Name: サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶサイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入法による患者由来異種移植片モデルでの外因性サイトカイン発現。週1回の腹腔内投与で持続的なサイトカイン供給を実現し、がん研究や造血機構の解明に有用です。

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この作業は、NIH R21CA162259、NIH R01CA209829、NIH P20 MD006988、NIH 2R25 GM060507、Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant、ロマリンダ大学医学部の病理学・人体解剖学部門、基礎科学部、健康格差・分子医学センター、およびロマリンダ大学(KJP)からの共同研究とトランスレーショナル研究を促進するための助成金によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿は、外因性ヒトサイトカインを発現するようにPDXを工学するための、単純で、迅速で、比較的費用対効果の高い方法を記載している。ここに記載されている戦略は、ヒトサイトカインであるTSLPを発現するように形質導入されたストローマ細胞株の毎週腹腔内注射に基づく。本明細書に記載の方法を実施する前に、高レベルの目的のサイトカイン（TSLP）を発現するように操作されたストローマおよび同様に操作された対照間質が生成された。ここに提示されるプロトコールでは、間質を培養中で増殖させ、経時的に（または対照間質の場合にはサイトカイン産生がない場合）安定した高レベルのサイトカイン産生を提供する能力についてスクリーニングする。ストローマ生成サイトカインの活性を検証するためのアッセイを実施し、生理的ヒトTSLP（およびヒトTSLPを欠く対照マウス）を用いてPDXを産生するために間質細胞注入の実験的タイムラインを開発した。ヒトTSLPの血漿レベルをモニターするための手順およびサイトカイン応答性細胞集団に対するインビボでのその機能的効果を確認するための実験を行った。 ここに提示されたプロト...

