Name: 合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ単細胞TCRアルファ・ベータ鎖のPCR増幅法とレトロウイルスベクター生成によるヒトTCRの生体内発現解析。免疫応答とTCRレパートア研究に有用です。

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本研究は、JDRF 1-FAC-2014-243-A-N、ADA 7-14-ユニデン-07、NIH 5 P30 DK079638 05 パイロット PJ と、ロバートとジャニス ・ マクネイア財団によって賄われていた。
患者の募集、テクニカル サポート、博士ジョージ Makedonas 抗体とコントロール PCR の最適化に使用される DNA のギフトのためにサミュエル ・ ブラム、サンドラ ペーニャと Andrene マクドナルドに感謝します。

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現在のプロトコルの単一セルの TCR 増幅特性とそれに続く補助的クローニング ペアの TCR アルファとベータ鎖のテンプレート レトロ ウイルス発現ベクターに効率的な方法をについて説明します。単一セル PCR のいくつかのプロトコルが開発されているが、どれもはこれまで即時サブ表現のベクトルへのクローニングと互換性があるされています。ほとんどの場合、可変領域を推定する十分なシーケンスで、非常に可変 CDR3 地域包括的な部分的なシーケンスは増幅されます。PCR の製品のサイズを小さくこの PCR 効率をサポートしますが、 de novo TCR 遺伝子合成機能の研究が必要になります。現在のプロトコルは、以前に発行された CDR3 に焦点を当てた単細胞 TCR シーケンス プロトコル、同時にクローン作成に適した全体変数領域を含む長い私アンプリコンを降伏時の効率を維持します。したがって、記述されているシステムは、定量的順序として機能の出力を与えることで増加する柔軟性を持ちます。
演説する科学的な質問、ソースと分析した T 細胞の特異性によって異なります。ただし、プロジェ...

T 細胞受容体 (TCR) は、開発、定常状態/恒常性やその周囲1,2,3の抗原的な刺激の中に T 細胞の運命の決定を決定します。深い技術の最近の展開は、抗原特異的 T 細胞応答内以前過小評価 TCR の多様性を発見しました。TCR の多様性では、機能的な T 細胞の反応の可能性を示唆しています。実験的システムと生体内でのモデル選択の後続機能解析のために利用に対応する TCR 機能アッセイと TCR シーケンス レパートリー解析を統合するためにシーケンスのアプローチを設計する必要があります。Tcr。人間の TCR シーケンスの分離のための効率的な方法を開発し、HLA ヒト化マウス4TCR 式と互換性のあるキメラマウス人間 TCR テンプレートのベクターへのクローニングはサブを合理化します。ヘテロ二量体型 Tcr の対応するアルファとベータ鎖の分離には、単一のセルから両方の鎖の PCR 増幅が必要です。とはいえ、いくつかの単一セル TCR のクローニング プロトコルが開発され利用どれもこれまでのところされている高スループット合理化された直接クローニングによる未知の Vα/Vβ Tcr の retroviral ベクトル再式の生体内での必要に簡単に互換性のあります。 4,5,6,7。以前の研究は、シーケンスを外挿法で推定したり、全体 TCR シーケンス4,5,6を増幅するための十分な TCR の限られた部分を選択的に増幅する 2 つの主要なアプローチを活用して,7します。 最初のアプローチを介して TCR 系列の下流の機能解析が必要です高価なインシリコアセンブリおよびde novoの建設、TCR。2 番目のアプローチでは、TCR の完全な配列を提供しています、人間の一定の領域はマウス モデルでクローンの Tcr の体内式と互換性ありません。我々 のアプローチは生体内機能解析 Tcr のマウスのモデルに対応する設計します。我々 は、効率的で合理化された単一電池直接補助的クローニング PCR のフラグメントのテンプレートの発現ベクターには、PCR のプロトコルを開発しました。
我々 のアプローチは、2 つの手順で実行される高感度多重入れ子に PCR 反応を利用しています。最初の多重反応 40 プライマーすべての V β 鎖の特定のプールと 44 プライマー シーケンス (表 1) の事前知識がなくて TCR アルファまたは TCR β を増幅するための V α 鎖すべての特定のプールをステップします。前方のプライマーが 5' の PCR の製品に組み込まれているアダプターのシーケンスです。逆のプライマーは、TCR の一定した領域に基づいています。もとは、ユニークな制限のサイト人間変数またはジャンクション TCR 地域から欠席し、新しく再設計された TCRα と TCRβ のプライマー (図 1) にこれらを組み込みます。2 番目の入れ子になった反応アダプター シーケンスの特定のプライマーおよび一定した領域内で入れ子になった逆プライマーを使用して高められた特定性 (表 1、図 1) と TCR チェーンをさらに増幅します。単一細胞の分離後、2 つの PCR のラウンド (Vα と Vβ の両方のプライマーのプールと 2 番目アダプター プライマーの最初の反応) 直接補助的クローン作成できるテンプレート retroviral ベクトルに PCR の製品の結果します。1 つのオープンリーディング フレーム (ORF)、'自己切断' 蛋白質シーケンスによって接続されているマウスの一定領域と組み合わせて人間の可変領域で、TCR の最終的な構成要素をエンコード P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A シーケンスは、複数のシステムで使用されている、Tcr8,9,10,11の表現のために具体的には広範囲にテストされています。とはいえ、P2A シーケンスの残物のほとんどに接続されている後の翻訳ベータ鎖信号シーケンスが追加プロリン、この変更適用範囲が広いリンカーによって接続されているアルファ鎖の C 末端に TCR 機能に有害な影響がないです。マウスの一定の領域が下流のシグナル伝達コンポーネント潜在的な変更された相互作用を避けるために人間ではなく構成要素で使用が場合再マウスの細胞で発現します。単一 ORF は、アルファおよびベータ鎖9,11の化学量論的個別式になります。現在のプロトコルは試薬および広く利用可能、アプローチに基づいており、合理的で効率的な方法で実行するように設計。このプロトコルは同定と人間 Tcr の特定の機能評価に広く適用することができますが、特に自己免疫性糖尿病に関与する自己反応性 T 細胞の Tcr を試金するこのテクニックを使いました、見込んでください。自己免疫性エピトープ、がん抗原や病原体とワクチンへの応答。

