Name: Aβの絶対定量 1-42 CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶAβ1-42の絶対定量法：固相抽出とLC-MS/MSを用いてヒト脳脊髄液中のアミロイドバイオマーカーを正確に測定します。この検証済み手法は抗体を使用せず、アルツハイマー病の臨床試験における測定の標準化に貢献します。

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この作業は、以下の構成の国際臨床化学連盟CSFタンパク質に関するワーキンググループを代表して行われました: Kaj Blennow (議長) と Henrik Zetterberg, ヨーテボリ大学, スウェーデン;Les Shaw and Magdalena Korecka、フィラデルフィア大学、ペンシルベニア州、米国;Ingrid Zegers、Institute for Reference Materials and Measurements、ゲール、ベルギー;Piotr Lewczuk、エアランゲン大学、ドイツ;ランド・ジェンキンス、PPDバイオアナリシス研究所、リッチモンド、バージニア州、米国。ランドール・ベイトマン、ワシントン大学、ミズーリ州、米国;H Vanderstichele、Innogenetics NV、ゲント、ベルギー。この研究は、アルツハイマー病協会の医療・科学関係担当シニアディレクターであるMaria C. Carrillo博士が率いるGlobal Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Groupの一部でもありました。この研究は、スウェーデン研究評議会(助成金#14002、#521-2011-4709、および#2013-2546)の支援を受けました。クヌートとアリス・ウォレンバーグ財団。Demensförbundet;エミールとヴェラ・コーネル、アイナ・ヴァルストロムとメアリー・アン・ショーブロム、ガンとベルティル・ストーン、マグヌス・バーグヴァル、ガムラ・チャナリノールの財団。

