電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

この手順の全体的な目標は、電気刺激における制御された三次元細胞培養法を利用して、ヒト胚性および人工多能性幹細胞由来の心筋細胞の成熟を促進することです。この方法は、さまざまな電気刺激パラメータや時間の長さが心臓細胞の機能や成熟状態にどのように影響するかなど、心臓組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。最終結果は、成熟度が向上した人工のヒト心臓組織です。

この手法の意味するところは、電気的進行などの成熟した特性を持つ心筋細胞が、薬物スクリーニング研究においてヒト心臓細胞のより正確なモデルとして機能する可能性が最も高いため、新薬の安全性と有効性の試験などの診断用途にまで及びます。PDMSモノマーと硬化剤を10:1の比率で組み合わせ、よく混合します。5分間置いてからガスを抜きます。

次に、Biowireテンプレートのマスターが入ったペトリ皿にPDMS混合物をロードします。気泡の形成を最小限に抑えるようにしてください。次に、PDMSを摂氏70度で2時間硬化させます。

次に、固化した金型を最初に鋭利な刃で端に付け、次に剥がして回収します。次に、余分なPDMSをトリミングし、すべてのテンプレートを滅菌ポーチに集めます。スチームオートクレーブは、121°Cで20分間テンプレートをクレーブします。

そして、バイオセーフティキャビネットの換気の下で、各テンプレートを滅菌ペトリ皿にロードします。次に、各テンプレートについて、ピンセットを使用して、滅菌済みの6.0シルク縫合糸をチャネル全体に広がる溝に取り付けます。その後、テンプレートはセルシーディングの準備が整いました。

縫合糸は、心筋線維の形状を模倣して縫合軸に沿って整列する 3D コンストラクトの形成のためのテンプレートとして機能します。各チャンバーについて、電気刺激チャンバーのフレームとして機能する長方形のポリカーボネート片を一対作成します。各ピースの中心線に沿って、幅3mmの穴を2cm間隔で2つ開けます。

各チャンバーには、長さ1.5センチメートルのカーボンロッドを2本用意します。各ロッドの端から約3ミリメートルのところに、幅1ミリメートルの穴を開けます。次に、各穴にプラチナ線を通し、ワイヤーの一方の端をロッドに巻き付けます。

次に、各チャンバーについて、2つのポリカーボネート片の間に2本のロッドを挿入し、フレームを作ります。次に、約2ミリリットルのPDMSを6ウェルプレートのウェルに注ぎ、フレームをPDMSの入ったウェルに入れ、フレームの底を沈めます。PDMSを摂氏70度で2時間硬化させ、PDMSがフレームを固定します。

次に、PDMSを取り付けたプレートから完成したチャンバーを取り外します。組み立てられたチャンバーの機能をテストするには、プラチナ線をバッテリーに接続し、電圧計を使用して電気がロッドを通過していることを確認します。次に、機能チャンバーを滅菌ポーチに移し、摂氏121度で20分間の蒸気滅菌を使用して、細胞培養の準備をします。

ゲルを調製するには、すべてのゲル成分を氷上で予冷してから、滅菌チューブで混合します。最後にコラーゲンと細胞外マトリックスを添加し、ピペッティングで成分を混合してください。細胞は、ヒト多能性幹細胞から分化した心筋細胞を持っています。

細胞を採取し、各バイオワイヤー調製プラントについて、50万個の細胞を含む3.5マイクロリットルのコラーゲンゲルを調製します。次に、P10ピペットチップを使用して、各ディッシュの0.5センチメートルの長さのチャネルテンプレートに約4ミリリットルの懸濁液をロードします。必要に応じて滅菌鉗子を使用して縫合糸の位置を調整し、縫合糸が完全に伸びるようにします。

細胞を播種したら、一貫した結果を得るために、オートクレーブを服用する前に必ずゲル細胞混合物を再懸濁してください。チャネルをロードした後、ゲルに触れないように注意しながら、皿の底を滅菌PBSで覆います。これにより、重合中にバイオワイヤーが脱水しなくなります。

バイオワイヤーを摂氏37度で30分間インキュベートした後、PBSを細胞を覆うのに十分な培地と交換します。通常は12ミリリットルで十分です。その後、1週間料理を培養し、1日おきに培地を交換します。

バイオセーフティキャビネットに、電気刺激装置チャンバーを収容する6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルのPBSを追加します。次に、滅菌ピンセットを使用して、オートクレーブデバイスをウェルにそっと配置します。所定の位置になったら、PBSを廃棄し、カーボンロッドを完全に覆うはずの5ミリリットルの温かい媒体と交換します。

細胞を24時間培養する前に、電気刺激に反応した心筋細胞の収縮性を観察し、細胞が電気刺激を捕捉し、収縮で応答していることを確認します。次に、バイオワイヤーを電気刺激装置チャンバーに配置し、チャネルをカーボンロッドに対して垂直に向けます。プラチナ線をプレートから離して伸ばし、プレートを覆います。

ワイヤーを電気刺激装置に接続します。刺激装置を、1ヘルツと3ボルト/センチメートルで二相性1ミリ秒のパルスを送達するように設定します。次に、電気刺激装置内の製剤を摂氏37度のインキュベーターに移します。

刺激速度を 0 日目の 1 ヘルツから 6 日目の 6 ヘルツまで、24 時間ごとに段階的に増やします。この文化の週の間、一日おきに媒体を変えてください。そして、心筋細胞の収縮性を日常的に観察します。

バイオワイヤーでの7日間の予備培養後、細胞は縫合糸の周りのゲルを再形成しました。細胞は縫合糸の軸に沿って組み立てられ、整列した心臓組織を形成します。発現した心臓収縮性タンパク質を発現した細胞は、収縮装置に肉腫の縞模様を示し、それらの筋原線維は縫合糸の軸に沿って整列していました。

バイオワイヤー内の細胞は、胚様体内の細胞よりも低い増殖速度を示しました。カルシウムの取り扱いは、バイオワイヤーで培養した心筋細胞で有意に改善されました。カフェインによる治療は、仙骨小胞体からのカルシウムの突然の放出を誘発しました。

このような過渡現象は、刺激された細胞にのみ見られました。また、カルシウムの放出振幅によっては、刺激頻度が有意に高かった。さらに、バイオワイヤーで培養した心筋細胞は、電気刺激によってさらに増強された胚体での培養と比較して、hERGおよび内向き整流器の電流密度が改善されました。

改善された内向き整流器電流は、カリウム内向き整流チャネルジーンズ、KCN J2の発現増加と一致していました。自発的に鼓動する能力である自動性は、制御されたバイオワイヤーと比較して、胚体由来の心筋細胞で有意に高かった。コントロールは、6ヘルツレジメンにかけられたバイオワイヤー調製に匹敵する自動性を示しました。一度マスターすれば、バイオワイヤーのセットアップは半日で完了します。

電気刺激のセットアップには数時間かかり、最終結果は2週間で到達できます。この手順を試みる際には、異なる細胞株から分化した、または異なるプロトコルによって分化した心筋細胞は、その成熟度と純度がわずかに異なる可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、細胞への刺激速度などの実験パラメータの最適化が必要になる場合があります。

この手順に続いて、細胞組成の変動や変異型心筋細胞の利用など、他の条件を最適化して、追加の質問に答えることができます。