Name: 相対力、抗 TNF モノクローナル抗体 (mAb) 中和体外生物分析法を用いた TNF によって測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: 学ぶ抗TNF-αモノクローナル抗体の相対力測定法。WEHI164細胞を用いた体外生物分析法で、リファレンスmAbとサンプルmAbの中和効率を比較し、創薬開発や品質管理に有用な定量データを提供します。

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著者がある何も開示するには

この特性は、高価な時間のかかる臨床試験を実施する前に事前開発中の分子の生物学的挙動を決定するのに役立ちます。また、バッチのリリースの承認薬製品のことをお勧めします。これらの試いる分子は、その作用メカニズムに関する適切な生物学的効果を持っている場合を判断するのに役立つことを言及する価値があります。このチュートリアルで提供されるバイオ分析法が異なる抗 TNF 分子の比較に重要です。一般的な物理化学的方法にもかかわらずこの方法論は生物学的手段、効力とエフェクターの機能の完全なと完全の意義をこのように示して品質属性として薬の有効性を判断することができます。
一般的には、tnf α に細胞アポトーシス応答性は実行する研究者のための困難な作業をすることができます。この生物学的方法を標準化する前に日常的に使用される細胞バンクの特性評価によるトラブルシューティングを実施できます。一例は、細胞応答の可変性を細胞老化12に係る期間内です。この問題は-80 ° C で凍結マスターの細胞バンクを用いた除去します。ワーキング ・ セル ・ バ...

生物学的効力量 (質量で表される) は蛋白質の物理化学的測定に対し関連する生物学的特性にリンクされている製品の試金される属性に基づいて生物学的活性の定量的な尺度であります。他の分析方法論とともに、効力テストは、製品の適合性、安定性、および比較研究の一部として実行されます。この意味で、効力の測定、製品バッチと市場承認後臨床試験のすべての段階において重要な品質属性 (CQAs) または承認基準を満たすことを実証する使用されます。
アポトーシスはプログラムされた細胞死、細胞は、ウイルスや環境によってセルを強調しているときに感染しているときに自然に発生する要因その妥協細胞生存率と機能1,2。とりわけ、アポトーシス抑制、または生物学的中和です免疫炎症性疾患などの慢性疾患の治療を中心に、Mab の主知られている治療上のメカニズムの一つ抗 TNF 分子は p55 と p75 細胞表面の受容器3、最後に細胞をアポトーシスに導く信号経路を防ぐと腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) の相互作用をブロックすることによってその治療特性を発揮します。
Tnf α はいくつかの慢性的な病気の4の炎症を引き起こすことができます。Tnf α は自然免疫系と疾患5のこの種の主な俳優の歩哨であるマクロファージから分泌される細胞外の環境にも。共通パスとして tnf α の規制緩和は、これらの病気の病因に関連付けられます。制御なしと一定の誘導と細胞ストレスの下では、tnf α は関節リウマチ、クローン病、その他の病理組織学的プロファイル6に繋がる細胞死と組織の変性を誘導します。
TNF とその受容体の相互作用をブロックする TNF 拮抗薬は、症状を軽減し、これらの疾患の進行を妨げるの効果的な療法としてますます使用されています。今日では、抗 TNF 製剤、広く全身さらに関与する組織の変性を防ぐ、このサイトカイン濃度を制御する使用されます。この意味で、薬の生物学的効果を達成するために特定の能力を記述するため再現性と堅牢な生物検定法を提供することが不可欠です。
中和アッセイの開発中にステップで識別されるこの議定書、クリティカルで-生物学的効力の測定に成功は強調表示されます、バイオ分析メソッドを実行するために必要なスキルに重点。このバイオ分析法は、医薬品の臨床試験済みの標準物質と比較されたとき異なるバッチまたは抗 TNF の間有用な比較情報を提供します。