注：このプロトコルは、出発物質として、各Aβペプチドのために50μg/ mLの濃度で、少なくとも50μLのアリコートを必要とします。 Aβペプチドは、脱イオン水中の20％アセトニトリル（ACN）、4％濃アンモニア溶液（V / V）に溶解し、80℃で保存されるべきです。 注意：安全情報については、 表1を参照してください。 ソリューションの調製<ol><li>脱イオン水中でACN、濃縮アンモニアの4mLの（〜25％）の20 mLで希釈し、脱イオン水中の20％ACN、4％濃アンモニア溶液（v / v）を100mLのを準備します。脱イオン水で100mLへの最終的な音量を調整します。新鮮な毎日を行います。 </li><li> 50 mLの最終容量まで脱イオン水にグアニジン塩酸塩の26.08グラムを溶解することにより、5 Mグアニジン塩酸50mLのを準備します。 20℃で保存し、新鮮な毎月を作ります。 </li><li>脱イオン水中の4％リン酸（V / 200mLのを準備v）で脱イオン水中に濃リン酸（〜85％）の9.4 mLで希釈し。脱イオン水で200ミリリットルの最終容量を調整します。冷蔵庫に保管し、新鮮毎週行います。 </li><li>脱イオン水中でACN 37.5 mL及び濃アンモニア5mLの（〜25％）を希釈して、脱イオン水中で75％ACNおよび10％濃アンモニア溶液50ml（V / V）を調製します。脱イオン水で50 mLで最終容量を調整します。新鮮な毎日を行います。 </li><li>日常の臨床分析から匿名化された残りの試料から得られたキャリブレータのためのヒトCSFの少なくとも2.5mLのを、解凍します。 </li><li> 150mMのナトリウム、3.0 mMのK、1.4 mMのカルシウム、0.8 mMのマグネシウム、1.0 mMのP、および脱イオン水で155 mMののClを含む人工CSFを準備し、4ミリグラム/ mLの最終濃度にウシ血清アルブミンを追加します。唯一の1 mLを分析ごとに必要ですが、将来の使用のために大容量、一定分量を、およびストアを準備されています。 </li></ol>キャリブレーターの調製<ol><li> 4 / mlの1の0.5ミリリットルを準備20％のACNおよび0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中の4％の濃アンモニアを50μg/ mLの15NAβ142 0.46ミリリットルの40μLを添加することにより5NAβ1-42ペプチド 。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 20％ACNおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ中で4％の濃アンモニアの1.95 mLに50μLの4μg/ mLの15のNAβ142を追加することにより、100ng / mlの15NAβ1-42ペプチドの2ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 表2に示した各溶液の体積を混合することにより、6キャリブレーター溶液（AF）を準備します。 0.5、1.5、および2 mLのマイクロ遠心チューブを使用してください。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 1分間ボルテックスミキサーに、表3ミックスに応じて対応するキャリブレーションソリューションと人間のCSFを追加することにより、0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中の最終キャリブレータ（二重に）を準備します。 </li></ol>内部標準の調製<ol><li> 20％ACNおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ中の4％の濃アンモニアの1.968 mLに32μLを50μg/ mLの13のCAβ142を追加することにより、0.8μgの/ mLの13CAβ1-42ペプチドの2ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 5 mLのマイクロ遠心チューブ中の20％ACNおよび4％濃アンモニアの4.9 mLに0.8μgの/ mLの0.1mLのを追加することにより、16 ngの/ mLの13CAβ1-42ペプチドの5ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li></ol>レスポンスファクタのサンプルの4準備注：応答因子（RF）決意を較正するために使用標識ペプチドの濃度（15NAβ1-42）を決定するために実行されます。これは、天然Aβ1-42ペプチドの濃度は、アミノ酸分析（AAA）を用いて決定されていることを必要とします。