患者由来異種移植片（PDX）は、「ネイティブ」哺乳動物環境において正常および悪性の造血細胞の産生を研究するための強力なin vivoモデルである。ほとんどの場合、PDXはヒトの細胞を免疫不全マウスに注入または移植することによって産生される。正常なヒト造血幹細胞を用いたPDXの産生は、正常なヒト血液および免疫細胞発生のインビボ研究を可能にする 。白血病または他の癌細胞から産生されたPDXは、発癌機構を研究し、ヒト集団に存在する遺伝的景観および突然変異の範囲に関連して有効な治療法を同定することを可能にする。結果として、PDXは、効果的な治療法を特定するための翻訳生物医学研究の現在のゴールドスタンダードであり、癌進行のメカニズムを理解するための重要なツールです。 PDXモデルは、特定の要因による健康格差の病気の研究を支援するための不可欠なツールです<html>遺伝的病変、または患者の遺伝的景観の変化が発癌および治療結果に実質的に寄与し得る任意の疾患を含む。 多くのマウスサイトカインはマウスの中にある間にヒト細胞のサイトカイン受容体を活性化する際にヒト類似体を適切に模倣するので、マウス - ヒトPDXモデルが可能である。例えば、インターロイキン-7（IL-7）は、ヒトB細胞発生のための重要なシグナルを提供する。 2この場合、マウスIL-7は、マウスサイトカインがヒトB細胞前駆体のシグナル伝達経路を刺激するという、ヒトIL-7と十分な相同性を有する。 IL-3、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、幹細胞因子（SCF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の中でも特に、 、マウスおよびヒトサイトカインが低い相同性を示す場合、マウスサイトカインは、ヒト細胞上のそれぞれの受容体を活性化しない。この障害を克服するために、いくつかの戦略が使用されているPDXマウスにおけるヒトサイトカインの発現をエンジニアリングするために、組換えヒトサイトカインの注射、DNAの流体力学的注入、レンチウイルスの発現、トランスジェニック発現およびノックイン遺伝子の置換が含まれる。サイトカイン送達（ 図1 ）。 本明細書に示す方法において、PDXマウスは、ヒトサイトカイン、TSLPを発現するように、またはサイトカイン陰性対照として機能するように操作される。 TSLPを発現するPDXは、高レベルのヒトTSLPを発現するように形質導入された間質細胞の毎週腹腔内注射によって達成される。サイトカイン陰性PDX「対照」マウスも同様に操作される;対照間質は対照ベクターで形質導入される。この方法は、TSLP +間質を注射されたPDXマウスにおいてヒトTSLPの正常な生理学的レベルを達成する。サイトカイン陰性間質を受けるPDXマウスでは、検出可能なTSLPは観察されない。私たちは、ヒトの間質細胞株HS-27Aを培養で強く増殖し、共培養で単離した前駆細胞の増殖を支持しない非常に低いレベルのサイトカイン産生を示すので、本発明者らの研究に選択した。ヒトTSLP発現のために、間質には、先に説明した骨格9由来の先進的な自己不活性化レンチウイルスベクターを形質導入し、トランスジーン発現を増加させるためのcPPT / ctsエレメントおよびウッドチャック肝炎後転写調節エレメント（WPRE）を含む。ヒトTSLP遺伝子を伸長因子-1の制御下でこのベクターに構築した（EF-1）アルファプロモーターを使用して、強力な、構成的な、および長期の発現を達成する。 このヒト - サイトカイン増強PDXモデルの工学は、4つの主要なステップからなる。第1に、形質導入された間質をインビトロで拡大し 、安定した高レベルのサイトカイン産生のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価する。第二に、形質導入された間質細胞によって産生されたヒトサイトカインの活性（および対照間質からのサイトカイン活性の欠如）は、リン - フローサイトメトリーを用いて検証される。目的のサイトカイン（この例では、TSLP）に応答することが知られている細胞株を間質細胞上清と共にインキュベートし、サイトカイン誘導リン酸化についてアッセイする。第3に、形質導入されたヒト間質をマウスに注射し、次いで、マウス血漿をELISAによってヒトサイトカインのレベルについて毎週評価する。第4に、ヒト造血細胞を移植し、ヒトサイトカインのインビボでの機能的効果を、既知の標的（例えば、 <em&gt;例えば。細胞集団）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> 図1：マウスの外因性ヒトサイトカインを産生するように設計されたPDXモデル。 （ 1A ）設計実験および形質導入ヒト間質細胞の取得（ 1B ）ヒト細胞（造血幹細胞、白血病細胞など ）を入手してPDX（患者由来異種移植片）マウスを作製する。 （ 2A ）操作された間質を注入し、（ 2B ）ヒト細胞を実験スケジュールに従って免疫不全マウスに移植する。 （ 3A-B ）ストロマ上清およびマウス血漿中のサイトカイン濃度をELISAでモニターする。 （ 4 ）ヒト細胞を採取し、PDX中に存在するヒトサイトカインのin vivo機能的効果を評価する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">ここをクリックしてください</a>この図のより大きなバージョンを表示します。 間質細胞を介するヒトサイトカインの送達は、PDXマウスにおいてヒトサイトカインを送達/産生する他の方法と比較した場合、長所と短所の両方を提供する。ストローマ媒介性送達は、組換えヒトサイトカインの注射と比較して、一般に安価であり（間質細胞培養のコストは組換えサイトカインのコストよりも低い）、労働集約性はより低い（1週間に1回の注射と週に複数回の注射）。間質は外因性サイトカインを絶え間なく産生するので、短いサイトカイン半減期の問題も緩和される。 DNAの流体力学的注入によるサイトカインの送達は、間質を介する送達よりも安価であり得る。しかし、それは同様に一過性であり、間質媒介性送達に必要とされる単純な週1回の腹腔内注射よりも多くの技術的能力を必要とすることがある。マウスにおけるレンチウイルス遺伝子発現は、サイトカイン送達の新しい方法;しかし、私たちの手で生理学的TSLPレベルは達成されなかった。さらに、この方法は労働集約的であり、レンチウイルスベクターの連続生産を必要とする。トランスジェニックまたはノックインマウスは、サイトカインの安定した長期発現を提供し、組織特異的発現のために操作することができ、これは利点となり得る。他方、PDXマウスに必要な免疫不全マウスのバックグラウンド上のヒトサイトカイン遺伝子のトランスジェニック発現は、モデルの価値が確立される前に、膨大なリソースの投資を必要とする。さらに、トランスジェニックモデルは、一般に、サイトカイン開始のタイミングまたはインビボサイトカイン産生のレベルを変化させる選択肢を許容しない。これらは、間質細胞注入の開始時期または注入された間質細胞の用量を単に変化させることによって、間質媒介性送達によって達成することができる。 間質細胞媒介サイトカイン送達法本明細書中に詳述されたものは、正常なヒトB細胞発生4,6および高リスクB細胞急性リンパ芽球性白血病におけるTSLPの役割を評価するためのPDXを開発するために使用された。この方法は、TSLP以外のヒトサイトカインで類似のモデルを作製する際に使用するための代替サイトカイン送達方法を提供する。このモデルはまた、サイトカイントランスジェニックまたはサイトカインノックインPDXモデルの価値が相当な時間と費用を投資する価値があるかどうかを判断するのに役立つ予備的データを生成するのに有用であり得る。

