Name: 電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぼう、電気刺激を用いた3次元培養法でヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を成熟させる方法。Biowiresプラットフォームは、薬剤スクリーニングのためのより正確な心臓モデル構築に貢献します。

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この作品は、費補助金のハートからでサポートされているとされたストロークカナダ（G-14から0006265）の財団、ヘルスリサーチ（137352と143066）、およびJP Bickell財団助成金のカナダの研究所からの運営費交付金（1013821 ）SSNへ。

1.マスターデザインと製作注：デバイス製造にソフトリソグラフィを使用してください。ポリジメチルシロキサン（PDMS）成形用の2層SU-8マスターを作成します。 <ol><li>設計と製図ソフトウェアを使用してデバイスを設計します（ 図1A 、左）。マスターの各レイヤーを個別に描画します。マスタ15の 2つのレイヤに対応する2つのフォトマスク（20,000 dpi）にデバイスデザインを印刷します。デバイスパターンを透明に設定し、周囲の領域を暗く設定します。マスクはリソグラフィー（他の15に記載されているように）によってデバイスパターンをSU-8上に光学的に転写するためのテンプレートとして役立つ。 </li><li>約4mLのSU-8 50を4インチシリコンウェハの中心に分配する。 2000回転/分（RPM）で30秒回転させることにより、スピンコータを使用してSU-8 50をウェハ上に均一に塗布する。ウェーハを95℃のホットプレート上で10分間焼く。ウェハを紫外線（UV）liに暴露する量200mJ / cm 2でGHT。 </li><li> 30秒間2500rpmでウェハとスピンの中心上にSU-8 2050の約4ミリリットルを注ぎます。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。室温（RT）に冷却します。 </li><li>繰り返しステップ1.3をさらに2回。 </li><li>第1層目の透明フォトマスクで被覆されたウェハを覆います。第一の層を作るために270ミリジュール/ cm 2のUV光にウェハを露出します。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。 </li><li>二回ステップ1.3を繰り返して、SU-8 2050年の第二の層を作ります。 </li><li>マスクアライナを用いて第1の層上のフィーチャに第二層マスクを整列させます。次いで、240ミリジュール/ cm 2のUV光にさらします。 15分間95℃で焼きます。 注：露光時間が必要とされる全UV線量と使用前の日に測定されたUV光出力強度によって決定されます。 </li><li>プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（PGMEA）にそれを浸漬し、オービタルシェーカー上で30分間、200RPMで振盪することによってウェハを開発。 </li><li>場所ウェーハの中心に：マスターペトリ皿へと慎重には、PDMSの混合物（重量で1〜10の割合で、架橋剤を塩基）を注ぎます。すべての機能を網羅し、気泡を避けます。 </li><li> 2時間70℃のオーブンで加熱。 PDMSのbiowireテンプレート（右図1A）のエッジの周りに切断する鋭利な刃を使用。マスターからPDMSの皮をむきます。ブレードとデバイスをトリム。 20分間121℃で滅菌ポーチと蒸気オートクレーブ中でPDMSのbiowireテンプレートを置きます。 </li><li>安全キャビネット（BSC）では、ペトリ皿にPDMSのbiowireテンプレートを配置します。チャネルの両端の溝の中に着座することによりPDMSマイクロウェルのチャネル（ 図1B-I）の中央に無菌外科用絹縫合糸（6-0）の部分を保持し、マウントするピンセットを使用。 </li></ol>電気刺激商工会議所の2創出<ol><li> 2cmのX：長方形のポリカーボネート片（長さ×幅×厚さのペアを作ります0.85 X 0.35センチメートルCM）および電気刺激室（ 図2）のフレームとしてそれらを使用します。 </li><li> 2センチメートル離れポリカーボネートフレームピースの中心線に沿ってドリル2つの幅3mmの穴。 </li><li>長さ1.5cm炭素棒の2枚をカット。端から3mm程度の炭素棒を介して1mmの広い穴をドリル。カーボンロッド孔から白金線を通し、カーボンロッドの周りを包むことによって、ワイヤを締め付けます。電気刺激とそれ以降の接続のための白金線の他端にクリップを取り付けます。 </li><li>ポリカーボネート枠片に炭素棒を挿入します。 6ウェルプレートのウェルに炭素棒に組み付けフレームを置き。 </li><li>ウェルにPDMSの2ミリリットルを注ぎます。近隣にPDMS表面レベルを維持するが、炭素棒の底部に到達していないがPDMSポリカーボネートフレームの底部を水没。 