Name: サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶサイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入法による患者由来異種移植片モデルでの外因性サイトカイン発現。週1回の腹腔内投与で持続的なサイトカイン供給を実現し、がん研究や造血機構の解明に有用です。

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この作業は、NIH R21CA162259、NIH R01CA209829、NIH P20 MD006988、NIH 2R25 GM060507、Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant、ロマリンダ大学医学部の病理学・人体解剖学部門、基礎科学部、健康格差・分子医学センター、およびロマリンダ大学(KJP)からの共同研究とトランスレーショナル研究を促進するための助成金によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿は、外因性ヒトサイトカインを発現するようにPDXを工学するための、単純で、迅速で、比較的費用対効果の高い方法を記載している。ここに記載されている戦略は、ヒトサイトカインであるTSLPを発現するように形質導入されたストローマ細胞株の毎週腹腔内注射に基づく。本明細書に記載の方法を実施する前に、高レベルの目的のサイトカイン（TSLP）を発現するように操作されたストローマおよび同様に操作された対照間質が生成された。ここに提示されるプロトコールでは、間質を培養中で増殖させ、経時的に（または対照間質の場合にはサイトカイン産生がない場合）安定した高レベルのサイトカイン産生を提供する能力についてスクリーニングする。ストローマ生成サイトカインの活性を検証するためのアッセイを実施し、生理的ヒトTSLP（およびヒトTSLPを欠く対照マウス）を用いてPDXを産生するために間質細胞注入の実験的タイムラインを開発した。ヒトTSLPの血漿レベルをモニターするための手順およびサイトカイン応答性細胞集団に対するインビボでのその機能的効果を確認するための実験を行った。 ここに提示されたプロト...

