合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

この方法は、抗原の特異的集団のTCRアルファおよびベータレパートリーや、ヒトTCRのin vivo機能など、免疫学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR反応の効率が比較的高いことと、その後のTCRクローニングとの適合性です。このプロトコルでは、2ステップPCRを使用して、TCR配列の事前知識がなくても、単一細胞からTCRアルファ鎖とベータ鎖を増幅します。

最初のPCRは、アルファまたはベータ可変領域特異的プライマーのプールと、定常領域に特異的なプライマーを組み合わせたマルチプレックス反応です。第2のPCRは、PCR産物の5つのプライムエンドに組み込まれたアダプター配列と内部定常領域配列をプライミングするネスト反応です。また、これらのプライマーは、PCR産物の5つのプライム末端と3つのプライム末端に独自の制限部位を組み込んで、その後のクローニングを容易にします。

テンプレートベクターにクローニングされると、エンコードされたTCR配列はキメラ体となり、ヒト変数領域とミラーリング定数領域で構成されます。キメラTCRコンストラクトは、TCRとミラーリングCD3シグナル伝達複合体との間の相互作用を可能にし、このTCRクローニングプロトコルをミラーリング細胞株およびヒト化マウスモデルにおけるその後の機能研究と適合させます。テンプレートフリーの清潔な領域で逆転写試薬を調製することにより、シングルセルソーティング用にセットアップします。

一般的に、シングルセルPCR法を初めて使用する人は、テンプレートのレベルが低いため、苦労します。一方、マルチプレックスネステッドPCRの感度は、低レベルのテンプレート汚染に敏感です。したがって、PCR反応を設定する領域を徹底的に洗浄する必要があります。

この反応では、アルファ鎖とベータ鎖の定常領域に特異的な3つのリバースプライマーの混合物が使用されます。逆転写マスターミックスは、ピペッティングリザーバーで試薬を組み合わせて調製します。ピペッティングエラーを考慮するために、10個のウェルを追加するのに十分な反応混合物を作成します。

マルチチャンネルを使用して、ウェルあたり6マイクロリットルを96ウェルPCRプレートにピペットで移します。プレートをシールでゆるく覆い、プレートを氷の上に保ちます。細胞表面マーカーに対する抗体で細胞を染色することにより、シングルセルソーティング用のT細胞を調製します。

T細胞をウェルごとに一度にソートし、12行を空のままにして、ネガティブコントロールとして機能します。プレートを粘着フィルムで密封し、1000gで4°Cで5分間回転させます。すぐに逆転写反応を実行します。

可能であれば、最初のPCR反応を同日に実施します。マルチプレックス反応を実行するには、ピペッティングリザーバーでV α PCRマスターミックスとV β PCRマスターミックスを別々に混合します。cDNAを含むプレートを氷上または冷たいブロックの上に置きます。

22.5マイクロリットルのTCRベータ反応を新しい96ウェルピースPCRプレートに移します。次に、マルチチャネルを使用して、2.5マイクロリットルのcDNAをPCRプレートに転写します。マルチチャンネルを使用して、22.5マイクロリットルのTCRアルファ反応を残りのcDNAを含むプレートに直接ピペットで挿入します。

プレートを接着剤で密封し、穏やかに渦巻き、短時間回転させます。最初のPCR反応を実行します。プレートは摂氏20度で保管できます。

翌日、2番目のネストされたPCR反応を準備します。マルチチャンネルを使用して、TCRアルファ反応とTCRベータ反応のマスターミックスをウェルあたり22.5マイクロリットルでピペットで2つの新しい96ウェルPCRプレートにピペットで送ります。マルチプレックスPCR反応テンプレートをウェルあたり2.5マイクロリットルで添加します。

プレートを密封し、ゆっくりとボルテックスし、短時間スピンダウンします。残りの最初のPCR反応液は、バックアップテンプレートの供給源として機能するために、密封して摂氏20度で保存する必要があります。2回目のPCR反応を行います。

2回目のネステッドPCR反応が完了したら、1%アガロースゲルで5マイクロリットルの反応液を使い果たします。ポジティブコントロールウェルとネガティブコントロールウェルを含めます。予想されるバンドは、約 500 塩基対のサイズで動作するはずです。

2番目の反応の残りの部分である20マイクロリットルを96ウェルフォーマットのPCR精製キットを使用して精製し、サンガーシーケンシングを行います。得られたTCR配列は、オンラインで利用可能な免疫遺伝学的ソフトウェアを使用して分析できます。配列情報を使用して、T細胞集団のレパトアとクローン性を評価できます。

ペアになったTCRのアルファ配列とベータ配列は、さらなる機能解析に使用できます。TCR beta と TCR alpha の連続ライゲーションをテンプレートベクターに実行します。テンプレートTCRベータとTCRアルファは、PCR増幅鎖に置き換えられます。

最初のライゲーションでは、テンプレートTCRベータがPCR増幅ベータ鎖に置き換えられます。TCRベータの正常な挿入がテスト消化インシーケンシングによって確認されたら、テンプレートTCRアルファをPCR増幅アルファ鎖に置き換えます。HEK293T細胞は、TCR鎖のペアリングと細胞表面発現の成功をテストするために使用されます。

HEK293T細胞は、アメトリン蛍光レポーターによってマークされたTCRベクターおよびGFPによってマークされたCD3複合体をコードするベクターと共トランスフェクトされます。キメラTCRの表面発現は、抗マウスCD3抗体で細胞を染色することにより、フローサイトメトリーによって検証されます。キメラTCRコンストラクトでトランスフェクトされた細胞における表面CD3発現のレベルは、完全にミラーリングされた制御テンプレートベクターでトランスフェクションされたものと同等であるべきです。

要約すると、シングルセルからペアになったTCR鎖を同定し、クローニングするための効率的なPCRベースのプロトコルについて説明しました。これは、自己免疫、腫瘍サーベイランス、および病原体の排除におけるヒトT細胞応答を研究するための貴重なツールになると期待しています。ここで説明するPCRプロトコルの主な利点は、その後のin vitroおよびin vivo研究との適合性です。