Name: 初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶiPSC由来ヒト脳オルガノイドの生成法。神経発達障害のモデリングに使用し、神経発生とミクロセファリーのメカニズム解明に貢献します。再現性の高い結果を迅速に得られるロバストな手法です。

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この作品は、フリッツ・ティッセン財団（Az.10.14.2.152）によってサポートされていました。私たちは、組織の埋め込み施設とCMMCの顕微鏡中核施設に感謝しています。私たちは、中心体および細胞骨格生物学研究所のメンバーが提供する議論と技術サポートのために感謝しています。私たちは、原稿を校正するために李明グーイに感謝します。

脳オルガノイドの1世代（23日） <ol><li> 神経外胚葉の開始（5日） 注：以下の点は、分化の開始前に検討すべきです。ヒトiPS細胞を得るための再プログラミング方法（lentiviral-、仙台ウィルス、エピソーム、またはマイクロRNAベースなど ） は 、理想的には、全ての患者に対して同じであるとのiPSCラインを制御しなければなりません。公開されたプロトコルに基づいて様々な再プログラミングキットおよび命令は15、16、17、18入手可能です。人間のiPSCラインの品質は、最適な分化を達成するための鍵です。顕微鏡でコロニー及び細胞形態をモニタし、そのようなのOct3 / 4、Nanogの、またはTRA-1-60のようなマーカーの発現を試験することによって多能性を検証します。 <ol><li>エンゲル・ホルム - スウォームで被覆された皿上の培地Aで無フィーダー条件下で培養ヒトiPS細胞（EHS）マトリックス。 注：定義された培養条件を維持し、分化の開始前に、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）を除去するための追加的なステップを避けるために、ヒトiPS細胞のフィーダーフリー、無血清を成長させます。ヒトiPS細胞のための最適な通過回数は、合計で通路70に再プログラミング時に通路15から分化範囲を開始します。継代する場合、新しい皿に凝集物を転写する低い機械的応力を有する適切な細胞剥離溶液と2-mLの血清学的ピペットを使用して集計細胞としてhiPSCコロニーを取り外します。これは、ほとんどのiPSCラインでの分化とアポトーシスを誘導する可能性があるとして、単一の細胞に解離を避けてください。これは、長期的な、単一細胞継代は、ヒトのiPS細胞19、20におけるゲノム変化を増加させることができることが報告されました。これはiPS細胞の全体的な生存率を低下させるように、剥離液を除去するための遠心分離工程を必要とする細胞剥離手順を避けます。テスト定期的に微生物汚染のためのすべての文化、特にマイコプラズマ、これはiPS細胞の品質とその分化能を変える可能性があるため。 <ol><li>コート製造者の説明書に従ってEHSマトリックスとの60mm組織培養皿。 </li><li> 1×10 6個のヒトiPS細胞のアリコートを解凍。 EHSマトリックスでコーティングされた60 mmの組織培養皿にiPS細胞を播種し、培地A（ 材料表を参照）の5 mLを含みます。細胞は〜80％コンフルエントに達したときに5〜7日後に毎日、メディアとの通路を変更します。 注：通路80％コンフルエントで融解性IPSCが少なくとも一度分化を開始する前に、そのようなコロニー21の酵素を含まない剥離などの標準的な方法を用いて。簡単に述べると、のiPSC培地を除去し、予め温めた37℃のダルベッコ変法イーグル培地で細胞を1回洗浄：栄養混合物のF12（DMEM / F12）、及び製造業者の次iPS細胞をインキュベート試薬A（材料の表を参照）を使用説明​​書。単一の細胞に解離を避けるために推奨されるインキュベーション時間を超えないようにしてください。ヒトiPS細胞は剥離し、凝集体としてではなく、単一細胞としてフローティングされるべきです。そして、彼らは新しいEHSマトリックスでコーティングされた皿に転送することができます。例えば、一つのiPSC 60-mmディッシュから凝集体は、4つの新しい60-mmディッシュに分配することができます。 </li><li>製造元の指示に従ってマイコプラズマ検出キットでマイコプラズマを確認してください。マイコプラズマは、iPS細胞の分化能を変更できるよう、唯一のマイコプラズマフリーのiPS細胞を使用してください。 </li></ol></li><li> iPS細胞（80％コンフルエント）を解離し、試薬Bを用いて、単一細胞懸濁液を調製<ol><li>予め温めた（37℃）DMEM / F12で一回性IPSCを洗います。 </li><li> CO 2予め温めておいた試薬B（ 例えば 60 mmディッシュに1 ml）を加え、37℃で5分間、iPS細胞をインキュベートし、5％。 </li><li>の側部および底部に指先でフリック20回iPS細胞を剥離する一品。顕微鏡下で細胞の剥離を確認してください。 </li><li> 1 mLのマイクロピペットで皿に上下に5回の細胞懸濁液をピペット。 </li><li>試薬Bの1ミリリットルを希釈し、15 mL遠心管中の細胞懸濁液を収集するために、媒体Aの3ミリリットルを加えます。 </li><li>穏やかに室温で4分間性IPSC（500 XG）をスピンダウン。 </li><li>媒体Bの1mLに細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器で細胞数を数えます。 注：再懸濁用培地のみBを使用して注意してください。それが分化を阻害可能性があるbFGFの高すぎる濃度を、含まれているとして、培地Aを使用しないでください。 </li></ol></li><li> 10μMのRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632）を添加した培地B 1ml当たり4.5×10 5細胞に細胞懸濁液を希釈します。 </li><li>非接着、V底96ウェルプレートにウェル当たり100μLを加えます。 注：ことを確認した細胞を均等にSUSに分散されています100μL部分を取り出す前に、チューブを毎回揺れによって年金。各ウェルのサイズ及び形状（円形、定義された面）に均一なニューロスフェアを得るために、同等の細胞数を含むべきであることが重要です。 </li><li>穏やかに3分間500×gで、室温で細胞をプレートをスピンダウンし、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li> 50μLを削除し、次の5日間、各ウェルに新鮮な培地Bの50μLを追加することにより、日々のメディアを変更します。 </li></ol></li></ol> EHSマトリックス2.埋め込みニューロスフェア（4日） <ol><li> （W /なし100（v / v）の補充2：1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1以下を混合することによってニューロスフィア培地を調製O）ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMの非必須アミノ酸（MEM）、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。 </li><li>ニューロスフェアのウィットを収集予め滅菌ハサミで切っ〜2mmのチップを用いて200μLマイクロピペットヘクタール。 </li><li>空の100mmの皿に約5mm離れたパラフィンフィルム（3×3 cm 2）を上の互いに神経球を配置し、慎重にできるだけ残り媒体のできるだけ多くを除去します。 </li><li>各単一のニューロスフェアにEHSマトリックスの低下（7μL）を加えます。 </li><li> EHSマトリックスはインキュベーターで15分間、ニューロスフェアとインキュベート低下します。 </li><li>ニューロスフィア培地でそれらをフラッシュすることによって慎重にパラフィンフィルムからニューロスフェアを洗います。フラッシュするために、1 mLのマイクロピペット及びニューロスフィア培地10mLを含有する新たな100 ム・ペトリ皿を使用します。 </li><li>次の4日間の神経球をインキュベートし、2日目に新鮮なニューロスフェア培地の2ミリリットルを追加します。 注：EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアは、皿の片側に集まってしまうしないようにインキュベータ内の棚が平らであることを確認してください。 </li></ol>ロータリーサスペンション3.オルガノイド文化（14日） <ol><li> 1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1：W / O 100（v / v）のサプリメント2以下を混合することにより脳オルガノイド培地を調製ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMのMEM、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、0.5μMドルソモルフィン、5μMSB431542、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。 </li><li>そのサイドアームを介して各スピナーフラスコに脳オルガノイド培地100mlを添加し、少なくとも20分間予備加温するための恒温器に置きます。 </li><li>製造元の指示に従って、25 rpmで攪拌しながらプログラムを設定します。 注：スピナーフラスコにEHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアを転送する前に、彼らはすべて分離されていることを確認してください。二つ以上がEHSマトリックスを介して接続されている場合は、メスと連結マトリックスを切断することによって、それらを分離します。 </li><li>注意深くオルガノイド培地100mlを含むスピナーフラスコにEHSマトリックス包埋ニューロスフェアを転送米国2mLの血清学的ピペットをする。フラスコ内の神経球を転送するためにスピナーフラスコの側の腕を使用してください。 </li><li> 37℃および5％CO 2インキュベーター中の磁気攪拌プラットフォーム上のスピナーフラスコを置きます。これは、オルガノイド文化の日0です。 </li><li> （またはより頻繁に色の変化があるとき）培地の半分を取り除き、新鮮な培地の同量を追加することでは週に1回の媒体を変更します。 注：インキュベーターのうち、スピナーフラスコを取った場合、オルガノイドは、フラスコの底まで沈むようにする3-5分待ちます。液体の表面上（ポンプに接続された）ガラスピペットチップを配置することによって培地を除去。フラスコの一方の側の開口部/アームを通して注意深く培地を吸引します。これらの操作は、層流フードの下に行われなければなりません。 </li></ol>脳オルガノイド4.分析<ol><li> オルガノイドの固定 <ol><li>スピナーフラスコ培養のwiの14日目にオルガノイドを収集カット1mLのマイクロピペット（カット約5 mm）の目。 60ミリメートル皿にそれらのすべてを入れて、3分間のウォームDMEM / F12 5mLで一度洗って。 </li><li>暖かい4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLと1.5mLのチューブを準備します。 注意：PFA固定液を取り扱う際の安全フードの下の皮膚や目の保護と仕事を着用してください。 </li><li>それぞれが別々に各チューブに室温で少なくとも30分間、それらを修正オルガノイド置きます。長くより60分オルガノイドを固定しないでください。オルガノイドを移動させるために、白金耳又は好都合である任意の他の工夫を使用します。 </li><li> PFAを除去し、PBS 1mLで10分間2回固定オルガノイドを洗います。 </li><li>さらに使用するまで、最大で7日間、4℃でPBS 1mL中オルガノイドを格納します。 </li></ol></li><li> 凍結切片のためのオルガノイドを埋め込み <ol><li> PBSを除去し、それらをcryofreezing前オルガノイドを脱水するチューブ当たり蒸留水の溶液中の30％ショ糖の1ミリリットルを加えます。 SUCROを追加した後SE溶液は、オルガノイドは表面に浮遊しなければなりません。 4°Cでのショ糖溶液中で一晩オルガノイドを保管してください。次の日で、オルガノイドは、チューブの底に沈んでダウンしている必要があります。 注：必要に応じてオルガノイドは、ショ糖溶液中で4℃で最長3〜5日間保存することができます。 </li><li>最適切断温度（OCT）化合物の400μLとビニル検体金型を満たすと、金型の中心にオルガノイドを配置するために白金耳を使用します。サンプル名を持つ金型のリムにラベルを付けます。 </li><li>凍結切片まで-80℃でオルガノイドを含む金型をフリーズします。 </li><li>室温で5分間、PBS中の0.1％ポリ-L-リジン溶液（PLL）を用いてコートガラスcryoslidesスライドを3時間乾燥させ。 4℃でスライドを保存し、使用前に温帯部屋にそれらをウォームアップ。 注：PLL-コーティング、それは離れて浮いからオルガノイドスライスを防ぐことができますよう、重要なステップです。最大3 4℃でPLL溶液を収集し、店舗数ヶ月。再使用する前に、0.22μmのシリンジでそれをフィルタリングし、室温までそれが暖かくてみましょう。 </li><li> PLLでコーティングされたガラス上に20~50ミクロンの厚さのスライスに区分cryofrozenのオルガノイド22を cryoslides。セクションで、スライドを室温で1時間乾燥させます。さらに処理するまで-80℃でセクションを保管してください。 </li></ol></li></ol>オルガノイドセクションの5.免疫染色注：ネスチン、神経前駆マーカー、およびTUJ1、汎神経マーカーで染色するオルガノイドの一般的な特性については、推奨されます。追加の例、有糸分裂の頂端放射状グリア細胞を標識ホスホ - ビメンチン（P-のVim）、及びArl13bと免疫蛍光染色として、繊毛のために、記載されています。アポトーシスをテストするには、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdTを）dUTPニック - 末端標識（TUNEL）アッセイを使用しています。ほこり、光から保護するためにインキュベーションの間にプラスチック製の箱にスライドを置き、そして乾燥。 <ol><li>室温で30分間スライドを解凍します。 </li><li> PFA誘発性自己蛍光をクエンチするために3分間PBS-グリシン（PBS中のグリシンの0.225グラム）の200μLで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 0.5％のTriton X100の200μL/室温で10分間PBS溶液中の0.1％Tweenで切片を透過性。 </li><li> 3分間PBS-グリシン溶液200μLで二回、それらを洗ってください。 </li><li>非特異的抗原結合をブロックするために室温で又は一晩4℃で1時間、PBS中の0.5％魚ゼラチンの200μL/ 0.1％トリトンX100でそれらをインキュベートします。 注：TUNELアッセイが必要な場合は、製造元のプロトコルに従ってアッセイを行います。それは二次抗体に干渉し、その後使用時のフルオロフォアを消光可能性があるとして、免疫染色を行う前に、TUNELアッセイを開始します。 </li><li> 、ネスチン1：以下の濃度でブロッキング溶液中の抗体を希釈する200。 P-Vimは、1：500。 TUJ1、1：200;Arl13b、1：20;および二次抗体、1：1,000。 </li><li>室温または4℃で一晩1-2時間、第一の一次抗体（ 例えば、ネスチン）の200μLとインキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液中で1,000〜室温で1~2時間、200μLでスライドをインキュベートする：最初の（抗マウス488）二次抗体1を希釈。これからは、常に光からスライドを保護します。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>室温または4℃で一晩1~2時間、次の一次抗体（ 例えば、TUJ1）の200μLとインキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>室温で1~2時間、次の二次抗体（抗ウサギ647）の200μLを加えます。 </li><li> 3×3分を洗います。ブロッキング溶液の200μLと。 </li><li> 30 nMの濃にて4&#39; の200μL、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を追加核染色のために室温で15分間PBSでentration。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで2×3分洗浄します。 </li><li>蒸留水200μLと、1×1分間洗浄し、明白な水滴がもはや表示されなくなるまでのセクションでは、10〜20分間乾燥させ。 </li><li>メディアを埋め込んでセクションをマウントします。彼らは数週間まで4℃で光から保護して保管してください。 </li><li>画像の顕微鏡分析オルガノイド、心室ゾーン、原始皮質板、及び関心の他の領域の概要を進めます。 </li><li> 1、10を使用する蛍光色素タグ化二次抗体に応じて選択63X油目的と蛍光フィルターを備えた共焦点顕微鏡を使用します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