2時間70℃のオーブンで加熱。 </li><li> 6のうち、電気刺激室を取ります型ウェルプレートおよび20分間121℃で蒸気滅菌のために滅菌袋に入れ。 </li></ol> HPSC-CMの3酵素的解離<ol><li>確立されたプロトコル4を使用して心筋細胞に分化するようにHPSCを誘導します。 注：簡単に述べると、骨形成タンパク質4、塩基性線維芽細胞成長因子、アクチビンA、血管内皮増殖因子、およびDickkopfホモログ1 4と順次補充を通じて幹プロ培地中で確立された胚様体（EB）プロトコルを介して心筋細胞を生成します。 biowiresを作るために分化の日20-34からのEBを使用してください。 </li><li> P1,000ピペットチップを用いて低付着プレートからのEBを収集し、コニカルチューブに移します。 125×gで、室温で5分間の遠心分離によってペレット。上清を捨て、予め温めでペレットを再懸濁し、37℃のコラゲナーゼタイプI、1％デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）を含有します。 2時間37℃でインキュベート消化のために。 </li><li>予め温めの5 mLを加え、37℃、125×gで、室温で5分間培地および遠心分離を洗います。上清を捨てます。トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液2mLでペレットを再懸濁し、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 3％を含有する停止培地1mL（v / v）のDNアーゼIを追加</li><li> 5 mLの注射器に20 G（1.5 mm）の針を取り付け、それを介して3-5回EB懸濁液を渡します。 </li><li> 5分間280×gでの洗浄媒体および遠心分離機の7ミリリットルを加えます。上清を捨てます。イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中にペレットを再懸濁し、氷上で保存します。血球計算盤で細胞数を決定します。 5分間280×gで遠心分離することにより、0.5×10 6個の細胞ペレットを取ります。上清を取り除きます。 </li><li>滅菌チューブにそれらを混合する前に、氷上でプレクール全てゲル成分。以下コラーゲンゲル成分（最終濃度）を混ぜる：2.1 mg / mlとラット尾コラーゲンI型、24.9 mMグルコース、23.8ミリモルのNaHCO 3、14.3 mMのNaOHを、10mMのHEPES、および1×M199培地で10％の細胞外マトリックス。最後に、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを追加します。ピペッティングにより混和します。 </li><li>コラーゲンゲルの3.5μLを用いて0.5×10 6細胞を再懸濁し、よく混合します。 </li><li> 0.5センチメートル長チャンネル（ 図1B-II）中の細胞懸濁液の4μLを追加するP10ピペットチップを使用します。必要に応じて滅菌ピンセットを用いて縫合糸の位置を調整します。 </li><li>ゲルに触れないように確認しながら、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてペトリ皿の底を覆います。 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li>細胞（ 図1B-III）をカバーするのに十分な、（ 例えば、Proまたは細胞メーカーが推奨する培地幹細胞）の培養培地の12 mLのPBSに置き換えます。 1週間37℃のインキュベーターで培養。一日おきにメディアを変更します。 </li></ol> Biowire栽培4.電気刺激<ol><li>にBSCは、電気刺激チャンバを収容する6ウェルプレートの各ウェルに2mlのPBSを加えます。優しくウェルにオートクレーブし、電気刺激装置を配置するために滅菌ピンセットを使用してください。井戸からPBSを捨ててください。 </li><li>予め温めた培地5mlで炭素棒を覆います。電気刺激チャンバ内biowiresをマウントし、滅菌ピンセットを使用して、炭素棒（ 図2）に直交して配向します。 </li><li> 6ウェルプレートの上部に蓋を置くが、電気刺激装置に接続するプレートの外側に到達するのに十分な白金線を残します。 37℃で細胞培養インキュベーター中で6ウェルプレートを配置し、電気刺激に白金線を接続します。 </li><li>二相性パルス繰り返し、1 msのパルス持続時間、3 V / cmで、毎秒1つのパルス（PPS）：電気的な次の設定を有する刺激装置を用いてbiowiresを刺激します。次の値にPPSを24時間毎に上げる：1.83、2.66、3.49、40.82、5.15、および6変更中隔日。 </li><li> 10倍の倍率で顕微鏡下で、電気刺激に応答した心筋細胞の収縮性を観察します。 注：刺激の1週間後、biowiresが成熟になり（結果のセクションを参照してください）。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

