頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化
2017年9月7日
ここでは、血管形成生体内可視化するプロトコルを提案と多光子顕微鏡による 3 D 足場でリアルタイム。重要な性マウス頭蓋骨骨欠損モデルにおける血管新生遺伝子組み換え足場を調べた。コントロールの治療群よりもより新しい血管を認めた.
この実験の全体的な目標は、多光子顕微鏡によって、3次元足場でのIn Vivo血管形成をリアルタイムで視覚化することです。これらの測定は、3次元足場での生体内血管形成をリアルタイムに中和し、だます方法など、骨生成分野における重要な問題です。この技術の利点の1つは、CERES、細胞外メトリクス、および周囲の分子ネットワークをin vivoで同時に中和できることです。
まず、20グラムのPLGAと20ミリリットルの1,4ジオキサンを含む均質な溶液を調製します。次に、2グラムの粉末nHAPを溶液に加えます。マグネチックスターラーを使用して、懸濁液を室温で1500rpmで16時間激しく混合し、多孔質PLGA NHAP足場の印刷に使用される均一なペーストを形成します。
印刷したら、足場を48時間凍結乾燥させて、溶剤を完全に取り除きます。そして、それらを75パーセントのエタノールで1時間滅菌します。その後、もう一度液化して中性の防腐剤を入手します。
次に、レンチウイルス粒子の5分の1を各足場に4ポイント5×10を加え、摂氏37度を維持した加湿インキュベーターで粒子を2時間吸収させます。レンチウイルス粒子が足場に吸収されたので、2ミリリットルのPBSで足場を2回洗って、結合していない残留物を取り除きます。洗浄した足場を液体窒素でスナップ凍結します。
そして、もう一度脂肪化した後、さらなる研究のために摂氏マイナス80度でそれらを保存してください。1ミリリットルの完全DMEMを充填した2点ゼロミリリットルの極低温バイアルに緑色蛍光タンパク質を運ぶ5番目のレンチウイルス粒子に、4点5×10でコーティングした3Dスキャフォールドを移し、摂氏37度で5日間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションの12時間ごとに、足場から放出されたレンチウイルス粒子を含む培地の1ミリリットルのサンプルを採取し、それらを1ミリリットルの新鮮な培地と交換します。
HEK293T細胞を形質導入するには、まず12ウェルプレートで培養した細胞から培地HEK293T取り出し、PBSで細胞を2回洗浄します。次に、以前に収集した培地1ミリリットルを洗浄したHEK293T細胞に加え、加湿インキュベーターでプレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーションの48時間後、フローサイトメトリーでGFB陽性HEK293T細胞の数を測定し、生理活性レンチウイルス粒子の数を決定します。
まず、C57ブラック6マウスを、それぞれ14匹の動物のコントロール、PH、およびPHpの3つの治療グループにランダムに分けます。麻酔をかけたマウスの頭の上の皮膚を剃り、ヨウ素チンキ剤で表面を消毒し、次に75パーセントアルコール溶液で消毒します。マウスの頭を定位固定器具に入れ、メスで皮膚のサイズを決定し、はさみを使用して1センチメートルの直線的なカットを行います。
滅菌綿棒を使用して、頭蓋骨から骨膜をこすり落とし、その表面を明らかにします。次に、頭蓋骨の左側に、トレフィンバーを使用して直径4ミリメートルの臨界サイズの欠陥を作成します。足場を骨欠損の側面に移植します。
眼科用鉗子を使用して、手術部位を骨膜で優しく覆います。その後、切開部1センチごとに3針縫って傷口を閉じます。最後に、鎮痛剤のブプレノルフィンを投与して術後の痛みを抑え、動物を温熱パッドの上に置いて、目が覚めるまで体温を維持します。
マウスが意識を取り戻したら、餌と水を与え、実験が終了するまで日常の活動を監視します。TPEFおよびSHGイメージング用の多光子顕微鏡システムを組み立てた後、フェムト秒チタンサファイアレーザーを860ナノメートルに調整します。新たに形成された血管を可視化するには、生理食塩水に10ミリグラム/ミリリットルのデキストラン溶液を200マイクロリットルのマウスに静脈内注射し、定位装置を使用して、麻酔をかけた動物を加熱プレートに固定し、体温を摂氏37度に保ちます。
マウスに200マイクロリットルの生理食塩水を腹腔内に注入して、脱水症状を防ぎます。最後に、イメージング中に十分な麻酔と鎮痛を維持するために、100%酸素中のイソフルランの3%混合物を動物に供給します。イメージングを開始するには、一対のガルボミラーをスキャンして、512 x 512マイクロメートルのサンプリングエリアを作成します。
次に、NAワンポイントO水浸対物レンズを使用して、励起ビームをサンプルに集束させ、後方散乱したTPEF HSG信号を収集します。視野は、正常な骨領域と対照群の欠損部の端をカバーするように設定しますが、PHまたはPHp群から動物をイメージングする場合は、埋め込まれた足場のみをカバーします。次に、欠陥の5つの異なる場所をスキャンします。
2時間のイメージング期間にわたって12秒ごとに画像スタックを取得します。ここでは、3Dプリンティング技術で作製した足場の写真と、作製した材料の全体的な多孔性を示すマイクロCT画像を紹介します。足場の微多孔質構造は、5000倍の倍率で取得したSEM画像に示されています。
図示されているように、足場から放出されたレンチウイルス粒子を含む培地で処理されたHEK293T細胞は、緑色蛍光タンパク質を効率的に発現した。フローサイトメトリーによる推定では、放出された粒子の総数は約40%に達しました。最も強力な放出効果は、研究の最初の24時間以内に観察され、時間の経過とともに徐々に減少し、足場にコーティングされたレンチウイルス粒子が最大96時間生物学的活性を維持することが確認されました。
頭蓋骨欠損内に形成された血管のin vivo解析により、マウスの対照群では検出できなかった新しい血管が、足場移植の8週間後にPH群とPHp群の両方ではっきりと見えることが示されました。また、PH群とPHp群の両方で多くのコラーゲン沈着部位が検出されましたが、PHp群でのみ、足場に成長する小さな血管の数が増え、全体的な血管領域が有意に異なっていました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。
この手順を試行する際は、アーティファクトを避けるために、スキャン中にマウスの頭を固定して静止させることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、深部組織画像などの追加データを提供するために、光音響イメージングなどの他の方法を実行することができる。その開発後、この技術は、骨再生の分野の研究者が移植における血管新生を調査する道を開きました。
このビデオを見れば、3D足場でのin vivoプラズマ形成をリアルタイムで可視化する方法や、微小光子顕微鏡法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、3Dスキャフォールド内でマルチフォトン顕微鏡を使用して、血管形成をin vivoでリアルタイムで可視化するプロトコルを提示しています。研究は、マウス頭蓋骨欠損モデル内の遺伝子改変スキャフォールドにおける血管新生に焦点を当て、対照群と比較して処置群でより多くの新しい血管が観察されました。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 血管新生
背景
- 血管形成は組織工学と再生医療にとって重要です。
- 血管新生を理解することで、骨再生戦略を改善できます。
- マルチフォトン顕微鏡により、血管のダイナミクスをリアルタイムで可視化できます。
- 遺伝子改変スキャフォールドは血管新生反応に影響を与えることができます。
研究の目的
- 3Dスキャフォールド内でのin vivo血管形成を可視化する。
- 遺伝子改変スキャフォールドが血管新生に与える影響を評価する。
