Aβの絶対定量 _1-42 CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して

この参照測定手順の全体的な目標は、ヒトCSFにおけるベータの測定を調和させることです。この方法は、中枢性アミロイド病理のバイオマーカーであり、アルツハイマー病の神経病理学的特徴であるβ42であるCSFの測定のためのアッセイを標準化するのに役立ちます。この手法の主な利点は、徹底的に検証されており、AVR 142の定量に抗体を使用しないことです。

この技術の意味は、アッセイを調和させ、臨床試験における一般的なカットオフレベルの導入を促進するために使用されるため、アルツハイマー病の治療にまで及びます。この方法は、ヒトのアミロイド病理に関する洞察を提供するだけでなく、トランスジェニックマウスやヒト以外の霊長類などの他の死生物にも適用して、新薬を発明することもできます。一般に、AVR 142は非常に疎水性であり、ピペットチップやチューブなどの表面に容易に付着する可能性があるため、この方法に不慣れな人は苦労するでしょう。

まず、0.5ミリリットルの微量遠心チューブに、0.46ミリリットルの20%アセトニトリルと4%濃縮アンモニアに40マイクロリットルのN15ベータペプチドを加えます。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。2ミリリットルの微量遠心チューブに1.95ミリリットルの20%アセトニトリルと4%濃縮アンモニアに50マイクロリットルのペプチド溶液を加えます。

ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。次に、微量遠心チューブ内で各溶液の適切な量を混合することにより、6つのキャリブレーター溶液を調製します。キャリブレーター溶液を混合した後、0.5ミリリットルの微量遠心チューブ内で適切な量のキャリブレーター溶液とヒトCSFを混合することにより、最終的なキャリブレーターを二重に調製します。

ボルテックスミキサーで各溶液を1分間混合します。内部標準を調製するには、まず、ベータペプチドである13Cを32マイクロリットル、20%アセトニトリルと4%濃縮アンモニアの1.968ミリリットルを2ミリリットルの微量遠心チューブに添加します。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。

次に、5ミリリットルの微量遠心チューブに4.9ミリリットルの20%アセトニトリルと4%濃縮アンモニアに0.1ミリリットルのペプチド溶液を加えます。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。レスポンスファクターサンプルを調製するには、0.5 ミリリットルの微量遠心チューブに 40 マイクロリットルのネイティブ A ベータペプチドを 0.46 ミリリットルの 20% アセトニトリルと 4% 濃縮アンモニアに加えます。

混合後、20マイクロリットルのペプチド溶液と20マイクロリットル/ミリリットルあたり4マイクログラム、15Nベータペプチド、1.96ミリリットルの20%アセトニトリルと4%濃縮アンモニアを2ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。これに続いて、0.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の0.38ミリリットルの人工CSFに20マイクロリットルのペプチド溶液を加えます。

複製を準備した後、ボルテックスミキサーで各溶液を1分間混合します。ローラーでサンプルを解凍した後、各キャリブレーター、レスポンスファクター、および未知のサンプルを0.18ミリリットルを1ミリリットルのタンパク質96ディープウェルプレートに加え、サンプルをウェルの底部またはその近くに追加してください。次に、ピペットチップを水没させることなく、サンプルの表面に近いウェルの側面に標準液を一滴放出することにより、各ウェルに20マイクロリットルの内部標準液を追加します。

次に、0.2ミリリットルの5モルの塩酸グアナジンを各ウェルに加えます。サンプルプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、サンプルを1100rpmで45分間混合します。混合後、各ウェルに0.2ミリリットルの4%リン酸を加えます。

次に、サンプルプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、1000rpmで短時間混合します。混合モード陽イオン交換96ウェル固相抽出、または抽出プレートマニホールドチャンバー内のSPEプレートの下に、廃棄物用のリザーバートレイを置きます。次に、各ウェルに0.2ミリリットルのメタノールを添加して、SPE吸着剤をコンディショ

次に、各ウェルに0.2ミリリットルの4%リン酸を加えて吸着剤を平衡化します。8チャンネルピペットを使用して、すべてのサンプルをディープウェルプレートからSPEプレートに移します。その後、サンプルが通過した後、各ウェルに0.2ミリリットルの4%リン酸を加えて、吸着剤を2回洗浄します。

吸着剤から洗浄溶剤が溶出した後、リザーバートレイをチューブと交換します。次に、75%アセトニトリルと10%濃縮アンモニアの50マイクロリットルの2つのアロードコートを追加して、吸着剤からサンプルを溶出します。この溶液は吸着剤を通過するために非常に低い真空を必要とすることに注意してください。溶出液を真空遠心分離機を用いて熱を加えずに乾燥させます。

最後に、チューブを密封し、分析まで摂氏80度で凍結します。キャリブレータは回帰直線に近く、標準偏差は低くなっています。キャリブレーションが非線形の場合、ランは破棄されるべきであり、偏差はピペッティング技術の誤りやキャリブレーターの希釈のエラーが原因である可能性が最も高いです。

繰り返しの変動係数は10%未満であることが望ましいですネイティブの15Nおよび13Cは、LCカラムから同時に、対称に近いピークで、大きなテーリングを伴いません。各ピークに対して少なくとも 10 回の測定を行う必要があり、分析法で最大注入時間で調整できます。分析法の感度が最適でなく、各注入で目的のペプチドのみを測定すべきでない限り、ペプチドは MS 分析中に同時に測定できます。

一度マスターすれば、このテクニックは適切に実行されれば4時間で完了します。この手順を試行する際は、ペプチド溶液を移す前に必ずピペットチップを飽和させることを覚えておくことが重要です。また、ボイドボリュームができるだけ少ないチューブを使用することも重要です。

その開発後、この技術は、アルツハイマー病の分野の研究者がアミロイドPETイメージングなどの他の方法との一致を探求する道を開きました。また、CSFベースの標準物質にβ142濃度を割り当てるためにも使用されています。このビデオを見れば、ヒトCSFでキャリブレーターを調製する方法や、LCMS分析前に固相抽出を使用してサンプル中のβ142の絶対濃度を測定する方法について十分に理解できるはずです。

人間のCSFを扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋、保護メガネ、その他の安全対策などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。