この原稿はHPSC-CMの成熟を改善するために、設計プラットフォーム、biowireのセットアップと実装について説明します。デバイスは、標準的な微細加工設備で行うことができ、そしてbiowiresは、共通の細胞培養技術及び電気刺激を用いて製造することができます。 我々の知る限りでは、biowiresに似一切報告されている方法はありません。この戦略は、より高い刺激レートのランプアップレジメン（3ヘルツ対6ヘルツ）に供biowiresで得られた大きな成熟レベルによって証明されるように改善された成熟特性は、電気刺激療法に依存していたことがわかります。 biowiresにおける心筋細胞はあまり自動性と高いhERG電流を示し、 私がしたEBに比べK1 20日（EBd20）または40-44日（EBd44）のために栽培しました。 EBd44心筋細胞を10日間培養したLに対しEBd20心筋細胞は、biowiresへの組み込みの前に細胞の特性を表現しましたbiowire培養時間よりonger、さらにEB形式で培養中のより長い時間と、心筋細胞はbiowiresに...

セルベースの治療が最も有望なの一つであり、心臓修復/再生を実現するための戦略を検討しました。これは、心臓組織工学と生体材料1、2の共同送達によって助けられています。ほとんどの利用可能な細胞源は、損傷、病気の、または高齢者の心3上の彼らの潜在的に有益な効果のための動物モデルで研究されています。具体的には、多大な努力は、ヒト多能性幹細胞を使用する試みがなされている（HPSC）は、心筋（HPSC-CM）、心臓組織工学のための潜在的に無制限の自己細胞源由来しました。 HPSC-CMSは、いくつかの確立されたプロトコル4、 図5、 図6を用いて製造することができます。しかし、得られた細胞は、成体心室心筋7に比べ未熟特性の範囲は、胎児様表現型を表示します</sup&gt; 8。これは、創薬研究における成人の心臓疾患モデル9の開発における成人の心臓組織のモデルとしてHPSC-CMのアプリケーションに障害となり得ます。 表現型の未熟さのこの制限を克服するためには、新しいアプローチが積極的に心筋細胞の成熟を促進するために研究されてきました。初期の研究は、環状機械10又は電気的刺激11を介して新生児ラット心筋細胞における効果的なプロ成熟特性を明らかにしました。ゲルの圧縮および環状機械的刺激はまた、電気生理学およびカルシウムハンドリング性の最小の増強とのhpSC-CMの成熟12、13、のいくつかの側面を改善することが示されました。したがって、「生物学的ワイヤ」（biowire）と呼ばれるプラットフォームシステムは、構造的な手がかりと電界の両方を提供することによって考案されたstimulatioHPSC-CMS 14の成熟を強化するためのn。このシステムは、電場刺激を受けやすい整列心臓組織を作成するための微細加工プラットフォームを使用しています。これはHPSC-CMの構造的および電気生理学的成熟度を向上させるために使用することができます。ここで、我々は、このようなbiowiresを作るの詳細を説明します。