MCPHは、in vivoまたはin vitroでの単純なヒト細胞培養アプローチに動物モデルで再現されることができない複雑なヒト神経発達障害です。 MCPHの臨床症状は、早期の神経発生が開始されると、最初の学期中に現れ始めます。このように、3D脳オルガノイドはMCPH開発をモデル化するための信頼性の高い実験系を表します。また、3Dヒト脳オルガノイドは重要なこと、iii）は、様々な分化I）は、それらが様々な遺伝的背景を有する患者サンプルのスペクトルの適応を可能にするが、II）は、異なる神経細胞型を含む組織の組織を表示するので、理想的なアプローチであり、そしてこのin vitro手法における神経発達の段階は、それらのインビボ対応物25、26、27に連結されています。例えば、ニューラルロゼットは、発展途上の神経と同等の構造でありますチューブ。 </p...

このよう小頭症など人間の神経発達障害は、不十分にしかによる人間の脳は、拡張された皮質表面、ヒト以外の動物は異なる独特の特徴を持っているという事実のために、動物モデルで研究することができます。 この局面は、 インビトロ細胞培養系では 、人間の脳の発達に十分に2Dで研究することができない複雑なプロセスになります。新興3D培養技術は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から組織様オルガノイドの生成を可能にします。 3D懸濁培養における多能性幹細胞のインビトロ分化は、組織化、層状組織1、2、3を生じさせる、タイムリーかつ領域特異的な様式で種々の細胞型を形成することができます。 3D培養技術を開拓し、幹細胞から始まる、器官形成の複雑さを詳解研究所のおかげで、私たちは、人間の脳の発達の初期事象を描写すると試験管 1、2、3 に小頭症をモデル化するために、脳のオルガノイドを生成する強力な方法を開発しました。我々がランカスターらによって開発されたオリジナルの方法を適応することを注目すべきです。脳オルガノイド1を生成します。この方法は、我々の実験の要件に応じて変更されました。 ガブリエルらから研究の目的。脳の発達中の神経幹細胞の維持の細胞および分子メカニズムを分析することでした。これを行うためには、機械的な研究は、小頭症患者4由来の3D脳オルガノイドにおける神経前駆細胞（NPCの）を分析することにより行いました。この患者はCPAP、中心体の生合成に必要な5保存された中心体タンパク質に変異を運びました。広く受け入れられているハイポ論文は、小頭は、NPCのプールの枯渇の結果であり、これは、細胞死または早期分化1、6、7、8、9のいずれかに起因するかもしれないということです。 小頭脳オルガノイドの心室ゾーン（VZS）を分析することによって、それはのNPCのかなりの数は、健康なドナー4に由来する脳オルガノイドは異なり、非対称細胞分裂を受けることが示されました。小頭脳オルガノイドの広範な顕微鏡および生化学的解析は、タイムリーな繊毛分解4におけるCPAPのための予想外の役割を明らかにしました。具体的には、突然変異したCPAPは遅繊毛の分解に関連しているとのNPC 4の早期分化につながる、再入細胞周期を遅らせました。これらの結果は、小頭と目における繊毛の役割を示唆します神経発生と脳のサイズ制御10時のEIR関与。 このプロトコルの最初の部分は、均質脳オルガノイドを生成するための三段階法の説明です。前に述べたように、オリジナルのランカスタープロトコルが適応と我々の目的1に合わせて変更されました。まず、人間性IPSCは、エンゲル・ホルム - スウォーム（EHS）マトリックス上に定義された無フィーダー条件で培養します。このステップは、フィーダ依存性多能性幹細胞培養物の変動を回避します。このプロトコルでは、神経上皮を形成するために神経分化の誘導性IPSCから直接始まります。胚様体（EB）形成工程、より制御および指向様式で神経分化進行をスキップし。このアプローチは、中胚葉および内胚葉のような他の胚細胞層の自発的および無向形成を制限します。このプロトコルを適用することにより、神経のロゼットを含むニューロスフェアは、EHのために5日目に収穫することができますS行列の埋め込み静止懸濁培養。我々のプロトコルの第三の工程のために使用オルガノイド媒体はドルソモルフィンおよびSB431542が補充されます。ドルソモルフィンは、骨形成タンパク質（BMP）の小分子阻害剤であり、SB431542はTGFβ/アクチビン/ノーダルシグナル伝達経路を阻害します。これらの要因の組み合わせが神経分化よりも効率的に単独で11、12、13、14、レチノイン酸を促進し得ます。 要するに、これらの修飾は、オルガノイドを横切る最小の変動で、脳オルガノイドの再現可能な生成を可能にします。重要なことは、この方法が確実に中心体および細胞周期のダイナミクスに影響を与える遺伝子の変異を運ぶ患者性IPSC、から小頭脳オルガノイドを生成するために適用されました。 このプロトコルの第2の部分は、BRを調製するための指示を与えます小頭内の細胞の欠陥の分析と解釈のためにAINのオルガノイド。これは固定、凍結切片、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡分析を含んでいます。このプロトコルは、期待される結果の詳細な説明とし、解釈のためのガイダンスを読者に提供します。

