表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

このシンプルでありながら効果的な手順の全体的な目標は、表現型および機能分析のために磁性ナノ粒子を使用して、ヒト末梢血から希少な抗原結合B細胞を分離し、濃縮することです。この方法は、in-vivo抗原遭遇前とその後の希少抗原結合B細胞の表現型と生物学に関する免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特にスチレンプレートや大きなビーズを使用している場合に、ジオメトリに関連する問題を回避することです。

また、フローサイトメトリーで細胞を単離し、非常に大きな開始細胞集団の希少細胞を単離する際に、流量に関連する問題を回避します。30〜50ミリリットルの全血をヘパリン化採血チューブに集めた直後に、滅菌室温のマグネシウムとカルシウムフリーのPBSと1:1の割合で血液を混合します。次に、ゆっくりと一貫したピペットトリガー圧力を使用して、滅菌済みの50ミリリットルの円錐管内の10ミリリットルの室温密度勾配溶液に血液混合物を重ねます。

遠心分離により細胞を分離します。血漿と血小板を含む上層を廃棄し、滅菌ピペットを使用して、単核細胞容器のバフィーコートを新しい滅菌50ミリリットルチューブに移します。遠心分離による単核細胞の洗浄のために、チューブに最大50ミリリットルのPBSを充填します。

次に、ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁してカウントし、氷上の新鮮なPBSに細胞を10リットルあたり1x10 ^ 7の細胞濃度で再懸濁します。磁気ビーズ結合のために細胞を染色するには、まず、1-2x10^6細胞アリコートを5ミリリットルのポリスチレンチューブに移し、各蛍光補償および必要に応じて蛍光マイナス1コントロールを行います。次に、遠心分離により細胞サンプルの残りを回収し、ペレットを滅菌ろ過された冷FACS緩衝液中で3-6x10^7細胞/ミリリットル濃度に再懸濁します。

細胞溶液を氷上で4本のFACSチューブに均等に分割し、これらの4つの実験サンプル画分にヒトFcgamma受容体ブロッキング試薬を加えます。非特異的結合ブロッキングインキュベーションの終了時に、適切な蛍光標識細胞表面染色抗体を4つのサンプル画分すべての細胞に添加します。次に、適切なビオチン化抗原を画分AおよびDに添加し、続いて十分な量の非標識抗原を画分Bに添加して、少なくとも1x10^6モルの親和性を持つ受容体の大部分がブロックされるようにします。

すべてのサンプルを氷上で30分間インキュベートした後、フラクションBを適切なビオチン化抗原と30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、5x10^7細胞あたり1ミリリットルの氷冷FACS緩衝液で細胞を2回洗浄する。そして、ペレットを5x10^7細胞あたり2%ホルムアルデヒド1ミリリットルに氷上の暗闇で5分間再懸濁します。

固定後、先ほど示したように細胞をさらに2回洗浄します。そして、ペレットを5x10^7細胞あたり1ミリリットルの新鮮な氷冷FACS緩衝液に再懸濁します。次に、氷上で1〜2マイクログラムの適切な二次ストレプトアビジン標識抗体を暗所で20分間細胞に標識し、細胞をさらに2回洗浄します。

磁性ナノ粒子ベースの濃縮のためには、A、B、およびC細胞画分を5x10^7細胞あたり1ミリリットルの冷分離バッファーに再懸濁し、個々の40マイクロリットルストレーナで細胞をろ過して凝集体を除去します。次に、蛍光色素ナノ粒子を適切な濃度で4°Cの暗所で10分間回転しながら添加し、サンプルを1ミリリットルの冷分離バッファーで2回洗浄します。ペレットを5x10^7細胞あたり1ミリリットルの冷分離バッファーに再懸濁します。

次に、適切なサイズの磁石で3本の磁気カラムをそれぞれ3ミリリットルの分離バッファーで平衡化し、分離バッファーの全容積が各カラムを通過して廃棄物容器に入るようにします。次に、各カラムの下にラベル付きの15ミリリットルの円錐管を1本置き、磁性粒子で標識されたセルをそれぞれのカラムに追加します。各セル画分の全容量が各カラムを通過したら、各カラムの上部に3ミリリットルの新鮮な氷冷分離バッファーを追加し、ラベル付きチューブに廃液を回収します。

2回目の洗浄がカラムから完全に排出された後、各画分から陰性に選択された細胞のチューブを氷上に置き、各画分についてカラムを新しい15ミリリットルチューブに移します。各カラムに約6ミリリットルの新鮮な分離バッファーを充填し、すぐにバッファーをカラムに通して磁気結合細胞を回収します。次に、遠心分離によりポジティブセルフラクションとネガティブセルフラクションの両方を回収し、計画されたダウンストリーム分析に適した溶液にペレットを再懸濁します。

これらのグラフでは、破傷風に対して最後にワクチン接種された個体からの破傷風トキソイド反応性B細胞の頻度は、破傷風トキソイド結合細胞を約7倍に濃縮するために使用されるこの方法の能力を示しています約4%の純度で、採血の約3年前にワクチン接種を受けた被験者からの細胞に50倍過剰の非標識破傷風トキソイドを添加します。ビオチン化抗原を添加する前に、破傷風-トキソイド結合は83%減少し、抗原結合の特異性を示しています。ビオチン化抗原を手順から省略すると、B細胞の0.2%のみが結合しますが、これはおそらく、吸収剤中の非破傷風抗原の結合を反映しています。

これらのグラフは、健康な被験者のブースターワクチン接種の7日後に採取された血液サンプルからの破傷風トキソイド特異的ナイーブB細胞の頻度が、ブースター後に84%から64%に減少することを示しています。一方、記憶と血漿芽細胞の人口の割合は、それぞれ 16% から 36%、ゼロから 40% に増加します。さらに、健康な被験者からブーストの7日後に得られた末梢血サンプルからの代表的なELISPOTデータは、単離された破傷風トキソイド結合B細胞で観察された破傷風トキソイド抗体分泌細胞頻度の4倍の濃縮を示しています。

一度習得すると、このテクニックは、すべての適切なコントロールで約3〜4時間で完了することができます。この方法は、二次アッセイ、例えば、細胞の運命および機能のその後の研究のために、細胞を採用レシピエントに移す方法と組み合わせることができる。このビデオを見れば、適切なコントロールを使用してヒト末梢血から希少な抗原結合B細胞を分離し、濃縮する方法を十分に理解できるはずです。