<table><tbody><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM 培養培地コンポーネント</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>デバイス</td></tr><tr><td>を設計するソフトウェア カーボンロッド、&Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>電気刺激装置チャンバーコンポーネント</td></tr><tr><td>コラーゲン、1型、ラットテール</td><td>BD Biosciences 354249</td><td></td><td>コラーゲンゲル:24.9 mM グルコース、23.8 mM NaHCO3、14.3 mM NaOH、10 mM HEPES に 2.1 mg/mL ラットテールコラーゲン I 型、10 % の成長因子還元マトリゲルを含む 1x M199 培地中。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Ca2+および Mg2+.0.22 &mu; で滅菌します。mをろ過し、12mLアリコートを作ります。-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>DNase Iを水に1 mg/mLストック溶液で調製します。滅菌済みでろ過し、0.5 mLのアリコートを&minusで保存します。20度;C</td></tr><tr><td>ドリル&ドリルビット(&Oslash; 1 mm and 2 mm)</td><td>ドレメル</td><td></td><td>ポリカーボネートフレームの穴あけ</td></tr><tr><td>電気刺激装置</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>株式会社WISENT</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&Omega;&ミッドドット;25°Cのcm。C、超高純度、すべてのソリューションを作るために</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>トーリーパインズ</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブの修正ダルベッコの媒体(IMDM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>マスクアライナー</td><td>EVG&nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル、成長因子低下&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>培地 199 (M199)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11825015</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>モノチオグリセロール (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM 培地成分</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>プレート(6ウェル)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>プレート(6ウェル)、低アタッチメント</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Platinum wires、0.2 mm</td><td></td><td></td><td>電気刺激装置チャンバー成分</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)</td><td>Doe &インガルス(株)</td><td></td><td>ウェーハポーチを開発するには</td></tr><tr><td>、ピールオープン</td><td>コンバーター92308</td><td>蒸気滅菌用</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ、4インチ</td><td>UniversityWafer株式会社。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重曹(NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>コラーゲンゲル成分</td></tr><tr><td>スプリンコーター</td><td>スペシャルティ・コーティング・システムズ</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 培地</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM培地。50 mLを作るには、1.3 mLのサプリメント、500 &mu;100&timesのL;L-グルタミン、250 &mu;30 mg / mLトランスフェリンのL、500 &mu;5 mg / mLアスコルビン酸のl、150 &mu;L of 26 &mu;l /2 mL モノチオグリセロール (MTG)、および 500 &mu;L(1%)ペニシリン/ストレプトマイシン。.</td></tr><tr><td>ストップメディア</td><td></td><td></td><td>洗浄媒体:FBS (1:1)</td></tr><tr><td>SU-8 50&nbsp;</td><td>マイクロケム株式会社</td><td></td><td>フォトレジスト、マスターコンポーネント</td></tr><tr><td>SU-8 2050&nbsp;</td><td>マイクロケム株式会社</td><td></td><td>フォトレジスト、マスターコンポーネント</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM 培地成分</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA、0.25%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM 培地成分</td></tr><tr><td>ウォッシュ培地</td><td></td><td></td><td>1% ペニシリン/ストレプトマイシン含有 IMDM</td></tr></tbody></table>

電気刺激を使用してbiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CMS）は、有望な細胞源となっているため、創薬、疾患のモデリング、組織工学、再生医療を含む心臓研究におけるそれらの潜在的なアプリケーションの調査を奨励しています。しかし、既存のプロトコルにより生成される細胞は、天然成体心室心筋細胞と比較して未成熟の範囲を表示します。多くの努力がこれまで達成のみ中等度の成熟に、HPSC-CMSを成熟する試みがなされてきました。したがって、biowire呼ば操作システムは、in vitroでのより成熟した状態にHPSC-CMSをリードする物理的および電気的の両方の手がかりを提供することによって考案されています。システムは、私が徐々に増加する周波数と電場刺激にさらされる整列心臓組織（biowire）にアセンブルする剛性テンプレート縫合糸に沿ってゲル型コラーゲンにHPSC-CMSを播種するために微細加工プラットフォームを使用します。非刺激対照と比較して、biowired心筋細胞は、構造的および電気生理学的成熟の強化度を示す刺激しました。このような変化は、刺激速度に依存します。本稿では詳細にbiowiresの設計と作成について説明します。

biowiresにおける縫合糸の使用のための合理は、一つの軸に整列し、心臓の繊維の形状を模倣する3D構築物の形成のためのテンプレートとして機能します。私たちは、biowireにおける文化の7日後に、細胞は、縫合糸（ 図3A）の周囲にゲルを改造することを示しています。細胞が整列し、心臓組織（ 図3）を形成するために、縫合糸の軸に沿って組み立てられました。前培養の7日後、biowires 7電場刺激の日と心筋の構造的および機能的成熟と互換性がさらに示される特性に供しました。 biowiresにおけるヒトPSC-CMは心収縮タンパク質の強い発現、筋節αアクチニン、およびアクチン（ 図4A）を示しました。我々は、筋原繊維狭窄のHPSC-CMの収縮装置及びアラインメントのサルコメアバンディングを観察し縫合糸の軸に沿っ。これは成人の心臓（ 図4...