<table><tbody><tr><td>抗マウス 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>抗ウサギ 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPINシステム</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; 複数の供給者</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; 複数の供給者</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td></td><td>354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ、米国</td><td>G7765-250ML</td><td>ゼラチン冷水魚の皮から、複数のサプライヤー;オートクレーブPBSに添加して溶解し、滅菌し、4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&nbsp;</td></tr><tr><td>針付き接種ループ、使い捨て(1 & マイクロ;L)</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>BR452201-1000EA</td><td>複数サプライヤー&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td> <td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813、0500</td><td>4% PBS、溶液を-20°Cで保存。C;注意:皮膚と目の保護具を着用し、フードの下で作業してください&nbsp;</td></tr><tr><td>PBSタブレット</td><td>Gibco、米国</td><td>18912014</td><td>メーカー&acuteを参照してください。の指示;複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Poly-L-リジン溶液 (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>試薬 A&nbsp;</td><td>幹細胞技術</td><td>#05872</td><td>プロトコル1.1.1.2への注記;ReLSR(酵素フリーのヒトESおよびiPS細胞選択および継代試薬);Manufactorer&acuteに従ってください。のプロトコル;利用可能な複数のサプライヤーからの代替製品</td></tr><tr><td>試薬 B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutaseの解決は単一細胞の解離のための酵素の解決である;多数の供給者; プロトコル1.1.2 "enzymatic細胞解離の解決"&nbsp;</td></tr><tr><td>研究 クライオスタット ライカ CM3050 S</td><td>ライカバイオシステム</td><td>CM3050 S</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067 複数の</td><td>サプライヤー</td></tr><tr><td>スピナーフラスコ 250 mL</td><td>IBS インテグラ バイオサイエンス</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>スーパーフロスト ウルトラプラス 顕微鏡スライド</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>スライドには「+」と正の電荷を帯びたラベルを付ける必要があります</td></tr><tr><td>サプリメント 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 サプリメント (100x)</td></tr><tr><td>サプリメント 2 w/o ビタミン A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 サプリメント (50x), マイナスビタミン A; 複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物</td><td>さくら、NL</td><td>4583</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich、US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular</td><td>biology AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>複数サプライヤー</td></tr><tr><td>防水シート</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>パラフィルム」M&rdquo;;複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK阻害剤(Y-27632 2HCL);複数の供給業者</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-メルカプトエタノール(50 mM);複数の供給業者</td></tr></tbody></table>

