHSマトリックスで結合している場合は、メスで結合部分のマトリックスを切断して分離させます。

攪拌プログラムを25 RPMに設定します。EHSマトリックスに埋入したニューロスフィアを、100 millilitersのオルガノイド培地が入ったスピナーフラスコに慎重に転移させます。その後、スピナーフラスコをインキュベーター内の磁気攪拌プラットフォーム上に配置し、37 degrees celsiusで14日間培養します。

これはオルガノイド培養の0日目です。週に一度、培地の半分を除去し、同量の新鮮な培地を添加して培地交換を行います。このステップでは、14日目に、あらかじめ先端を切断した1 mLマイクロピペットを用いて、スピナーフラスコ培養からオルガノイドを回収します。

それらすべてを60 mmディッシュに入れ、5 mLの温めたDMEM F12で3分間、1回洗浄します。その後、500 µLの温めた4% PFAを入れた1.5 mLチューブを用意します。各オルガノイドを個別のチューブに入れ、室温で30〜60分間固定します。

その後、接種ループを使用してオルガノイドを回収します。次に、PFAを除去し、1 mLのPBSで10分間ずつ2回、固定したオルガノイドを洗浄します。続いて、オルガノイドを1 mLのPBSに入れ、4 °Cで最大7日間保存し、以降の工程に使用します。

クリオセクショニング用にオルガノイドを埋没させるため、PBSを除去し、各チューブに30% sucrose溶液を1 milliliter加えて、凍結前にオルガノイドを脱水させます。sucrose溶液を加えた後、オルガノイドが表面に浮いている状態になります。オルガノイドをsucrose溶液に入れたまま、4°Cで一晩保存します。

翌日までに、オルガノイドはチューブの底に沈降しているはずです。その後、ビニール製標本型に OCT 化合物 400 milliliters を満たします。そして、接種ループを用いて、オルガノイドを型の中心に配置します。

モールドの縁にサンプル名を記入します。その後、オルガノイドを含むモールドを、凍結切片作成まで-80°Cで冷凍保存します。続いて、ガラス製凍結スライドを0.1% PLLおよびPBSでコーティングし、室温で5分間静置します。

その後、スライドを3時間乾燥させます。スライドを4 °Cで保存し、使用前に室温まで戻します。続いて、PLLコーティングされたガラス製クライオスライド上に、凍結固定したオルガノイドを20〜50 µmの厚さに切片化します。

切片を室温で1時間乾燥させ、次回の処理まで-80°Cで保存します。典型的なVZ（心室帯）と原始皮質板を示す凍結切片オルガノイドの免疫蛍光イメージング。VZは頂端側から基底側まで広がっています。

VZ内の細胞は、放射状グリア細胞であることを示唆する柵状の核配列を示していることに注目してください。右パネルは、VZ内のNestin陽性NPCおよび原始皮質板内のTUJ1陽性ニューロンの免疫蛍光染色を示しています。ここでは、PVIMおよびARL 13Bで染色されたVZの2つの例を示します。

白い四角で囲まれた領域を拡大して示しています。VZの頂端側で分裂している頂端放射状神経膠細胞はPVIM陽性です。後期にある細胞の分裂面は、ARL 13B染色によって示される腔表面線に対して水平です。

この手法に習熟すれば、適切に実施することで23日間で完了させることができます。この手順を行う際は、定期的に培養物の品質チェックおよびマイクロプラズマチェックを行うことが重要です。本手法の開発により、神経生物学の発達分野の研究者が、ヒト脳オルガノイドにおける神経発達のメカニズムを探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、細胞機能が低下した患者由来の細胞株を含む、さまざまなiPSC細胞株からヒト脳オルガノイドを作製する方法について、十分に理解することができます。