心臓biowireプラットフォームは、電気刺激と三次元細胞培養を組み合わせることによって、ヒト胚および誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CM）を成熟するために使用されるインビトロの方法です。この原稿は、心臓biowireプラットフォームの詳細な設定を提示します。

電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

この手順の全体的な目的は、制御された三次元細胞培養法と電気刺激を利用して、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞由来の心筋細胞の成熟を促進することです。この手法は、異なる電気刺激パラメータや刺激時間が心細胞の機能および成熟状態にどのように影響するかなど、心臓組織工学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。最終的な成果として、成熟度が向上したエンジニアリングヒト心臓組織が得られます。この技術の意義は、電気的な伝播などの成熟した特性を持つ心筋細胞が、薬剤スクリーニング研究においてヒト心細胞のより正確なモデルとして機能する可能性が高いため、新薬の安全性および有効性の試験といった診断への応用にまで及びます。PDMSモノマーと硬化剤を10:1の比率で混合し、十分に混ぜ合わせます。脱泡させるため、5分間静置します。次に、バイオワイヤテンプレートのマスターが入ったペトリ皿にPDMS混合液を注ぎます。気泡の形成を最小限に抑えるようにしてください。続いて、PDMSを70 °Cで2時間硬化させます。次に、エッジの周囲に鋭利な刃を用いて、凝固したモールドを剥がして回収します。その後、余分なPDMSを切り取り、すべてのテンプレートを滅菌ポーチに集めます。テンプレートを121°Cで20分間、オートクレーブで蒸気滅菌します。次に、バイオセーフティキャビネット内で、各テンプレートを滅菌済みのペトリ皿にロードします。各テンプレートに対し、ピンセットを使用して、滅菌済みの6.0シルク縫合糸をチャネル全体にわたる溝に配置します。これで、テンプレートに細胞を播種する準備が整いました。縫合糸は、心筋線維の形状を模倣し、縫合軸に沿って配向する3D構造体形成のためのテンプレートとして機能します。各チャンバーについて、電気刺激チャンバーのフレームとなる長方形のポリカーボネート片を1組作成します。各ピースの中心線に沿って、直径3mmの穴を2cm間隔で2か所開けます。各チャンバーにつき、長さ1.5 cmの炭素棒を2本用意します。各棒の端から約3 mmのところに、幅1 mmの穴を開けます。次に、各穴に白金線をに通し、白金の端を棒に巻き付けます。次に、各チャンバーに対して、2枚のポリカーボネート片の間に2本のロッドを挿入してフレームを作成します。その後、6ウェルプレートのウェルにPDMSを約2 mL注ぎ、フレームの底が浸かるようにウェルに入れます。PDMSでフレームが固定されるよう、70 °Cで2時間PDMSを硬化させます。次に、PDMSが装着されたプレートから完成したチャンバーを取り出します。組み立てたチャンバーの機能を確認するには、白金線をバッテリーに接続し、電圧計を用いてロッドに電気が流れているかを確認してください。その後、機能確認済みのチャンバーを滅菌ポーチに移し、121 degree celsiusで20分間の高圧蒸気滅菌を行い、細胞培養に使用できるように準備します。ゲルを調製するために、すべてのゲル構成成分を氷上で予冷してから、滅菌チューブ内で混合します。コラーゲンと細胞外マトリックスを最後に添加し、ピペッティングによって成分を混合してください。細胞には、ヒト多能性幹細胞から分化させた心筋細胞を使用します。細胞を回収し、バイオワイヤー作製単位ごとに、50万個の細胞を含むコラーゲンゲルを3.5 µL準備します。次に、P10ピペットチップを使用して、各ディッシュの長さ0.5 cmのチャネルテンプレートに懸濁液を約4 µL注入します。滅菌ピンセットを用いて、縫合糸が完全に伸びるように必要に応じて位置を調整します。細胞を播種した後、結果の一貫性を保つため、オートクレーブにかける前に必ずゲルと細胞の混合液を再懸濁させてください。チャネルに充填した後、ゲルに触れないように注意しながら、ディッシュの底部を滅菌PBSで覆います。これにより、重合中にバイオワイヤーが脱水するのを防ぐことができます。バイオワイヤーを37 °Cで30分間インキュベートした後、PBSを細胞が浸る十分な量の培地で置換します。通常、12 mLで十分です。その後、1日おきに培地を交換しながら、1週間培養します。バイオセーフティキャビネット内で、電気刺激チャンバーを設置する6ウェルプレートの各ウェルにPBSを2 mLずつ加えます。次に、滅菌済みピンセットを使用して、オートクレーブ済みデバイスをウェルの中に慎重に配置します。