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eバイオサイエンス&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>反ヒト CD4 (OKT4) BV421</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗ヒト CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗マウス CD3 AF647</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>組換え RNAse 阻害剤 biotech grd 2.5KU&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&nbsp;</td><td>インvirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT酵素)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O:ヌクレアーゼフリー水1000mL</td><td>インバートゲン&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNAポリメラーゼ2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96ウェルハーフスカートPCRプレート</td><td>フェニックス</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアンペア透明粘着フィルム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4306311 ウルトラピュア アガロース&nbsp;</td><td>インvirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>ニューイングランド バイオラボ&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (挿入) 30 U (ベクトル)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (挿入) 80 U (ベクトル)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (挿入) 80 U (ベクター)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (挿入) 80 U (ベクター)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>クイックリガーゼ&nbsp;</td><td>ニューイングランド・バイオラボ&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA精製システム&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA精製システム&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA クリーン & コンセントレータ-25 キット</td><td>ジェネシー サイエンティフィック&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNAクリーン&コンセントレータ-5キット</td><td>ジェネシーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>サブクローニング効率 DH5aコンピテントセル&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (トランスフェクション試薬)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (ソーター)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (フローサイトメーター)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

合理化単細胞 tcr 分離し体外の retroviral ベクトルの生成、人間 tcr の生体内で発現

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

1 つの T 細胞からペアの T 細胞受容体 (TCR) アルファとベータ鎖の配列のためのいくつかの方法が開発されているが、どれもはこれまで TCR ヘテロの下流に資する生体内機能解析をされています。人間の TCR アルファとベータ鎖の可変領域を全体にまたがる PCR の製品の結果を持つ多重ネストの 2 段階 PCR に基づく改良されたプロトコルを開発しました。ユニークな制限のサイトを識別し、PCR のプライマーに組み込む、によって行った PCR の製品テンプレート レトロウイルスベクターに直接補助的クローニングと互換性があります。結果としてレトロ ウイルス構築キメラ人間/TCR を持つマウス マウス細胞やマウスモデルの生体内での機能はマウスの細胞内ドメインをエンコードします。全体的に、ここで説明されているプロトコルは生体外でそして生体内の TCR 式のレトロウイルスベクター容易に適応できるの合理化された世代対単一細胞 TCR アルファとベータ チェーン識別を組み合わせたものです。ビデオとそれに伴う材料は、重要なステップは続くと潜在的な落とし穴を回避できるように、単一セル PCR の非常に詳細な説明を与えるに設計されています。また、発現ベクターを生成に必要なクローン作成の手順の詳細な説明を提供します。一度マスター、TCR 式に並べ替え 1 つのセルから全体の手順は 2 週間の短期間で実行でした。