このように、ボリュームおよびネイティブAβ1-42ペプチドのアリコートの濃度AAAの要件を満たす必要があります。 <ol><li> 20％のACNおよび0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中で4％の濃アンモニアの0.46 mLに50μg/ mlのネイティブAβ1-42の40μLを追加することで、4μgの/ mLのネイティブ（非標識）Aβ1-42 0.5mLのを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 20％の1.96 mLに4μgの/ mLの15NAβ1-42の4 / mlのネイティブAβ1-42および20μLの20μLを追加することで、ネイティブと15NAβ1-42の2-mLの40 ngの/ mLのミックスを調製ACNおよび4％が2 mLのマイクロ遠心チューブ中のアンモニアを濃縮しました。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。 </li><li> 0.5mLのマイクロチューブに人工CSFの0.38 mLに40 ngの/ mLの混合物の20μLを追加します。重複を準備し、1分間ボルテックスミキサーで混ぜます。 </li></ol> 5.サンプル調製注：ローラー上、室温で測定されるサンプルを解凍します。 <ol><li>（使用している場合、品質管理を含む[QC]サンプル） 図1（完全版が使用されていると仮定）によると、96ディープウェルプレート1 mLのタンパク質に、各キャリブレータの0.18 mLを加え、応答率、および未知のサンプル。でサンプルを追加してください、またはウェルの底に近いです。 </li><li>各ウェル（ すなわち、キャリブレータ、応答因子のQC、及び未知数）に内部標準の20μLを追加します。ピペットチップを浸漬することなく、試料の表面に十分に近い側のドロップを解放することが重要です。 </li><li>各ウェルに0.2 mLと5 Mグアニジン塩酸塩を追加します。 </li><li>マイクロプレートシェーカー上のサンプルプレートを配置し、1100 rpmで45分間サンプルを混ぜます。最適な周波数は、計装に応じて異なる場合があります。ソリューションが完全に混合され、内部標準またはCSFのない滴をウェルの側に混合されていない残っていないように、ミキサーの周波数と振幅を設定します。 </li><li> 4％リン酸0.2 mLを加え各ウェルに。渦を簡単に混ぜます。 </li></ol> 6.固相抽出注：すべての洗浄、ロード、および溶出工程では、溶液を添加した後、可能な限り低い真空を適用し、ロードまたは溶液を溶出するために、必要に応じて徐々に増加します。各ローディングおよび溶出工程の間に真空を無効にします。 <ol><li>混合モード下での廃棄物のための貯蔵トレーを入れ、抽出プレートマニホールド室における陽イオン交換、96ウェル固相抽出（SPE）プレート。 </li><li>各ウェルにメタノール0.2mLのを追加することにより、SPE吸着剤を調整します。 </li><li>各ウェルに、4％のリン酸を0.2mLを添加することにより吸着剤を平衡化します。 </li><li> SPEプレートにディープウェルプレートから全てのサンプル（各ウェル中に約0.62ミリリットル）を転送します。 SPEプレートにディープウェルプレートからサンプルを転送するときに8チャンネルピペットを使用します。サンプルはインターンが含まれているため、すべてのサンプルの全体または同等のボリュームを転送することが重要ではありません変動を補償しますアル標準。 </li><li>サンプルを各ウェルに4％リン酸を0.2mLを添加することによって通過した後の吸着剤を洗浄します。 </li><li>洗浄溶媒は、吸着剤から溶出した後、捕集板や管をリザーバートレイを交換してください。 </li><li>二回75％ACN / 10％濃アンモニアの50μLを添加することにより、吸着剤から試料を溶出し、そしてこの溶液が吸着剤を通過することは非常に低真空を必要とすることに注意してください。各添加の間に真空を無効にすることを忘れないでください。 <ol><li>オプション：コレクションプレートまたはチューブを密封し、-80℃でそれらを凍結。 6.8.2に進む前に、コレクションプレートまたはチューブからシールを取り外します。 </li><li> （熱を加えることなく）真空遠心分離を使用して溶出液を乾燥させます。これは、真空遠心分離に応じて、数時間に1から取ることができます。 </li><li>容器を密封し、-80℃でそれらを凍結。 </li></ol></li></ol> 7.液体クロマトグラフィー<ol><li> 、およびニードル洗浄（50％ACN（ACN [V / V]で4％の脱イオン水および0.1％濃アンモニア）、B（脱イオン水[V / V]中の5％ACNおよび0.3％濃アンモニア）移動相Aを準備4％の脱イオン水にアンモニアを濃縮[v / v]）。 <ol><li>移動相Aの500ミリリットルのために、脱イオン水にACNの25mLの濃アンモニアの1.5 mLを加え。脱イオン水で500 mLで最終容量を調整します。 </li><li>移動相Bの500ミリリットルのために、濃アンモニアの500μLとACNへの脱イオン水25 mLを加え。 ACNと500ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </li><li> ACN 120mLの脱イオン水に濃アンモニアの10ミリリットルを追加することにより、ニードル洗浄の250ミリリットルを準備します。脱イオン水で250 mLで最終容量を調整します。 </li><li> LCシステムで使用する前に20分間の超音波処理浴中にオープン移動相AとBとニードル洗浄瓶を入れて</li></ol></li><li> 20％のACNの25μLと、4％concentraで各サンプルを溶解テッドアンモニア溶液と20分間シェーカー上に置きます。遠心分離機のサンプルダウンして、オートサンプラーに配置します（7℃に保ちます）。 </li><li> 50℃に維持し、1×250ミリメートル2ポリスチレン-ジビニルベンゼン（逆相）モノリシックカラム上のサンプルの20μLを注入します。 <ol><li> 0.3 mL /分の流速を用いて、表4に示すLC勾配を使用します。質量分析計の汚染を低減するために迂回バルブを使用して（ポストカラム）を無駄に2最初と最後の5分をそらします。 </li></ol></li></ol> 8.質量分析注：これらのパラメータはaheatedエレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極オービトラップハイブリッド質量分析計のために使用しました。 <ol><li> 表5に記載のイオン源のパラメータを設定します。 </li><li> （ネイティブAβ1-42の4+充電状態を分離するために1,129.48質量をMS機器を設定します2.5メートル/ zのの分離幅と四重極型質量分析計における電荷比[ のm / z]）、1-42 15NAβ（1,143.00 のm / z）、および13CAβ1-42（1,179.50 のm / z）。 </li><li> 17.0の正規化衝突エネルギー（NCE）との衝突セル内の単離されたペプチドを断片化します。 （このようなトリプル四重極MSなどの器具の他のタイプを、使用している場合は特に）であっても、同じタイプのこれは、各楽器に合わせて調整する必要がある場合があります。 </li><li> 2×10 5の電荷の自動利得制御対象と250ミリ秒の最大噴射時間で、17.500の分解能でフラグメントスペクトルを記録します。 </li></ol> 9.データ処理<ol><li>各ペプチドのためのクロマトグラフィーの領域を計算するために、 表6に（±250ミリ質量単位[MMU]の質量公差）プロダクトイオンの合計を使用してください。イオンの種類と数は、ネイティブAβのために示されていることに注意してください<suB&gt; 1-42プロダクトイオン、彼らは15NAβ1-42と13CAβ1-42の両方で同じであるため。 </li><li>ネイティブAβ1-42の曲線下面積を持つ15NAβ1-42の曲線（クロマトグラフピーク）の下の領域を分割して2つの応答因子サンプルの平均応答係数を決定します。 </li><li>ステップ9.2で算出された応答因子でそれを掛けることによって、キャリブレーションのために使用される15NAβ1-42の濃度を調整します。 </li><li>濃度に対するキャリブレータの2セットから13CAβ1-42に15NAβ1-42の面積比をプロットして検量線を作成します。 </li><li>線形回帰を用いて検量線の傾きと切片を計算します。 </li><li>アンのための内部標準（13CAβ1-42）にネイティブAβ1-42の面積比を計算します既知のサンプル。 </li><li>ステップ9.5で得られた傾きと切片を用いて、検量線から未知のサンプルの濃度を外挿する。 </li></ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JPとEPは開示を報告していません。HZは、Roche Diagnostics、Eli Lilly、Pharmasum Therapeuticsの諮問委員会のメンバーを務めてきました。KBは、Fujirebio Europe、IBL International、Roche Diagnosticsのコンサルタントまたはアドバイザリーボードを務めてきました。HZとKBは、ヨーテボリ大学のGUベンチャーベースのプラットフォーム企業であるヨーテボリABのBrain Biomarker Solutionsの共同創設者です。