患者由来異種移植片（PDX）は、「ネイティブ」哺乳動物環境において正常および悪性の造血細胞の産生を研究するための強力なin vivoモデルである。ほとんどの場合、PDXはヒトの細胞を免疫不全マウスに注入または移植することによって産生される。正常なヒト造血幹細胞を用いたPDXの産生は、正常なヒト血液および免疫細胞発生のインビボ研究を可能にする 。白血病または他の癌細胞から産生されたPDXは、発癌機構を研究し、ヒト集団に存在する遺伝的景観および突然変異の範囲に関連して有効な治療法を同定することを可能にする。結果として、PDXは、効果的な治療法を特定するための翻訳生物医学研究の現在のゴールドスタンダードであり、癌進行のメカニズムを理解するための重要なツールです。 PDXモデルは、特定の要因による健康格差の病気の研究を支援するための不可欠なツールです<html>遺伝的病変、または患者の遺伝的景観の変化が発癌および治療結果に実質的に寄与し得る任意の疾患を含む。 多くのマウスサイトカインはマウスの中にある間にヒト細胞のサイトカイン受容体を活性化する際にヒト類似体を適切に模倣するので、マウス - ヒトPDXモデルが可能である。例えば、インターロイキン-7（IL-7）は、ヒトB細胞発生のための重要なシグナルを提供する。 2この場合、マウスIL-7は、マウスサイトカインがヒトB細胞前駆体のシグナル伝達経路を刺激するという、ヒトIL-7と十分な相同性を有する。 IL-3、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、幹細胞因子（SCF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の中でも特に、 、マウスおよびヒトサイトカインが低い相同性を示す場合、マウスサイトカインは、ヒト細胞上のそれぞれの受容体を活性化しない。この障害を克服するために、いくつかの戦略が使用されているPDXマウスにおけるヒトサイトカインの発現をエンジニアリングするために、組換えヒトサイトカインの注射、DNAの流体力学的注入、レンチウイルスの発現、トランスジェニック発現およびノックイン遺伝子の置換が含まれる。サイトカイン送達（ 図1 ）。 本明細書に示す方法において、PDXマウスは、ヒトサイトカイン、TSLPを発現するように、またはサイトカイン陰性対照として機能するように操作される。 TSLPを発現するPDXは、高レベルのヒトTSLPを発現するように形質導入された間質細胞の毎週腹腔内注射によって達成される。サイトカイン陰性PDX「対照」マウスも同様に操作される;対照間質は対照ベクターで形質導入される。この方法は、TSLP +間質を注射されたPDXマウスにおいてヒトTSLPの正常な生理学的レベルを達成する。サイトカイン陰性間質を受けるPDXマウスでは、検出可能なTSLPは観察されない。私たちは、ヒトの間質細胞株HS-27Aを培養で強く増殖し、共培養で単離した前駆細胞の増殖を支持しない非常に低いレベルのサイトカイン産生を示すので、本発明者らの研究に選択した。ヒトTSLP発現のために、間質には、先に説明した骨格9由来の先進的な自己不活性化レンチウイルスベクターを形質導入し、トランスジーン発現を増加させるためのcPPT / ctsエレメントおよびウッドチャック肝炎後転写調節エレメント（WPRE）を含む。ヒトTSLP遺伝子を伸長因子-1の制御下でこのベクターに構築した（EF-1）アルファプロモーターを使用して、強力な、構成的な、および長期の発現を達成する。 このヒト - サイトカイン増強PDXモデルの工学は、4つの主要なステップからなる。第1に、形質導入された間質をインビトロで拡大し 、安定した高レベルのサイトカイン産生のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価する。第二に、形質導入された間質細胞によって産生されたヒトサイトカインの活性（および対照間質からのサイトカイン活性の欠如）は、リン - フローサイトメトリーを用いて検証される。目的のサイトカイン（この例では、TSLP）に応答することが知られている細胞株を間質細胞上清と共にインキュベートし、サイトカイン誘導リン酸化についてアッセイする。第3に、形質導入されたヒト間質をマウスに注射し、次いで、マウス血漿をELISAによってヒトサイトカインのレベルについて毎週評価する。第4に、ヒト造血細胞を移植し、ヒトサイトカインのインビボでの機能的効果を、既知の標的（例えば、 <em&gt;例えば。細胞集団）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> 図1：マウスの外因性ヒトサイトカインを産生するように設計されたPDXモデル。 （ 1A ）設計実験および形質導入ヒト間質細胞の取得（ 1B ）ヒト細胞（造血幹細胞、白血病細胞など ）を入手してPDX（患者由来異種移植片）マウスを作製する。 （ 2A ）操作された間質を注入し、（ 2B ）ヒト細胞を実験スケジュールに従って免疫不全マウスに移植する。 （ 3A-B ）ストロマ上清およびマウス血漿中のサイトカイン濃度をELISAでモニターする。 （ 4 ）ヒト細胞を採取し、PDX中に存在するヒトサイトカインのin vivo機能的効果を評価する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">ここをクリックしてください</a>この図のより大きなバージョンを表示します。 間質細胞を介するヒトサイトカインの送達は、PDXマウスにおいてヒトサイトカインを送達/産生する他の方法と比較した場合、長所と短所の両方を提供する。ストローマ媒介性送達は、組換えヒトサイトカインの注射と比較して、一般に安価であり（間質細胞培養のコストは組換えサイトカインのコストよりも低い）、労働集約性はより低い（1週間に1回の注射と週に複数回の注射）。間質は外因性サイトカインを絶え間なく産生するので、短いサイトカイン半減期の問題も緩和される。 DNAの流体力学的注入によるサイトカインの送達は、間質を介する送達よりも安価であり得る。しかし、それは同様に一過性であり、間質媒介性送達に必要とされる単純な週1回の腹腔内注射よりも多くの技術的能力を必要とすることがある。マウスにおけるレンチウイルス遺伝子発現は、サイトカイン送達の新しい方法;しかし、私たちの手で生理学的TSLPレベルは達成されなかった。さらに、この方法は労働集約的であり、レンチウイルスベクターの連続生産を必要とする。トランスジェニックまたはノックインマウスは、サイトカインの安定した長期発現を提供し、組織特異的発現のために操作することができ、これは利点となり得る。他方、PDXマウスに必要な免疫不全マウスのバックグラウンド上のヒトサイトカイン遺伝子のトランスジェニック発現は、モデルの価値が確立される前に、膨大なリソースの投資を必要とする。さらに、トランスジェニックモデルは、一般に、サイトカイン開始のタイミングまたはインビボサイトカイン産生のレベルを変化させる選択肢を許容しない。これらは、間質細胞注入の開始時期または注入された間質細胞の用量を単に変化させることによって、間質媒介性送達によって達成することができる。 間質細胞媒介サイトカイン送達法本明細書中に詳述されたものは、正常なヒトB細胞発生4,6および高リスクB細胞急性リンパ芽球性白血病におけるTSLPの役割を評価するためのPDXを開発するために使用された。この方法は、TSLP以外のヒトサイトカインで類似のモデルを作製する際に使用するための代替サイトカイン送達方法を提供する。このモデルはまた、サイトカイントランスジェニックまたはサイトカインノックインPDXモデルの価値が相当な時間と費用を投資する価値があるかどうかを判断するのに役立つ予備的データを生成するのに有用であり得る。