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>2 °Cで培地を保管します。Cから8 &deg;C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム、フェノールレッドなし</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>ミディアムを 2 °C で保存。Cから8 &deg;C</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>-10 °C で培地を保存します。C から -20 &deg;C</td></tr><tr><td>DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>培地を2°Cで保存します。Cから8 &deg;C</td></tr><tr><td>組換えヒトTNF-αタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>-20 >C から -70 &deg;C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (米国)、超低 IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>-10 °C;C から -20 &deg;C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(米国)、HyClone</td><td></td><td>SH3007103</td><td>-10°Cで保存できる特性。C から -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &ndash;20 & ordm;C 保護 光</td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム塩、二水和物、結晶、A.C.S. 試薬</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>-</td></tr><tr><td>-サンプル mAb アダリムマブ</td><td>プロバイオメッド</td><td>NA</td><td>マイクロプレートの最終濃度は、&nbsp; 0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014、0.004 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>リファレンス&コントロール mAb アダリムマブ</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>マイクロプレートの最終濃度は、&nbsp; 0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014、0.004 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 マルチモード</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダーソフトウェア&nbsp;</td><td>分子デバイス</td><td>--</td><td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>インキュベーター&nbsp;</td><td>レブコ&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB 強制空気 CO2</td></tr><tr><td>層流フード&nbsp;</td><td>ベイカー・カンパニー&nbsp;&nbsp;</td><td>200256</td><td>ベイカーSG603A-HE |高効率、クラスIIタイプA2&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

相対力、抗 tnf モノクローナル抗体 (mab) 中和体外生物分析法を用いた tnf によって測定

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

このプロトコルは、抗 tnf α モノクローナル抗体を用いたマウス線維芽細胞細胞モデル (WEHI 164) における tnf α のアポトーシス活性中和の測定を示しています。さらに、このプロトコルは、融合蛋白質などの他の抗 tnf α 分子を評価に使用できます。ここで採用されている携帯電話のモデルは、追加のストレス因子が細胞培養条件 (例えば、血清剥奪) に誘導される tnf α によるアポトーシスに敏感です。この手順に関する試料調製、セル希釈、アポトーシス誘導、吸光光度測定結果をお約束する重要なキー操作を強調表示、この分析法を実行する方法を例示しています。このプロトコルでは、アポトーシス誘導および記録、低い不確かさの値につながる効率的な信号に関するベスト パフォーマンス条件を明らかにします。

(コントロール) と線量応答グラフ 
図 1は、mAb 濃度対発光応答を表します。このシグモイド関数セル換散のためのアッセイ培地のカスパーゼ 3 および 7 のリリースを例示しています。細胞死は、血清飢餓に加えて、tnf α シグナル誘導によって強化されています。したがって、抗 tnf α 分子 (mAb) は (立体障害) によって細胞の TNF 受容体との相互作用を抑制すること、サイトカインと対話します。これによりより高いモノクローナル抗体濃度で細胞の生存。
コントロールのメソッドで使用された: のアッセイと細胞培養培地、細胞に加えて、tnf α プラス アッセイ培と文化 mediumalone を試金。発光を差しこみ、アポトーシス細胞アッセイ培 FBS 飢餓下で単独では受けなかった。また、tnf α が、培養培地で耕作されるだけで細胞が生き残るか確...

中和機構を用いた WEHI 164 細胞抗 TNF モノクローナル抗体の相対的な抗アポトーシス活性測定のためのプロトコルを次に示します。このプロトコルは同じ生物学的機能を持つ異なる分子の中和力を比較するのに役立ちます。