多重ネスト PCR の反作用の効率は agarose のゲルの 5µL 2 番目の反応のうち実行している 3.2.7 (図 2) の手順でチェックします。TCR アルファ反応の効率は通常より低い、約 50% に 80% を前後になると TCR β 増幅の効率の予想平均4。TCR 式だけペア TCR アルファと TCR β 鎖使えますただし、すべての PCR の製品は、TCR シーケンスおよびレパートリーについてシーケンスでした。
遺伝子サイレンシング特定の T 細胞に表現される単一 TCR β 鎖のみできるようになります。ただし、第 2 の TCR α 鎖の位置を換えることができる T 細胞、T 細胞の約 25% が14チェーン 2 番目のフレームの TCR アルファを表現します。それは分離の TC...

単一のセル対人間 TCR アルファとベータ鎖シーケンスで現在のプロトコル結合合理化レトロウイルスベクターの in vitroとin vivoの TCR 式と互換性の世代です。

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

この方法は、抗原の特異的集団のTCRアルファおよびベータレパートリーや、ヒトTCRのin vivo機能など、免疫学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR反応の効率が比較的高いことと、その後のTCRクローニングとの適合性です。このプロトコルでは、2ステップPCRを使用して、TCR配列の事前知識がなくても、単一細胞からTCRアルファ鎖とベータ鎖を増幅します。最初のPCRは、アルファまたはベータ可変領域特異的プライマーのプールと、定常領域に特異的なプライマーを組み合わせたマルチプレックス反応です。第2のPCRは、PCR産物の5つのプライムエンドに組み込まれたアダプター配列と内部定常領域配列をプライミングするネスト反応です。また、これらのプライマーは、PCR産物の5つのプライム末端と3つのプライム末端に独自の制限部位を組み込んで、その後のクローニングを容易にします。テンプレートベクターにクローニングされると、エンコードされたTCR配列はキメラ体となり、ヒト変数領域とミラーリング定数領域で構成されます。キメラTCRコンストラクトは、TCRとミラーリングCD3シグナル伝達複合体との間の相互作用を可能にし、このTCRクローニングプロトコルをミラーリング細胞株およびヒト化マウスモデルにおけるその後の機能研究と適合させます。テンプレートフリーの清潔な領域で逆転写試薬を調製することにより、シングルセルソーティング用にセットアップします。一般的に、シングルセルPCR法を初めて使用する人は、テンプレートのレベルが低いため、苦労します。一方、マルチプレックスネステッドPCRの感度は、低レベルのテンプレート汚染に敏感です。したがって、PCR反応を設定する領域を徹底的に洗浄する必要があります。この反応では、アルファ鎖とベータ鎖の定常領域に特異的な3つのリバースプライマーの混合物が使用されます。逆転写マスターミックスは、ピペッティングリザーバーで試薬を組み合わせて調製します。ピペッティングエラーを考慮するために、10個のウェルを追加するのに十分な反応混合物を作成します。マルチチャンネルを使用して、ウェルあたり6マイクロリットルを96ウェルPCRプレートにピペットで移します。プレートをシールでゆるく覆い、プレートを氷の上に保ちます。細胞表面マーカーに対する抗体で細胞を染色することにより、シングルセルソーティング用のT細胞を調製します。T細胞をウェルごとに一度にソートし、12行を空のままにして、ネガティブコントロールとして機能します。プレートを粘着フィルムで密封し、1000gで4°Cで5分間回転させます。すぐに逆転写反応を実行します。可能であれば、最初のPCR反応を同日に実施します。マルチプレックス反応を実行するには、ピペッティングリザーバーでV α PCRマスターミックスとV β PCRマスターミックスを別々に混合します。cDNAを含むプレートを氷上または冷たいブロックの上に置きます。22.5マイクロリットルのTCRベータ反応を新しい96ウェルピースPCRプレートに移します。次に、マルチチャネルを使用して、2.5マイクロリットルのcDNAをPCRプレートに転写します。マルチチャンネルを使用して、22.5マイクロリットルのTCRアルファ反応を残りのcDNAを含むプレートに直接ピペットで挿入します。プレートを接着剤で密封し、穏やかに渦巻き、短時間回転させます。最初のPCR反応を実行します。プレートは摂氏20度で保管できます。翌日、2番目のネストされたPCR反応を準備します。マルチチャンネルを使用して、TCRアルファ反応とTCRベータ反応のマスターミックスをウェルあたり22.5マイクロリットルでピペットで2つの新しい96ウェルPCRプレートにピペットで送ります。マルチプレックスPCR反応テンプレートをウェルあたり2.5マイクロリットルで添加します。プレートを密封し、ゆっくりとボルテックスし、短時間スピンダウンします。残りの最初のPCR反応液は、バックアップテンプレートの供給源として機能するために、密封して摂氏20度で保存する必要があります。2回目のPCR反応を行います。2回目のネステッドPCR反応が完了したら、1%アガロースゲルで5マイクロリットルの反応液を使い果たします。ポジティブコントロールウェルとネガティブコントロールウェルを含めます。予想されるバンドは、約 500 塩基対のサイズで動作するはずです。2番目の反応の残りの部分である20マイクロリットルを96ウェルフォーマットのPCR精製キットを使用して精製し、サンガーシーケンシングを行います。得られたTCR配列は、オンラインで利用可能な免疫遺伝学的ソフトウェアを使用して分析できます。配列情報を使用して、T細胞集団のレパトアとクローン性を評価できます。ペアになったTCRのアルファ配列とベータ配列は、さらなる機能解析に使用できます。TCR beta と TCR alpha の連続ライゲーションをテンプレートベクターに実行します。テンプレートTCRベータとTCRアルファは、PCR増幅鎖に置き換えられます。最初のライゲーションでは、テンプレートTCRベータがPCR増幅ベータ鎖に置き換えられます。TCRベータの正常な挿入がテスト消化インシーケンシングによって確認されたら、テンプレートTCRアルファをPCR増幅アルファ鎖に置き換えます。HEK293T細胞は、TCR鎖のペアリングと細胞表面発現の成功をテストするために使用されます。HEK293T細胞は、アメトリン蛍光レポーターによってマークされたTCRベクターおよびGFPによってマークされたCD3複合体をコードするベクターと共トランスフェクトされます。キメラTCRの表面発現は、抗マウスCD3抗体で細胞を染色することにより、フローサイトメトリーによって検証されます。キメラTCRコンストラクトでトランスフェクトされた細胞における表面CD3発現のレベルは、完全にミラーリングされた制御テンプレートベクターでトランスフェクションされたものと同等であるべきです。要約すると、シングルセルからペアになったTCR鎖を同定し、クローニングするための効率的なPCRベースのプロトコルについて説明しました。これは、自己免疫、腫瘍サーベイランス、および病原体の排除におけるヒトT細胞応答を研究するための貴重なツールになると期待しています。ここで説明するPCRプロトコルの主な利点は、その後のin vitroおよびin vivo研究との適合性です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールと​​して使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。...