<table><tbody><tr><td>ウェットラボ用試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL 容量,&nbsp; 25cm&sup2; 培養エリア</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm&sup2; 培養エリア & ベントキャップ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Tissue Culture処理フラスコ、容量600 mL、150 cm&sup2;カルチャーエリア&ベントキャップ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; ポリプロピレン円錐形チューブ</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレンチューブ</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン円錐形チューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 極低温バイアル, おねじ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ピペットチップ</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;Lピペットチップ&nbsp;</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;Lピペットチップ</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>滅菌使い捨てフィルターユニット、SFCAメンブレン、Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp;</サブ></td><td>バイオレジェンド</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ」カリシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1回。</td><td>コーニング セルグロ/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% 酢酸 with メチレンブルー</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>25-900-CL</td><td></td></tr><tr><td>「トリプシン」 1x 0.25% トリプシン 2.21 mM EDTA HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>」R10インチ細胞培養培地、全容量の% (565 mL) (565 mL) </td><td>-</td><td>-</strong</td><td>>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88.5% (500 mL)&nbsp;</td><td>メディアテック</td><td>10-040-CV&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS、9.9%(56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、0.99% (5.6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、0.50% (2.8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール、0.10% (560 &micro;L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>」R20インチ細胞培養培地、全容量の割合(195 mL)</td><td>--</td><td></td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;RPMI、76.84%(150&nbsp; mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;FBS、20.49%(40 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;2mM L-グルタミン、1.02%(2 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;1 mM Naピルビン酸、1.02%(2 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ペニシリン-ストレプトマイシン、&nbsp;0.51%(1 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;2-メルカプトエタノール、0.10% (0.1 M)、&nbsp;0.10%(200 &micro;L)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>"凍結媒体」、「総体積の割合</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>"R10インチ中、45%</td><td>「R10」レシピ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBSを参照、20%</td><td>上記</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSOを参照、10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-トレハロース二水和物、5%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>"HS-27" HS-27A ヒト間質株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr> <tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 細胞株、ヒト B 細胞前駆体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr> <tr><td>"NSGマウス」頷く。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、男性または女性、6歳 &ndash;8週間</td><td>JAXマウス&nbsp;</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5細胞株、ヒトB細胞前駆体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr>組<tr><td>換えヒトTSLPタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Flow cytomery antibodies (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (別名はIL-7R&alpha;)</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC(8G12)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp;(ハイ30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" 固定生存率色素&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa;軽鎖FITC&nbsp;(G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig & lambda; light chain FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; マウス抗STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の資料&機器&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canula Trovan付き動物用埋め込み型ナノトランスポンダー</td><td>&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLAリドカイン麻酔クリーム(動物飼育施設を通じて処方することにより取得)</td><td>処方</td>罹<td>患</td><td></td></tr><tr><td>BD&frac12; cc LO-DOSE U-100インスリン注射器28G&frac12;&nbsp;</td><td>BD#</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>BDマイクロテーナーチューブ K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アレグラ X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand毛細管(ヘパリン化)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Pie Cage</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>マウステールイルミネーター レストレイン</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック社</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>ピストルグリップインプランター</td><td>トロバン&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&マイクロ;クォンツ&nbsp;</td><td>バイオテック・インスツルメンツ株式会社</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>*特に記載のない限り、すべての抗体は抗ヒトです。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