初期の神経発達障害をモデル化するためのipsc由来のヒト脳オルガノイドの生成

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

複雑な人間の脳の発達を確実に表現できる適切なin vitroモデルの利用が制限されていることは、基本的な脳研究の臨床応用への翻訳を制限する重大なボトルネックです。人工多能性幹細胞(iPSC)が倫理的に問題のあるヒト胚性幹細胞に取って代わった一方で、iPS細胞を用いた神経細胞分化研究は、細胞レベルでは依然として記述的でありながら、複雑なヒト3D脳組織から得られる可能性のある詳細を適切に提供できていません。
このギャップは、複雑な人間の脳の発達の多くの特徴をモデル化するiPS細胞由来の3D脳オルガノイド「皿の中の脳」の適用によって埋められています。ここでは、iPS細胞由来の3D脳オルガノイドを作製する方法について説明する。このオルガノイドは、ヒトのまれな神経発達障害である常染色体劣性原発性小頭症(MCPH)のモデリングに役立ちます。MCPHにおける脳奇形の説明として広く受け入れられているのは、ヒトの脳発生の初期段階で神経幹細胞プールが枯渇することであり、これはin vitroで再現または証明するのが難しい発達上の欠陥です。
MCPHを研究するために、中心体タンパク質CPAPに変異を持つ患者由来の線維芽細胞からiPS細胞を生成しました。小頭症の3次元脳オルガノイドの心室領域を解析することで、神経前駆細胞の早期分化を明らかにしました。これらの3D脳オルガノイドは、神経毒性化学物質、神経栄養性ウイルス感染、または遺伝性遺伝子変異によって誘発される先天性脳疾患のモデリングに役立つ強力なin vitroシステムです。