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

我々はレトロウイルス導入を用いて抗原特異的マウスT細胞を生成するためにプロトコルを提示...

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

私たちは、単一のT細胞受容体(TCR)レトロウイルスベースのin vivo発現システムのための迅速で柔軟なプロトコールを提示します。 レトロウイルスベクターは、骨髄前駆細胞を形質導入するために使用され、TCRトランスジェニックマウスの代替として、in...

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。...

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。...

マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

Cas9トランスジェニックマウスの初代T細胞へのガイドRNAのレトロウイルス形質導入のプロトコールを提示し、Th17分化の研究における遺伝子編集の効率的な代替手段を提供します。...

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

私たちは、トランスフォーミング受容体のレトロウイルス形質導入と、受容体媒介性臓器および微小環境特異的リンパ球のポジショニングを研究するための競合的ホーミングのための改善されたプロトコルを提示します。この方法は、免疫細胞の輸送メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、将来の基礎研究や治療研究への応用が期待されています。...

多様な組織微小環境におけるGPCR媒介T細胞局在の研究のための効率的なレトロウイルス形質導入と競合的ホーミング

CRISPR/Cas9技術を使用して、相同性終末結合(HMEJ)DNA修復経路 を介して...

大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

このプロトコルは、一次T細胞の培養に必要な手順、すなわち単離、活性化、増殖、そしてmRNA電気穿孔による一時的なトランスフェクションを説明しています。さらに、表現型、活性化マーカー、生存可能性、キメラ抗原受容体(CAR)発現のフローサイトメトリー解析のためのワークフローおよび抗体パネルも提案されています。...

一次ヒトT細胞の分離、培養、そして一時的なトランスフェクションによるキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の生成

学ぶ単細胞TCRアルファ・ベータ鎖のPCR増幅法とレトロウイルスベクター生成によるヒトTCRの生体内発現解析。免疫応答とTCRレパートア研究に有用です。

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

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