患者由来の異種移植片（PDX）マウスは、ヒト細胞を免疫不全マウスに移植することによって産生される。これらのモデルは、正常および悪性の造血のメカニズムを研究するための重要なツールであり、多くの悪性腫瘍の有効な化学療法を特定するためのゴールドスタンダードです。多くのマウスサイトカインもまたヒト細胞に作用するので、PDXモデルが可能である。しかし、これは、ヒト細胞の正常および悪性造血を研究するために重要な多くを含む、すべてのサイトカインの場合ではない。ヒトサイトカイン（トランスジェニックモデルおよびノックインモデル）を産生するようにマウスを操作する技術は、モデルの有用性が証明されるまでにかなりの経費を必要とする。他の技術は、労働集約的（組換えサイトカインまたはレンチウイルスの注射）であり、場合によっては、高度な技術的専門知識（DNAの流体力学的注射）を必要とする。このレポートは、外因性のヒトcyを有するPDXマウスを生成するための簡単な方法を記載しているこのサイトカインを過剰発現するように形質導入された間質の週1回の腹腔内注射を介して 、トキソプラズマ（TSLP、胸腺間質リンパ球ポエチン）この方法の使用はマウスの循環ヒトサイトカインの生理学的レベルを達成する連続サイトカイン産生のインビボ供給源を提供する。ヒトサイトカインの血漿レベルは、注入された間質細胞の数に基づいて変化させることができ、サイトカイン産生を実験の任意の時点で開始することができる。この方法はまた、同様に産生されるが、対照ベクターで形質導入された間質の腹腔内注射によって、サイトカイン陰性対照マウスを含む。我々は以前に、対照PDXと比較してTSLPを発現するPDXから採取した白血病細胞が元の患者のサンプルよりも遺伝子発現パターンを示すことを実証した。一緒に、この方法によって生成されたサイトカイン産生およびサイトカイン陰性PDXマウスは、我々が正常に使用したモデル系を提供する正常および悪性造血におけるTSLPの役割。

モデルの概要を図1に示します。サイトカイン産生（TSLP +間質）およびコントロールストロマが得られたら、それらを培養で増殖させる。マウスにストローマを注入する前に、間質細胞上清をELISAで評価してサイトカイン産生を確認し（ 図2 ）、ホスホフローサイトメトリー（Protocol＃3）を用いて間質によって産生されるサイトカインの活性を確認する。細胞を継代すると、コンフルエント間質細胞培養物（対照支質およびTSLP +間質）から上清が収集される。 ELISAを用いて、初期、中期および後期継代の間に少なくとも1回、上清中のTSLPの濃度をモニターする。対照間質由来の代表的なデータを図2Aに示す 。 TSLPの発現を示すストローマ細胞培養物（およびそれらから冷凍されたバイアル）は廃棄する必要があります。検出されないTSLPを有する対照培養物は、将来の使用のために拡大および凍結される。図2Bに示すように、低レベルのTSLP産生を示すTSLP +...