記載された方法のために、代わりに代理母材を使用して、我々は、ヒトCSF中にキャリブレーションを可能にする、代用分析物アプローチ13、14、15、16を用います。サロゲートの検体のアプローチは、二つの異なる同位体標識された規格を必要とします。別の（13CAβ142）を内部標準として使用され、一方の（15NAβ142）は 、ヒトCSF中の較正曲線を生成するために使用されます。未知の内因性Aβ142の濃度は、その後、較正曲線から推定されている計算されたAβ13分の142内在性CAβ142比で15NAβ13分の142CAβ142の比...

アルツハイマー病（AD）は、認知症の最も一般的な形態であり、全世界で約35万人1に影響を与えます 。広くADの病因の中心に位置するように考えられて疾患の神経病理学的特徴は、過リン酸化タウ蛋白質2の細胞内神経原線維変化および凝集したアミロイドβ（Aβ）ペプチド3からなる細胞外斑です。これに伴い、バイオマーカーによって、in vivoでのプラーク病変の評価は最近、AD 4のための研究診断基準に含まれています。 Aβ1-42のCSF測定のために、いくつかのイムノアッセイが利用可能であり、多くの臨床検査室5で使用されています。 CSF中のAβ1-42の濃度は、BRでのプラーク中のペプチドの沈着を反映し、認知正常な高齢者に比べてAD患者では約50％低くなっていますAIN 6、7。 これらのバイオマーカーは、主に免疫アッセイ（ すなわち、抗体ベースの技術）を用いて分析されているが、これらのアッセイは、マトリックス効果8によって影響され得ます。異なるテクノロジプラットフォームイムノアッセイおよびアッセイの標準化9の欠如の使用は、10は 11、12困難なグローバルなカットオフ濃度の導入を行います。分析的に検証さRMPは、理想的には、分析プラットフォーム間でより良い比較では、全体的な測定のばらつきの要因のより良好な制御が得られ、異なるアッセイプラットフォームの均一なキャリブレーションを可能にするであろう。 開発されたLC-MS / MS法を用いてAβ1-42の絶対的な定量化は、抗体ベースのTECHNに関連する問題の多くを克服しますiques。検査医学（JCTLMデータベース識別番号C11RMP9）におけるトレーサビリティのための合同委員会がRMPとしてリストされている方法は、CSFAβ1を調和させる認証標準物質（CRM）におけるAβ1-42の絶対濃度を決定するために使用されます技術および分析プラットフォーム間-42測定。説明ワークフローは、医学の他の領域内のペプチドおよびタンパク質のための候補参照方法の開発のための関連性のものでなければなりません。