脳オルガノイドの生成は、連続培養（ 図1A）の少なくとも三週間を要します。再現性のある結果を達成するために、我々は、研究者は、すべてのステップを文書化して、重要なのは、培地成分、時刻、およびセルの取り扱いに関するあらゆる変更を回避することをお勧めします。ここでは、重要なマイルストーンは、実験の終了時に十分な品質のオルガノイドを得るために達しているかどうかを評価する方法の概要を与えます。 96ウェルプレート中のニューロスフェアの形成は、前記神経球を各ウェル（ 図1B、ステップ1）の底部に同様に定義された球を認識することができる日からはっきりと見えるであるべきです。 5日目に、ニューロスフェアは、直径〜500μmであるべきであり、暗い中心を囲む明るいリムと、滑らかな表面を示します。すでに、神経ロゼットのような拡張STRUを観察することが可能であるかもしれませんこの明るいリム（ <stro...

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in vitroで小頭症をモデル化するための脳オルガノイドの堅牢な生成方法について説明します。

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

iPS細胞由来のヒト脳オルガノイドを生成するための本プロトコルの全般的な目的は、ヒトの早期神経発達障害をモデル化することです。この手法は、新規神経新生におけるシンテソームや繊毛の役割、および原発性小頭症など、ヒトの脳発達分野における重要な疑問の解決に寄与します。本技術の主な利点は、患者のiPS細胞由来の脳オルガノイドから再現性のある結果を得ることができる、堅牢で迅速なモデルであることです。本手順の実演は、ケルン分子医学センターの私の研究室のポストドクターであるElke Gabrielが行います。まず、滅菌済みハサミで先端をカットした2 mmのチップを装着した200 µLマイクロピペットを用いて、ニューロスフェアを回収します。次に、100 mLディッシュ内のパラフィンフィルム上に、ニューロスフェアを約5 mmの間隔で配置します。そして、残っている培地をできる限り注意深く取り除きます。次に、個々のニューロスフィアにEHSマトリックスを1滴ずつ加えます。EHSマトリックスの滴とニューロスフィアを、37 degrees celsiusで15分間インキュベートします。その後、ニューロスフィア培地で洗浄しながら、パラフィンフィルムからニューロスフィアを慎重に洗い出します。続いて、ニューロスフィアをさらに4日間培養し、2日目に新鮮なニューロスフィア培地を2 mL加えます。この手順では、各スピナーフラスコのサイドアームから脳オルガノイド培地を100 mLずつ加えます。培地をインキュベーターにて37°Cで少なくとも20分間プレウォームさせます。次に、ニューロスフェアがすべて分離していることを確認してください。2つ以上のニューロスフェアがEHSマトリックスで結合している場合は、メスで結合部分のマトリックスを切断して分離させます。攪拌プログラムを25 RPMに設定します。EHSマトリックスに埋入したニューロスフィアを、100 millilitersのオルガノイド培地が入ったスピナーフラスコに慎重に転移させます。その後、スピナーフラスコをインキュベーター内の磁気攪拌プラットフォーム上に配置し、37 degrees celsiusで14日間培養します。これはオルガノイド培養の0日目です。週に一度、培地の半分を除去し、同量の新鮮な培地を添加して培地交換を行います。このステップでは、14日目に、あらかじめ先端を切断した1 mLマイクロピペットを用いて、スピナーフラスコ培養からオルガノイドを回収します。それらすべてを60 mmディッシュに入れ、5 mLの温めたDMEM F12で3分間、1回洗浄します。その後、500 µLの温めた4% PFAを入れた1.5 mLチューブを用意します。各オルガノイドを個別のチューブに入れ、室温で30〜60分間固定します。その後、接種ループを使用してオルガノイドを回収します。次に、PFAを除去し、1 mLのPBSで10分間ずつ2回、固定したオルガノイドを洗浄します。続いて、オルガノイドを1 mLのPBSに入れ、4 °Cで最大7日間保存し、以降の工程に使用します。クリオセクショニング用にオルガノイドを埋没させるため、PBSを除去し、各チューブに30% sucrose溶液を1 milliliter加えて、凍結前にオルガノイドを脱水させます。