ここで、サイトカイン形質導入間質細胞株の毎週腹腔内注射による患者由来異種移植（PDX）マウスにおける外因性サイトカインの産生方法を記載する。この方法は、PDXの有用性を広げ、多数のPDXモデルにおける一過性または持続性外因性サイトカイン送達の選択肢を提供する。

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

この手順の最終的な目的は、ヒトサイトカインが循環しているゼノグラフトマウスを作製することです。この手法は、「正常および悪性リンパ球の分化において、特定のサイトカインはどのような役割を果たすか」といった、癌および造血分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、研究者が実験の必要に応じて、ゼノグラフト動物における外来性サイトカインの循環濃度を調節できることです。これにより、高コストで新規のトランスジェニックマウス系統を作製する必要がなくなります。この前臨床モデルは、臨床で用いられている方法と同様に抗がん剤の試験に使用できるため、新しいがん治療法の研究に有用です。本手法は正常な造血に関する知見を提供できるだけでなく、白血病などの特定の疾患の研究にも活用可能です。私は、正常および悪性ヒトB細胞の産生におけるTSLPサイトカインの役割を評価するためのin vivoモデルが必要になった際に、初めてこのアイデアを考案しました。まず、解凍したばかりのコントロール空ベクトル導入ストロマおよびサイトカイン産生細胞を、個別のT25フラスコ内の5 mLのR-10培地に播種します。その後、37°C、5% CO2条件下で24〜48時間培養します。ストローマ細胞がコンフルエントになったら、EDTA含有トリプシンを用いて細胞を剥離し、T150培養フラスコに再播種して3〜4日間培養します。T150フラスコ内でストローマ細胞がコンフルエントに達したら、上清を回収し、後でELISAによりサイトカイン産生を評価するため、-80°Cで凍結保存します。その後、各T150フラスコの培養物を3つの新しいT150フラスコに継代し、コンフルエントになるまで培養します。適切な継代数の後で細胞を保存するには、回収した細胞懸濁液を遠心分離用のコニカルチューブに移し、ペレットを凍結保存用培地で再懸濁します。その後、1.5E6個ずつの細胞分注液を長期保存チューブに移し、液体窒素中で保存します。構築したストローマから産生された上清を検証するには、コントロールおよびサイトカイン発現ストローマから回収した上清サンプルを融解し、条件ごとに白血病細胞株を3ウェル分、Au-20培地を用いて96ウェル組織培養プレートに2E5 cells/wellの濃度で播種します。細胞を37°Cで2時間インキュベートし、以前の培養によるリン酸化を消失させます。その後、各ウェルから細胞を個別の4 mLチューブに移し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを実験条件あたり600 µLで再懸濁します。各条件について、1ウェルあたり200 µLの細胞を3連で播種します。使用する市販のリン酸化アッセイの規定に従い、適切な期間細胞をインキュベートします。インキュベーション終了後、遠心分離により細胞をペレット化します。製造元のプロトコルに従って、ホスホフローサイトメトリー染色により細胞を標識します。次に、標準的なフローサイトメトリー解析プロトコルを用いて細胞を解析し、ストローマ上清中のサイトカインが白血病細胞をリン酸化させることを確認します。解凍後最低3回の継代を経て、回収したストローマ細胞懸濁液を計数用に個別のコニカルチューブに移します。遠心分離によって細胞をペレット化し、注射に適した量の滅菌PBSで緩やかに再懸濁します。注射の直前まで細胞を4°Cで保持し、その時点で懸濁液を少なくとも室温まで温めてください。細胞の準備が整ったら、最初のサンプルを転倒混和で緩やかに混ぜ、200 µLの細胞を結核用注射器で吸引します。次に、1匹目の動物を固定し、標準的な腹腔内投与の手法を用いて細胞を腹腔内に注入します。末梢血サンプルを採取するには、まずマウスを消毒済みの小型動物用拘束具に静かに配置し、動物の動きを最小限に抑えるようチューブを固定します。次に、尾を新鮮なイソプロピルアルコールで清拭し、続いて局所麻酔クリームを塗布します。非常に鋭い外科用鋏を用いて、尾の先端から約5～1 mmを切り取り、ヘパリン処理済みのキャピラリーチューブに末梢血を約80 µL採取します。