<table><tbody><tr><td>ウェットラボ用試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL 容量,&nbsp; 25cm&sup2; 培養エリア</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm&sup2; 培養エリア & ベントキャップ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Tissue Culture処理フラスコ、容量600 mL、150 cm&sup2;カルチャーエリア&ベントキャップ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; ポリプロピレン円錐形チューブ</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレンチューブ</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン円錐形チューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 極低温バイアル, おねじ</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ピペットチップ</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;Lピペットチップ&nbsp;</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;Lピペットチップ</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>滅菌使い捨てフィルターユニット、SFCAメンブレン、Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp;</サブ></td><td>バイオレジェンド</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ」カリシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1回。</td><td>コーニング セルグロ/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% 酢酸 with メチレンブルー</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>25-900-CL</td><td></td></tr><tr><td>「トリプシン」 1x 0.25% トリプシン 2.21 mM EDTA HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>」R10インチ細胞培養培地、全容量の% (565 mL) (565 mL) </td><td>-</td><td>-</strong</td><td>>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88.5% (500 mL)&nbsp;</td><td>メディアテック</td><td>10-040-CV&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS、9.9%(56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、0.99% (5.6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、0.50% (2.8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール、0.10% (560 &micro;L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>」R20インチ細胞培養培地、全容量の割合(195 mL)</td><td>--</td><td></td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;RPMI、76.84%(150&nbsp; mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;FBS、20.49%(40 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;2mM L-グルタミン、1.02%(2 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;1 mM Naピルビン酸、1.02%(2 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ペニシリン-ストレプトマイシン、&nbsp;0.51%(1 mL)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;2-メルカプトエタノール、0.10% (0.1 M)、&nbsp;0.10%(200 &micro;L)</td><td>上記参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>"凍結媒体」、「総体積の割合</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>"R10インチ中、45%</td><td>「R10」レシピ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBSを参照、20%</td><td>上記</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSOを参照、10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-トレハロース二水和物、5%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>"HS-27" HS-27A ヒト間質株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr> <tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 細胞株、ヒト B 細胞前駆体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr> <tr><td>"NSGマウス」頷く。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、男性または女性、6歳 &ndash;8週間</td><td>JAXマウス&nbsp;</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5細胞株、ヒトB細胞前駆体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr>組<tr><td>換えヒトTSLPタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Flow cytomery antibodies (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (別名はIL-7R&alpha;)</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC(8G12)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp;(ハイ30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" 固定生存率色素&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa;軽鎖FITC&nbsp;(G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig & lambda; light chain FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; マウス抗STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>Catolog番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の資料&機器&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canula Trovan付き動物用埋め込み型ナノトランスポンダー</td><td>&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLAリドカイン麻酔クリーム(動物飼育施設を通じて処方することにより取得)</td><td>処方</td>罹<td>患</td><td></td></tr><tr><td>BD&frac12; cc LO-DOSE U-100インスリン注射器28G&frac12;&nbsp;</td><td>BD#</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>BDマイクロテーナーチューブ K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アレグラ X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand毛細管(ヘパリン化)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Pie Cage</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>マウステールイルミネーター レストレイン</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック社</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>ピストルグリップインプランター</td><td>トロバン&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&マイクロ;クォンツ&nbsp;</td><td>バイオテック・インスツルメンツ株式会社</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>*特に記載のない限り、すべての抗体は抗ヒトです。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