sucrose溶液を加えた後、オルガノイドが表面に浮いている状態になります。オルガノイドをsucrose溶液に入れたまま、4°Cで一晩保存します。翌日までに、オルガノイドはチューブの底に沈降しているはずです。その後、ビニール製標本型に OCT 化合物 400 milliliters を満たします。そして、接種ループを用いて、オルガノイドを型の中心に配置します。モールドの縁にサンプル名を記入します。その後、オルガノイドを含むモールドを、凍結切片作成まで-80°Cで冷凍保存します。続いて、ガラス製凍結スライドを0.1% PLLおよびPBSでコーティングし、室温で5分間静置します。その後、スライドを3時間乾燥させます。スライドを4 °Cで保存し、使用前に室温まで戻します。続いて、PLLコーティングされたガラス製クライオスライド上に、凍結固定したオルガノイドを20〜50 µmの厚さに切片化します。切片を室温で1時間乾燥させ、次回の処理まで-80°Cで保存します。典型的なVZ（心室帯）と原始皮質板を示す凍結切片オルガノイドの免疫蛍光イメージング。VZは頂端側から基底側まで広がっています。VZ内の細胞は、放射状グリア細胞であることを示唆する柵状の核配列を示していることに注目してください。右パネルは、VZ内のNestin陽性NPCおよび原始皮質板内のTUJ1陽性ニューロンの免疫蛍光染色を示しています。ここでは、PVIMおよびARL 13Bで染色されたVZの2つの例を示します。白い四角で囲まれた領域を拡大して示しています。VZの頂端側で分裂している頂端放射状神経膠細胞はPVIM陽性です。後期にある細胞の分裂面は、ARL 13B染色によって示される腔表面線に対して水平です。この手法に習熟すれば、適切に実施することで23日間で完了させることができます。この手順を行う際は、定期的に培養物の品質チェックおよびマイクロプラズマチェックを行うことが重要です。本手法の開発により、神経生物学の発達分野の研究者が、ヒト脳オルガノイドにおける神経発達のメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、細胞機能が低下した患者由来の細胞株を含む、さまざまなiPSC細胞株からヒト脳オルガノイドを作製する方法について、十分に理解することができます。

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、人工多能性幹細胞からヒトの脳オルガノイドを生成する方法を示しています。これは、ニューロスフェアが神経外胚葉層を形成し、それが他の胚葉の形成を抑制する方法を示しています。ニューロスフェアは3Dゲルマトリックスに埋め込まれ、ニューロ上皮芽を形成します。オルガノイド培地とインキュベートすると、これらの神経上皮芽は特定の脳領域に分化し、成熟した脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト脳オルガノイドを作製するためのIn Vitro法

このビデオでは、人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するアッセイを実演しています。ヒトiPS細胞は、胚様体(EB)を形成するように誘導されます。EBは、誘導媒体を使用してポリマー足場上で培養され、神経幹細胞、前駆細胞、未成熟ニューロンへの分化を促進します。最後に、EBはマトリックスに埋め込まれ、脳オルガノイド形成のための維持培地に移されます。...

人工多能性幹細胞由来脳オルガノイドの作製

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。...

ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。...

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC...

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

学ぶiPSC由来ヒト脳オルガノイドの生成法。神経発達障害のモデリングに使用し、神経発生とミクロセファリーのメカニズム解明に貢献します。再現性の高い結果を迅速に得られるロバストな手法です。

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

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