バルブシリンジを使用して、血液サンプルをラベル付きのカリウムEDTAマイクロテイナーチューブに移し、凝固を防ぐためチューブを20回転倒混和します。製造元の指示に従って採血管を遠心分離した後、血漿層を慎重に回収し、血漿を分注して-20 °Cで保存します。ELISA実施当日に、凍結したマウス血漿サンプルを融解し、ELISA標準液を120 µL量に段階希釈します。次に、各標準液 40 µLをELISAプレートの適切なウェルに3連（triplicate）で分注し、続いて各マウス血漿サンプル 40 µLを適切なウェルに分注します。その後、製造者の指示に従ってELISA分析を完了させます。マウスに放射線を照射して24時間後、異種移植用のヒト造血細胞を調製します。造血細胞を滅菌PBSで再懸濁する際は、移植中に液をこぼした場合に備え、15〜20%ほど多めに調製しておくことが推奨されます。細胞は移植まで4°Cで保持し、最初のレシピエント動物は、尾静脈の拡張を促進するために、少なくとも5分間加温ケージに入れておきます。次に、細胞を室温まで温めます。細胞懸濁液を静かに混ぜ、ツベルクリン注射器で200 µLを吸引します。マウスを保定器に入れ、尾部をイソプロピルアルコールで消毒します。細胞を側尾静脈に注入します。その後、移植に関連する副作用がないことを確認するため、少なくとも5分間マウスを観察します。コントロールストローマを注入した患者由来異種移植（PDX）動物では、マウス血漿中のヒト胸腺ストローマリンフォポエチン（TSLP）レベルが一貫してELISA検出限界以下であることが示されています。TSLPを導入したストローマを注入したPDXマウスにおけるヒトTSLPの血漿レベルは、過去1〜2週間に注入されたTSLPストローマ細胞の量に比例します。単回測定で実施しているものの、改変ELISAを用いたこの週次の血漿TSLPレベル評価により、概ね経時的に一貫した結果が得られます。TSLPは、正常なヒトB細胞前駆細胞の産生を増加させることが示されています。実際、TSLP-plusマウスでは、B細胞前駆体ステージという早い段階から、対照群のPDX動物と比較してB系統細胞が著しく増加しており、TSLP-plus PDX動物で産生されたヒトTSLPが、標的細胞集団に対して期待通りのin vivoでの機能的効果を及ぼしていることが示唆されます。これらの手順を最適化すれば、3〜4週間で検出可能なレベルのヒトサイトカインを持つゼノグラフトマウスを作製することが可能です。ストローマ細胞の上清中のサイトカイン濃度を、経時的にモニタリングすることが重要です。これにより、サイトカイン産生ストロマではサイトカイン産生が維持され、コントロールストロマでは欠如することが保証されます。PDXマウスは、例えば「in vivoで特定の実験的サイトカインの生理的レベルを変化させた場合、目的の薬物の有効性はどのように変化するか」といった追加の疑問を解決するための前臨床研究に使用できます。この革新的なモデルは、血液学および腫瘍学分野の研究者が、白血病の発症および進行におけるTSLPの役割、ならびに正常な造血におけるその役割を研究するための新しい手法を提供します。サイトカイン導入細胞株を利用できれば、本ビデオで実演した手法を用いて、広範な免疫不全マウス系統を用いた患者由来異種移植（PDX）疾患モデルに、任意の外来性サイトカインを投与することができます。ヒト造血細胞を取り扱う際は危険が伴うため、注意が必要です。これらの体液および細胞を取り扱う際は、血液媒介性病原体の伝播を避けるため、常に予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

のための効率的なプロトコル...

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学ぶサイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入法による患者由来異種移植片モデルでの外因性サイトカイン発現。週1回の腹腔内投与で持続的なサイトカイン供給を実現し、がん研究や造血機構の解明に有用です。

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

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