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 mL ポリプロピレンチューブ、V-bottom</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>チューブ SPE溶出液の収集に使用されますが、96ウェルプレートなどの他の収集デバイスも使用できます。</td></tr><tr><td>Micronic スプリット TPE Capcluster for 96 in. tubes</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Caps for Micronic tubes.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96ホワイトwハイカバーバーコード</td><td>Micronicチューブ用Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>ホルダー。</td></tr><tr><td>Biohit Optifitチップ 1.2 mL</td><td>ザルトリウス</td><td>791210</td><td>LoBindディープウェルプレート(96ウェル)の底まで到達するために使用します。他の細い先端もうまくいくかもしれません。</td></tr><tr><td>ウォーターズオアシスMCX 96ウェル&マイクロ;溶出プレート</td><td>ウォーターズ</td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズプレートマニホールドリザーバートレイ</td><td>オ</td><td></td>アシス96ウェルプレート用ウォーターズWAT058942<td></td></tr><tr><td>抽出プレートマニホールド</td><td>ウォーターズ</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液、puriss。ISO、リーグ。Ph. Eur., ~25% NH3 basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>オルトリン酸 85%, ACS,ISO,Reag.Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩、500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive ハイブリッド四重極 Orbitrap 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Dionex Ultimate 3000 LC & オートサンプラーのバンドル付き。</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H モノリスカラム (1.0 x 250mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、凍結乾燥粉末、(分子生物学用)、非アセチル化</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>ベータアミロイド (1-42)、ウルトラピュア、TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N ベータアミロイド (1-42)、均一に標識</td>された <td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C β-アミロイド (1-42)、均一に標識</td>された <td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシェーカー、TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml;</td><td>ラー6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

aβの絶対定量<sub&gt; 1-42</sub&gt; csfに質量分析リファレンス測定手順を使用して

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

アルツハイマー病(AD)は、高齢者の間で最も一般的な神経変性疾患であり、認知症の全症例の60-80%を占めています。現在、ADの診断は認知テストや精神状態検査がベースとなっていますが、脳脊髄液(CSF)中のペプチドであるアミロイドベータ(Aβ)は、臨床試験や臨床現場での利用が増えています。ほとんどのタンパク質およびペプチドバイオマーカーと同様に、定量は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの抗体ベースの技術を使用して行われます。しかし、これらのアッセイの検査室内および検査室間のばらつきは、臨床ルーチンにおける診断マーカーとしての使用を妨げています。
固相抽出(SPE)と液体クロマトグラフィー(LC)タンデム質量分析(MS/MS)に基づいて、抗体に依存しない参照測定法(RMP)が開発されました。そこでは、安定した同位体標識Aβペプチドを内部標準として使用し、絶対定量を可能にしました。測定には、高分解能四重極/Orbitrapハイブリッド装置を使用しました。この分析法により、CSF Aβ1-42 を 150-4,000 pg/mL で定量できます。