相対力、抗 TNF モノクローナル抗体 (mAb) 中和体外生物分析法を用いた TNF によって測定

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

本手順の全体的な目的は、抗TNF-α分子の相対的な効力を測定することです。この例では、2つの抗TNF-αモノクローナル抗体を比較し、調査対象のサンプルmAbに対する参照mAbの中和効率を決定します。このチュートリアルでは、文献には記載されていないTNF-α中和効力決定のための詳細なステップを解説します。細胞は、飢餓などのさまざまな環境要因によってストレスを受けることがあります。それぞれの細胞の表面には、受容体と呼ばれる異なるタンパク質が存在します。その一部は、サイトカインであるTNF-alphaに特異的なものです。この分子が受容体と相互作用して特定のシグナルが発生すると、このシグナルが環境ストレス因子と組み合わさることで、アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死が誘導されます。しかし、モノクローナル抗体などの抗TNF-α分子が存在する場合、サイトカインがmAbによって滴定され、中和プロセスが進むことで細胞の生存が助けられます。したがって、標準化された手法を用いることで、分子の中和能を測定することが可能です。このプロトコルは現在、5日間で行われます。1日目は、細胞培養用の溶液を調製する必要があります。さらに、WEHI 164細胞の融解および継代培養を行います。2日目および3日目に、細胞のコンフルエンシーを確認する必要があります。この工程の後、細胞を剥離・計数し、細胞密度を調整した後、再び培養します。これらの手順は毎日行う必要があります。4日目に、UV吸収法によりmAb濃度を測定し、抗体の希釈を行う必要があります。アポトーシス誘導溶液を調製します。最後に、WEHI 164細胞の細胞密度を 0.5 × 10⁶ cells/mL に調整します。5日目に、アポトーシス細胞検出用の基質溶液を調製し、分光光度分析を行います。最後に、結果のin silico解析について考察します。本プロトコルで使用するすべての溶液はこのスライドに記載されています。1日目において、本溶液はプロトコルの実行前に準備しておく必要があります。ただし、アポトーシス誘導液および基質溶液については、再構成後すぐに使用してください。本プロトコルの開始時に、凍結細胞を液体窒素容器から取り出します。凍結WEHI細胞の入ったこのバイアルは、使用するまで氷上で保持してください。交差汚染を避けるため、あらゆる操作を行う前に、作業スペースを清潔に保ち、除菌してください。等温ラックをラミナーフローフードに移し、15 mLの滅菌チューブに、あらかじめ温めておいた培地を9 mL分分注します。温めておいた培地1 mLを用いて、WEHI 164細胞を穏やかなピペッティングで洗浄し、凍結細胞がマイクロチューブから離れるまで操作します。凍結細胞が完全に解凍されるまで、5回反転混和します。次に、細胞を125 gで3分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを分散させます。あらかじめ温めておいた培地を5 mLチューブに加え、細胞が完全に再懸濁するまで懸濁液を混合します。細胞をT-cultureフラスコに回収します。その後、37 Celsius、5%の二酸化炭素条件下で一晩培養します。細胞を剥離させる前の毎日の工程において、培養細胞数を計測し、顕微鏡下で培養の状態を確認することが必須です。研究者は、継代培養のために細胞の健康状態、生存率、および細胞密度を確認する必要があります。この確認はバイオアッセイにおいても実施しなければなりません。まず、細菌などの生物学的汚染がないことを確認する必要があります。次に、細胞の状態はコンフルエンスによって確認できます。良好な結果を得るには、90%以上のコンフルエンスがあれば十分です。ただし、細胞が目的の細胞密度に達していない場合は、フラスコをインキュベーターに戻し、細胞が目的の細胞密度およびコンフルエンスに達するまで待機する必要があります。Tフラスコから古くなった培地を除去します。Tフラスコの壁面に接着している細胞を、5 mLの細胞洗浄溶液で洗浄します。この際、接着細胞を除去しないよう注意してください。培養基の残留物および細胞碎片を取り除くため、手動で混合します。この工程は2回繰り返してください。真空吸引を用いて残った洗浄液を除去し、3 mLの細胞遊離液を加えます。3分間、撹拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、酵素を不活化させるために、あらかじめ温めておいた培養液をTフラスコに加えます。その後、細胞を回収します。細胞懸濁液を15-mLチューブに移し、遠心分離します。細胞ペレットを確認し、上清を捨てます。健全な細胞を培養するためには、古くなった培地を除去することが不可欠です。細胞ペレットを分散させ、あらかじめ温めておいた培養液 5 mL で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液 50 µL をマイクロチューブに移します。トリパンブルー排除法を用いて細胞数を計測します。細胞数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞数が判明したら、以下の計算式を用いて、15 mLの培地における細胞密度が1 mLあたり50万個になるように調整してください。調整した細胞懸濁液15 mLをTフラスコに移し、一晩培養します。中和試験を開始する前に、この一連の培養工程を少なくともあと1回繰り返し、計3回の細胞継代を行う必要があります。4日目に、参照物質、分析試料、およびコントロール試料の光学密度を280 nanometersのUV吸収により測定します。各試料について、試験用培養培地を用いて2 mg/mLに一次希釈を行い、独立した3連系で準備します。各mAbサンプルについて、2 µg/mLまで2回目の希釈を行います。ポリスチレンマイクロプレートの中央にある60個のウェルに、アッセイ用培養基を75 µLずつ分注します。ウェル2Bと2Cに、参照物質を230 µL加えます。ウェル2Dおよび2Eに分析サンプルを、そして最後にウェル2Fおよび2Gにコントロールサンプルを添加します。