患者由来の異種移植片（PDX）マウスは、ヒト細胞を免疫不全マウスに移植することによって産生される。これらのモデルは、正常および悪性の造血のメカニズムを研究するための重要なツールであり、多くの悪性腫瘍の有効な化学療法を特定するためのゴールドスタンダードです。多くのマウスサイトカインもまたヒト細胞に作用するので、PDXモデルが可能である。しかし、これは、ヒト細胞の正常および悪性造血を研究するために重要な多くを含む、すべてのサイトカインの場合ではない。ヒトサイトカイン（トランスジェニックモデルおよびノックインモデル）を産生するようにマウスを操作する技術は、モデルの有用性が証明されるまでにかなりの経費を必要とする。他の技術は、労働集約的（組換えサイトカインまたはレンチウイルスの注射）であり、場合によっては、高度な技術的専門知識（DNAの流体力学的注射）を必要とする。このレポートは、外因性のヒトcyを有するPDXマウスを生成するための簡単な方法を記載しているこのサイトカインを過剰発現するように形質導入された間質の週1回の腹腔内注射を介して 、トキソプラズマ（TSLP、胸腺間質リンパ球ポエチン）この方法の使用はマウスの循環ヒトサイトカインの生理学的レベルを達成する連続サイトカイン産生のインビボ供給源を提供する。ヒトサイトカインの血漿レベルは、注入された間質細胞の数に基づいて変化させることができ、サイトカイン産生を実験の任意の時点で開始することができる。この方法はまた、同様に産生されるが、対照ベクターで形質導入された間質の腹腔内注射によって、サイトカイン陰性対照マウスを含む。我々は以前に、対照PDXと比較してTSLPを発現するPDXから採取した白血病細胞が元の患者のサンプルよりも遺伝子発現パターンを示すことを実証した。一緒に、この方法によって生成されたサイトカイン産生およびサイトカイン陰性PDXマウスは、我々が正常に使用したモデル系を提供する正常および悪性造血におけるTSLPの役割。

モデルの概要を図1に示します。サイトカイン産生（TSLP +間質）およびコントロールストロマが得られたら、それらを培養で増殖させる。マウスにストローマを注入する前に、間質細胞上清をELISAで評価してサイトカイン産生を確認し（ 図2 ）、ホスホフローサイトメトリー（Protocol＃3）を用いて間質によって産生されるサイトカインの活性を確認する。細胞を継代すると、コンフルエント間質細胞培養物（対照支質およびTSLP +間質）から上清が収集される。 ELISAを用いて、初期、中期および後期継代の間に少なくとも1回、上清中のTSLPの濃度をモニターする。対照間質由来の代表的なデータを図2Aに示す 。 TSLPの発現を示すストローマ細胞培養物（およびそれらから冷凍されたバイアル）は廃棄する必要があります。検出されないTSLPを有する対照培養物は、将来の使用のために拡大および凍結される。図2Bに示すように、低レベルのTSLP産生を示すTSLP +...

ここで、サイトカイン形質導入間質細胞株の毎週腹腔内注射による患者由来異種移植（PDX）マウスにおける外因性サイトカインの産生方法を記載する。この方法は、PDXの有用性を広げ、多数のPDXモデルにおける一過性または持続性外因性サイトカイン送達の選択肢を提供する。

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

この手順の最終的な目的は、ヒトサイトカインが循環しているゼノグラフトマウスを作製することです。この手法は、「正常および悪性リンパ球の分化において、特定のサイトカインはどのような役割を果たすか」といった、癌および造血分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、研究者が実験の必要に応じて、ゼノグラフト動物における外来性サイトカインの循環濃度を調節できることです。これにより、高コストで新規のトランスジェニックマウス系統を作製する必要がなくなります。この前臨床モデルは、臨床で用いられている方法と同様に抗がん剤の試験に使用できるため、新しいがん治療法の研究に有用です。本手法は正常な造血に関する知見を提供できるだけでなく、白血病などの特定の疾患の研究にも活用可能です。私は、正常および悪性ヒトB細胞の産生におけるTSLPサイトカインの役割を評価するためのin vivoモデルが必要になった際に、初めてこのアイデアを考案しました。まず、解凍したばかりのコントロール空ベクトル導入ストロマおよびサイトカイン産生細胞を、個別のT25フラスコ内の5 mLのR-10培地に播種します。その後、37°C、5% CO2条件下で24〜48時間培養します。ストローマ細胞がコンフルエントになったら、EDTA含有トリプシンを用いて細胞を剥離し、T150培養フラスコに再播種して3〜4日間培養します。T150フラスコ内でストローマ細胞がコンフルエントに達したら、上清を回収し、後でELISAによりサイトカイン産生を評価するため、-80°Cで凍結保存します。その後、各T150フラスコの培養物を3つの新しいT150フラスコに継代し、コンフルエントになるまで培養します。適切な継代数の後で細胞を保存するには、回収した細胞懸濁液を遠心分離用のコニカルチューブに移し、ペレットを凍結保存用培地で再懸濁します。その後、1.5E6個ずつの細胞分注液を長期保存チューブに移し、液体窒素中で保存します。構築したストローマから産生された上清を検証するには、コントロールおよびサイトカイン発現ストローマから回収した上清サンプルを融解し、条件ごとに白血病細胞株を3ウェル分、Au-20培地を用いて96ウェル組織培養プレートに2E5 cells/wellの濃度で播種します。細胞を37°Cで2時間インキュベートし、以前の培養によるリン酸化を消失させます。その後、各ウェルから細胞を個別の4 mLチューブに移し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを実験条件あたり600 µLで再懸濁します。各条件について、1ウェルあたり200 µLの細胞を3連で播種します。使用する市販のリン酸化アッセイの規定に従い、適切な期間細胞をインキュベートします。インキュベーション終了後、遠心分離により細胞をペレット化します。製造元のプロトコルに