- 血管発達のリアルタイムイメージングにマルチフォトン顕微鏡を利用する。
使用された方法
- PLGAとnHAPの均一溶液の調製。
- 磁気撹拌機を使用して、スキャフォールド印刷用の均一なペーストを作成。
- リアルタイム可視化のためのマルチフォトン顕微鏡の実装。
- 処置群と対照群間での血管形成の比較。
主な結果
- 処置群で血管形成の増加が観察されました。
- リアルタイムイメージングは血管新生プロセスへの洞察を提供しました。
- このプロトコルはスキャフォールドの効果を成功裏に実証しました。
- 結果は組織工学における血管形成の理解に貢献します。
結論
- この研究は高度なイメージング技術を使用して、in vivo血管新生を成功裏に可視化しました。
- 遺伝子改変スキャフォールドは血管形成の増加を示しました。
- このアプローチは骨再生と組織工学のさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of angiogenesis within 3D biomaterial scaffolds addresses a critical bottleneck in bone tissue engineering by enabling direct assessment of vascular integration and scaffold performance. Multiphoton microscopy provides high-resolution, minimally invasive imaging to support predictive confidence in scaffold-driven bone regeneration. This capability informs early-stage portfolio decisions and de-risks translational advancement of engineered constructs for critical defect repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of angiogenic response to genetic scaffold modifications in vivo.
- Supports biological de-risking by visualizing vascular integration at the tissue–scaffold interface.
- Facilitates predictive confidence in scaffold design for regenerative applications.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D in vivo system for quantifying blood vessel formation in response to scaffold modifications.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs for comparative assessment of scaffold candidates.
- Supports standardization of angiogenesis assays for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold performance with disease-relevant vascularization endpoints in preclinical bone defect models.
- Enables continuity from discovery-stage scaffold optimization to preclinical validation of regenerative efficacy.
- Supports risk-adjusted advancement of scaffold technologies based on real-time vascularization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This multiphoton microscopy-based workflow bridges early discovery, scaffold optimization, and preclinical validation for bone regeneration programs.
- Discovery Biology: Visualizes and quantifies in vivo angiogenesis to clarify scaffold–host interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for candidate scaffold evaluation.
- Analytics: Provides volumetric and temporal data on blood vessel formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects scaffold design to preclinical vascularization and bone regeneration outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold-driven angiogenesis and bone repair.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging and quantification of vascularization in 3D scaffolds.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for scaffold advancement based on real-time biological integration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for critical defect repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy and in vivo imaging protocols.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and animal surgical facilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different scaffold materials or defect models.
- Imaging artifacts can arise from animal movement, requiring careful immobilization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Scaffold Preparation
7:00
Results: 3D Scaffolds Promote Angiogenesis in Bone Defects
8:33
Conclusion
3:51
Crtitical Bone Defect Model and Scaffold Transplantation
5:21
In Vivo Imaging of Angiogenesis within the Bone Defect
2:30
Lentivirus Particle Release and Transduction Capacity