コントロールサンプルとは、相対力価が既知である分子のことです。次に、マイクロプレート内で段階希釈を行います。例を以降のスライドで示します。ウェルに分注する前に、溶液を十分に混合することを忘れないでください。この操作は本プロトコルの成功において極めて重要です。あらかじめ、ディスペンサーを用いて細胞濃度を 0.5 × 10⁶ cells/mL に調整してください。アッセイプレートの2列目から11列目までの内側60ウェルに、細胞懸濁液を 50 µL ずつ添加します。マイクロプレートに液体を加える前に、細胞懸濁液を混合します。直ちに50 µLのmAb希釈液をアッセイプレートに移します。ペアのレーンの場合は、マイクロピペットを回転させながら希釈液を分注します。mAb希釈液を以下の順序でウェルに分注し、コントロールを周囲のウェルに分注します。TNF-alphaを500 µLの超純水で希釈します。ボルテックスミキサーを用いて2200 rpmsで混合します。15-mLチューブに移し、最後にアッセイ用培地で40 nanograms per mLに希釈します。アポトーシス誘導溶液50 microlitersを、内部の60個のアッセイウェルに分注します。アポトーシス誘導溶液50 microlitersを、内部の60個のアッセイウェルに分注します。最後に、16時間インキュベートします。5日目に、メーカーの指示に従ってこの緩衝液で基質を再構成します。5回転倒混和して混ぜ合わせます。基質溶液を分注します。アッセイプレートの各サンプルウェルに基質溶液を50 µLずつ添加してください。また、コントロールにも基質を添加します。アッセイプレートをボルテックスミキサーを用い、400 rpmで3分間攪拌します。ミキサーからアッセイプレートを取り出し、室温でインキュベートします。プレートリーダー分光光度計の電源を入れます。SoftMax Proソフトウェアまたは同等のプログラムを起動します。マイクロプレートを分光光度計にセットし、以下のパラメータを調整します。ルミネッセンス機能を有効にし、リードタイプをエンドポイント法に設定します。1列目と12列目を除外して読み取り領域（Read Area）を調整します。プレートタイプ（Plate Type）に「96 Well Standard clear bottom microplate」を選択します。積算時間（Integration Time）を1250 millisecondsまで変更します。マイクロプレートのシェイク時間を10秒に調整します。標準物質、分析物質、およびコントロールサンプルを分注するウェルを選択してください。測定を開始します。本アッセイの結果は、mAb濃度の対数スケールと比較した発光強度の応答曲線として表されます。これらの曲線の変曲点が、各mAbの有効濃度であるEC50となります。EC50はng/mLで表記されます。しかし、この値は参照試料と比較しなければそれ自体に意味はありません。したがって、分析試料の力価はパーセンテージで表され、相対力価と呼ばれます。相対力価は、各プレートのEC50値から算出された、3つの独立したマイクロプレートの結果の平均値です。コントロールサンプルとリファレンスサンプルの比較により、現在のアッセイにおける偏差またはバイアスを判断できます。リファレンスサンプルと分析サンプルの比較により、相対力価を決定できます。この表は、mAbの相対力価およびその95%信頼区間を示しています。また、リファレンス物質の力価に関連する各サンプルの相対標準偏差も表示しています。相対標準偏差が15%を超える場合は、許容されないと考えられます。この特性評価を行うことで、高コストで時間のかかる臨床試験を実施する前に、開発中の分子の生体内挙動を事前的に判断することが可能になります。また、承認済み製品のバッチ間リリース（出荷判定）にも有用です。これらのアッセイは、分子がその作用機序に関して十分な生物学的効果を有しているかを確認する上で有用であると判断されます。生物物理学的手法の一環として、本手法は薬剤の品質と特性における力価および有効性を生物学的な手段で決定することができ、それによってそのエフェクター機能の完全かつ十分な意義を示すことが可能です。

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インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc...

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

中和抗体や血清や脳脊髄液 (CSF) など、行列の人間の酵素補充療法の細胞内取り込みを妨げるその他の要因を検出する細胞ベースのフロー...

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

本稿では elisa 法を用いたマウスの T に依存し、T 独立免疫グロブリン (Ig) アイソタイプを特徴付けるためのプロトコルについて述べる.このメソッドは、単独で使用またはフローと組み合わせてフローサイトメトリーは T に依存し、T 独立した抗原免疫したマウスの B 細胞の Ig...

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

MALT1 免疫を調節するが、不明確のままどのようにこれが発生します。MALT1 の生得的なシグナリング Toll 様や C 型レクチン様受容体、MALT1 が骨髄性サイトカインの生産を調節することを示すの下流と下流への貢献を解明する選択的 MALT1 paracaspase 阻害剤 MLT 827 を使いました。C...

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

学ぶ抗TNF-αモノクローナル抗体の相対力測定法。WEHI164細胞を用いた体外生物分析法で、リファレンスmAbとサンプルmAbの中和効率を比較し、創薬開発や品質管理に有用な定量データを提供します。

相対力、抗 TNF モノクローナル抗体 (mAb) 中和体外生物分析法を用いた TNF によって測定

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