expression-exogenous-cytokine-patient-derived-xenografts-via

Research

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Medicine

医学

のための効率的なプロトコル...

ブリオスタチンの1/Ionomycinによる腫瘍反応性T細胞のex vivoでの拡張と共通γ鎖のサイトカインの策定

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。...

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

この記事では、インターフェロンガンマやIFN-ガンマなどのサイトカインや腫瘍壊死因子アルファまたはTNF-αなどのT細胞内の細胞内濃度を増加させるためのex vivo T細胞刺激の技術について説明しています。これらのサイトカインは、効果的な抗腫瘍反応を媒介し、腫瘍において治療的役割を果たすことができます。...

膵臓腫瘍におけるex vivo T細胞刺激:T細胞におけるサイトカイン産生を増加させる方法

このビデオは、白血病細胞における間質サイトカインによるタンパク質の細胞内リン酸化の評価を示しています。これらの細胞内リン酸化タンパク質は、リン酸化フローサイトメトリー技術を用いて定量されます。...

リン酸化フローサイトメトリーを用いた間質性サイトカイン誘導性細胞内タンパク質リン酸化の評価

ここで非小細胞肺癌を勉強する時間とコスト削減モデルとしてマウス肺腺癌細胞の低侵襲同系同所性同種移植モデルについて述べる。...

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

ここでは、異種系移植片対宿主病(xenoGVHD)モデルにおける疾患を誘導し、スコア付けするプロトコルを提示する。xenoGVHDは、ヒトT細胞の免疫抑制を研究するためのインビボモデルを提供する。さらに、免疫抑制を定量化するツールとしてデジタルPCRを用いて組織内のヒトT細胞を検出する方法について述べた。...

デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

移植片対宿主病は、同種骨髄移植後の主要な合併症である。樹状細胞は、移植片対宿主病の病因において重要な役割を果たす。現在の記事では、移植片対宿主病の発症における樹状細胞の役割と移植片対白血病効果を調査するための新しい骨髄移植プラットフォームについて説明しています。...

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

この研究では、胚性幹細胞から免疫刺激性顆粒球マクロファージマクロファージを担う外生富化細胞外小胞を単離する方法について説明する。...

胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離

ここでは、末梢血単核細胞由来のサイトカイン誘導CD3+CD56+キラー細胞の単離・増殖を行うプロトコルを提示し、インビトロ診断フローサイトメトリーシステムを用いて血液学的および固形癌細胞に対する細胞毒性効果を示す。...

癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

このプロトコルは、正形外科膵腫瘍の外科的生成と、新たに単離されたマウス膵腫瘍の急速な消化について説明する。消化後、生存可能な免疫細胞集団は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のためのT細胞のex生体内刺激を含むさらなる下流分析に使用することができる。...

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

本プロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスにヒト皮膚を移植する方法を記載している。移植のためのヒト皮膚の準備、移植のためのマウスの準備、分割厚さのヒト皮膚の移植、および移植後の回復手順の詳細な説明がレポートに含まれています。...

in vivoでヒト免疫応答を操作するための異種移植片皮膚モデル

学ぶサイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入法による患者由来異種移植片モデルでの外因性サイトカイン発現。週1回の腹腔内投与で持続的なサイトカイン供給を実現し、がん研究や造血機構の解明に有用です。

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

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