配置後、PBSを廃棄し、カーボンロッドが完全に浸るように、温めた培地を5 mL加えます。細胞を24時間培養する前に、電気刺激に対する心筋細胞の収縮性を観察し、細胞が電気刺激を捉えて収縮反応を示していることを確認します。次に、バイオワイヤーを電気刺激装置のチャンバーに入れ、チャネルがカーボンロッドに対して垂直になるように配置します。白金線をプレートの外側に伸ばし、プレートに蓋をします。電線を電気刺激装置に接続します。刺激装置を、1 Hz、3 V/cmで、1 msの二相性パルスを出すように設定します。その後、電気刺激装置に入れた標本を37 °Cのインキュベーターに移します。刺激頻度を、0日目の1 Hzから6日目の6 Hzまで、24時間ごとに段階的に増加させます。この1週間の培養期間中は、隔日で培地を交換してください。また、心筋細胞の収縮能を毎日観察します。バイオワイヤーで7日間の前培養を行った後、細胞は縫合糸周囲のゲルを再形成した。細胞は縫合糸の軸に沿って集積し、配向した心臓組織を形成した。細胞は心臓収縮タンパク質を発現し、収縮装置にサルコメアの縞状構造が認められ、筋原線維は縫合糸の軸に沿って配向していた。バイオワイヤー内の細胞は、胚様体内の細胞よりも増殖率が低いことが示されました。バイオワイヤーで培養された心筋細胞では、カルシウムハンドリングが著しく改善していました。カフェイン処理により、筋小胞体からカルシウムの急速な放出が誘導されました。このような一過性現象は、刺激を与えた細胞においてのみ認められた。また、刺激頻度に応じてカルシウム放出振幅が有意に高まった。さらに、biowireで培養した心筋細胞は、胚様体での培養と比較してhERGおよび内向き整流電流密度が向上しており、これは電気刺激によってさらに増強された。内向き整流電流の改善は、カリウム内向き整流チャネル遺伝子であるKCN J2の発現増加と一致していました。自発的に拍動する能力である自動性は、コントロールのbiowireと比較して、胚様体由来心筋細胞において有意に高くなっていました。コントロールでは、6 Hzのレジメンを適用したbiowire調製物と同等の自動性が示されました。一度習得すれば、biowireのセットアップは半日で完了できます。電気刺激のセットアップには数時間かかり、最終的な結果を得るまでに2週間を要します。この手順を行う際は、異なる細胞株から分化させた心筋細胞や、異なるプロトコルで分化させた心筋細胞では、成熟度や純度がわずかに異なる場合があることに留意することが重要です。したがって、刺激頻度などの実験パラメータを、使用する細胞に合わせて最適化する必要があるかもしれません。本手順に従い、細胞組成の変更や変異心筋細胞の利用を含むその他の条件を最適化することで、さらに多くの追加的な疑問に答えることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

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再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。...

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体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

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細胞の Cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激

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再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。...

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。...

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

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2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぼう、電気刺激を用いた3次元培養法でヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を成熟させる方法。Biowiresプラットフォームは、薬剤スクリーニングのためのより正確な心臓モデル構築に貢献します。

電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

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