図1のプレート設定は、サンプルの完全版のために使用されます。少数の未知の試料を分析する場合は、第二校正器、RF、およびQCセットは未知サンプルの前半の後に配置する必要があります。 図2に見られるように、校正器は、低い標準偏差を用いて、回帰直線に近いです。この方法は、150 pg / mlで4,000 pg / mlでの定量化の上位レベルの定量化のより低いレベルを有します。キャリブレーションの残余の標準偏差は、もちろん、可能な限り低くあるべきです。キャリブレーションが非線形である場合、ランは、（重症度に応じて）破棄されるべきであり、偏差が不正確なピペット操作技術および/またはキャリブレーターの希釈でのエラーによる可能性が最も高いです。複製の変動係数（CV）は20％以下、好ましくは10％未満であるべきです。 <p class="jove_content" fo:keep-t<h...

固相抽出と液体クロマトグラフィータンデム質量分析に基づくヒトCSF中のAβ1-42の絶対定量のための参照測定手順が説明されています。

Aβの絶対定量<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

この参照測定手順の全体的な目的は、ヒト脳脊髄液（CSF）中のアミロイドベータ（Aβ）の測定を調和させることです。本法は、中枢性アミロイド病理のバイオマーカーであり、アルツハイマー病の神経病理学的特徴であるCSF Aβ42の測定アッセイを標準化するのに役立ちます。この手法の主な利点は、十分に検証されており、Aβ42の定量に抗体を使用しないことです。この手法の意義はアルツハイマー病の治療へと広がります。なぜなら、この手法を用いることでアッセイの調和が図られ、臨床試験における一般的なカットオフ値の導入が容易になるためです。本法はヒトにおけるアミロイド病理への知見を提供できるだけでなく、トランスジェニックマウスや非ヒト霊長類などの他の哺乳類に応用して新薬を開発することも可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、AVR 142が非常に疎水性が高く、ピペットチップやチューブなどの表面に付着しやすいため、苦労することがあります。まず、0.5 mLのマイクロ遠心チューブに、20%アセトニトリルおよび4%濃アンモニア液 0.46 mLを加え、そこにN15 a beta peptideを40 µL添加します。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。次に、2 mLのマイクロ遠心チューブに20%アセトニトリルおよび4%濃アンモニア液 1.95 mLを加え、そこにペプチド溶液 50 µLを添加します。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。次に、各溶液の適切な量をマイクロ遠心チューブに分注して混合し、6種類のキャリブレーター溶液を調製します。キャリブレーター溶液の調製後、対応するキャリブレーター溶液とヒトCSFの適切な量を0.5 mLマイクロ遠心チューブに混合し、最終的なキャリブレーターを2連（duplicate）で調製します。各溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。内部標準を調製するには、まず2 mLのマイクロ遠心チューブに、20% acetonitrileおよび4% concentrated ammonia 1.968 mLを加え、そこに13C a beta peptideを32 µL添加します。ペプチド溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。次に、5 mLマイクロ遠心チューブに、20%アセトニトリルおよび4%濃アンモニア液4.9 mLを加え、そこにペプチド溶液0.1 mLを加えます。ボルテックスミキサーを用いてペプチド溶液を1分間混合します。レスポンスファクター試料を調製するには、0.5 mLマイクロ遠心チューブに、20%アセトニトリルおよび4%濃アンモニア液0.46 mLを加え、そこにネイティブa betaペプチド40 µLを加えます。混合後、2 mlマイクロ遠心チューブに、20%アセトニトリルおよび4%濃アンモニア溶液 1.96 mLを加え、そこにペプチド溶液 20 µLと 4 µg/mL 15N α-beta ペプチド 20 µLを添加します。ボルテックスミキサーでペプチド溶液を1分間混合します。その後、0.5 mLマイクロ遠心チューブに入れた人工CSF 0.38 mLに、ペプチド溶液 20 µLを添加します。重複検体を調製した後、各溶液をボルテックスミキサーで1分間混合します。ローラーでサンプルを解凍した後、各キャリブレーター、レスポンスファクター、および未知サンプルを0.18 millilitersずつ、1 milliliterタンパク質用96深孔プレートに分注します。この際、サンプルがウェルの底部または底に近い位置に入るようにしてください。次に、ピペットチップを浸さないように、ウェルの壁面のサンプル表面付近に内部標準を1滴ずつ落とし、各ウェルに20 microlitersの内部標準を添加します。次に、各ウェルに5 Mの塩酸グアニジンを0.2 milliliters加えます。サンプルプレートをマイクロプレートシェーカーにセットし、1100 rpmで45分間サンプルを混合します。混合後、各ウェルに4%のリン酸を0.2 milliliters加えます。次に、サンプルプレートをマイクロプレートシェーカーにセットし、1000 rpmで短時間混合します。抽出プレートマニホールドチャンバー内の混合モード陽イオン交換96ウェル固相抽出（SPE）プレートの下に、廃棄物用リザーバートレイを配置します。続いて、各ウェルに0.2 millilitersのメタノールを添加し、SPE吸着剤をコンディショニングします。次に、各ウェルに4%リン酸を0.2 milliliters添加し、吸着剤を平衡化します。8チャンネルピペットを使用して、ディープウェルプレートからSPEプレートにすべてのサンプルを移します。その後、サンプルが通過した後、各ウェルに4%リン酸を0.2 milliliters添加して、吸着剤を2回洗浄します。洗浄溶媒が吸着剤から溶出したら、リザーバートレイをチューブに交換します。次に、75%アセトニトリルと10%濃アンモニアを50 µLずつ2回加えて、吸着剤からサンプルを溶出させます。この溶液を吸着剤に通過させるには、非常に低い真空度が必要であることに注意してください。溶出液を、加熱せずに真空遠心分離機を用いて乾燥させます。最後に、チューブを密封し、分析まで-80 °Cで凍結保存します。キャリブレーターは、標準偏差が小さく、回帰線に近い値を示します。校正が非線形である場合は、そのランは破棄する必要があります。この偏差は、主に不適切なピペッティング操作や、キャリブレーターの希釈ミスに起因すると考えられます。再現性の変動係数は、好ましくは10%未満である必要があります。天然の15Nおよび13C α-βは、ほぼ対称的なピークを持ち、著しいテーリングなく、LCカラムから同時に溶出します。各ピークについて少なくとも10回の測定を行う必要があり、これはメソッド内の最大注入時間で調整可能です。MS分析中にペプチドを同時に測定できますが、メソッドの感度が不十分な場合は、各注入において目的のペプチドのみを測定してください。この手法に習熟し、適切に実施すれば、4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、ペプチド溶液を移し替える前に、必ずピペットチップを飽和させることを忘れないでください。また、デッドボリューム（死容量）が可能な限り少ないチューブを使用することも重要です。本手法の開発後、アルツハイマー病分野の研究者は、アミロイドPETイメージングなどの他の手法との整合性を探索することが可能になりました。また、本手法はCSF基準物質へのbeta 142濃度の割り当てにも使用されています。このビデオを視聴することで、ヒトCSFにおけるキャリブレーターの調製方法、およびLCMS分析前の固相抽出を用いてサンプル中のbeta 142の絶対濃度を測定する方法について、十分に理解できるはずです。ヒトのCSF（脳脊髄液）を取り扱う際は極めて危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する間は、手袋や保護メガネなどの安全対策を常に講じることを忘れないでください。

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出典: サミュエルズ、D. J.、 他 黄色 ブドウ球菌の代謝物分析におけるタンデム液体クロマトグラフィー–質量分析法アプローチ。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオでは、S .

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Aβの絶対定量

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