Name: 脳血行動態との光散乱特性の同時評価インビボラット脳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶ多波長拡散反射イメージングを用いたラット脳の脳血行動態と光散乱特性の可視化法。この技術は生体内での脳機能と組織形態の時間的変化を評価し、神経疾患モデルのモニタリングに応用可能です。

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この作業の一部は、日本学術振興会の科学研究費補助金(C)(25350520, 22500401, 15K06105)および米陸軍ITC-PAC研究開発プロジェクト（FA5209-15-P-0175)の支援を受けました。

動物のケア、準備、および実験プロトコルは、東京農工大学の動物研究委員会によって承認されました。この方法のために、ラットは、食物および水を自由に摂取して、制御された環境（24℃、12時間の明/暗サイクル）に収容されています。 従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムの構築1。 <ol><li>マウントの中心波長を有する9つの狭帯域光干渉フィルタ500、520、540、560、570、580、600、730、及び電動フィルタホイールのフィルタ孔760 nmでした。 </li><li>広帯域白色光源、狭帯域干渉フィルタの上記セット、ライトガイド、集光レンズ、ビデオズームレンズ、及びモノクロCCDカメラで電動フィルターホイールを使用して、マルチスペクトル画像化システムを構築します。 図 2に示される光学部品のレイアウトは、目のために参照することができます構築手順です。 注：照明の角度は約45°で試料表面に対してです。 </li><li>干渉フィルター、光ガイド、及び集光レンズを介して試料の表面を照明するハロゲンランプ光源をオンにします。 </li><li> CCDカメラの動作するソフトウェアを開きます。 </li></ol> 2.動物の準備注：このプロトコルでは、ラットは、将来の実験のために使用されていなかった、それはマルチスペクトル画像の測定直後に殺しました。 <ol><li>管を麻酔機の出口ポートに誘導室の入口ポートを接続します。第二管を麻酔機の入口ポートに誘導チャンバーの出口ポートを接続します。 </li><li>誘導室にラットを置き、5.0％イソフルランで麻酔を誘導します。ラットは、つま先のピンチに応答しないような深さで麻酔を維持します。 L麻酔機にロータリーノブを使用して2.0％イソフルランにower。 </li><li>定位フレームにラットの頭を固定してください。定位フレームに麻酔のためのマウスピースを取り付けます。 </li><li>管を麻酔機の出口ポートにマウスピースの入口ポートを接続します。管を麻酔機の入口ポートにマウスピースの出口ポートを接続します。 </li><li>皮膚表面が表示されるまで、バリカンを使用して将来の切開部位を越えて頭部を剃ります。 </li><li>外科用メス使用頭部の正中線に沿って約20mm長い縦切開を行う（ 図1（a）参照 ）および皮下結合組織を露出させる（ 図1（b）参照 ）。 </li><li>鋭いキュレットまたはペンチを使用して、皮下結合組織を除去し（ 図1（c）参照 ）頭蓋骨を露出させるためにヘッドの両側にそれを引っ張ります。 </li><li>頭蓋内sutur頭蓋骨上の楕円溝を掘ります（冠状縫合、矢状縫合、およびラムドイド縫合）を、高速ドリルを用いて行った（ 図1（d） ）。 </li><li>高速ドリルを使用して溝の中の骨をゆっくりと均一に掘削します。 </li><li>脳血管が出現した後、骨の太さと強度を推定するために、狭窄した頭蓋骨の表面を軽く押す。間引かれた頭蓋骨領域が容易に押し下げられる場合、高速ドリルで頭骨の縮小を終了する。 </li><li>狭窄した頭蓋骨の楕円形の境界線を、かぎ針の先端または小さな外科用はさみを用いて短く切る。 </li><li>細い頭蓋骨を脳の表面からゆっくりと、やさしくピンサーを使って外す。 </li><li>生理食塩水で頭蓋の窓を静かに浸し、厚さ約0.1mmの透明なガラス板で覆う。 </li></ol> 3.インスピレーション酸素の割合を調節する注：呼吸条件ンは、吸入酸素（のFiO 2）の割合を調節することによって変更することができます。 <ol><li>チューブを使用して、別のY字管コネクタ（コネクタ2）の第1のポートにY字管コネクタ（コネクタ1）の第1ポートを接続します。 </li><li>チューブコネクタ1の第2のポートにマウスピースの入口ポートを接続します。 </li><li>チューブを用いて、酸素濃度監視装置にチューブコネクタ1の第3ポートに接続。 </li><li>管を、麻酔機の出口ポートにチューブコネクタ2の第2ポートを接続します。 </li><li>チューブを使用して、ガス混合装置の出口ポートにチューブコネクタ2の第3のポートを接続します。 </li><li>チューブを用いて5％CO 2ガスボンベ-高圧95％O 2へのガス混合装置の一つの入口ポートを接続します。 </li><li>チューブを用いて5％CO 2ガスボンベ-高圧95％のN 2へのガス混合装置の他の入口ポートを接続します。 </li><li> Oガスの流量を変更しますf O 2およびN 2をガス混合装置の回転ノブを使用して測定する。 </li><li>酸素濃度モニタ装置を使用してFiO 2を確認し、調整する。 </li></ol> 4.マルチスペクトル拡散反射像の取得<ol><li> 参照画像の取得 注：この実験で使用される光源、光ファイバー、検出器などの光学部品は、独自のスペクトル特性を持っています。したがって、これらの成分を通過する光の強度は、基準画像として記録されるべきである。基準画像は、光源からの光で照明された標準的な白色ディフューザで撮影された画像である。 <ol><li>ステージ上に標準の白色ディフューザーを水平に置きます。 </li><li>鏡筒のズームリングを回して、白いディフューザーの表面にカメラのレンズを合わせます。 </li><li>カメラからの適切な値を選択して、カメラの積分時間を調整します。ドロップダウン積分時間のリストをカメラのオペレーティングソフトウェアの光の最大量が最大カウントの約75％である信号を生成するようになっています。画素値のヒストグラムを見ながら、信号強度レベルが最大カウントの約75％になるまで、積分時間を調整します。 </li><li>ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。 </li><li>フィルタホイールを回転させることにより、フィルタの位置を変更します。 </li><li>上述した方法に従って、他の波長の画像を保存します。ファイル名には、サンプルと使用波長（ 例えば、W500、W520、W540 ... W760）を特定すべきです。 </li></ol></li><li> サンプル画像の取得 注：9つの波長で露出したラット脳の拡散反射光強度の画像が捕捉され、同一の取得条件を用いて、パーソナルコンピュータのハードドライブに保存されています。 <ol><li>静かにRを配置ステージ上では、ゆっくりとカメラがラット脳の表面に集中できるように、ステージレベルを調整します。 </li><li>ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。 </li><li>フィルタホイールを回転させることにより、フィルタの位置を変更します。 </li><li>上述した方法に従って、他の波長の画像を保存します。ファイル名には、サンプルと波長（ 例えば、R500、R520、R540 ... R760）を特定すべきです。 </li></ol></li><li> 暗い画像の取得 注：CCDカメラは、電気信号に応答して光強度を生成することができます。しかし、光が検出器に入らない場合であっても、原因の電気回路及び検出器のノイズに若干の出力があります。これは、暗電流ノイズと呼ばれています。正確に光の分光強度を測定するため、暗電流成分は、暗画像として記録し、次いで測定信号から減算されるべきです。暗い画像はイメージテイクですブロックされた光路を有するn。 <ol><li>ハロゲンランプ光源をオフにします。 </li><li>遮蔽板を用いたCCDカメラシステムの光路を遮断します。 </li><li>ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。ファイル名は、試料（ 例えば、ダーク）を特定すべきです。 </li></ol></li></ol> 5.ヘモグロビン含有量および光散乱パラメータの可視化注：マルチスペクトル拡散反射画像のセットは、パソコンのハードドライブに保存し、オフラインで分析されます。 9つの波長（500、520、540、560、570、580、600、730、760 nm）におけるマルチスペクトル拡散反射画像のモンテカルロシミュレーション19によって補助重回帰分析は、2つの次元を視覚化するために行われます酸化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、総ヘモグロビン濃度、局所脳酸素飽和度、及びスキャットのマップ電源をtering。詳細なアルゴリズムは文献17、18に掲載されました。 <ol><li>基準画像と各波長でのサンプル画像の両方から暗画像を差し引きます。 </li><li>各波長λにおける参照画像がサンプル画像を正規化します。拡散反射画像Rとして正規化された画像を扱います。 </li><li>各波長λでの拡散反射画像Rの逆数の対数をとることによって、吸光度（または光学密度）画像Aを計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq1.jpg" /> （1） </li><li> y平面脳表面について得られた構造情報を示し、zは γ軸スペクトル情報を示す- xは 、それらの波長のオーダーで吸光度画像を積層した三次元マトリックスを生成します。 </li><li> PE座標各XYでの吸光度スペクトルA（λ）は、重回帰分析をrform。 </li><li>ステップ5.5の独立変数と従属変数とHBO（λ）ε酸素化ヘモグロビンのモル吸光係数スペクトル及び脱酸素化ヘモグロビンεのHBR（λ）として吸光度スペクトルA（λ）を使用する（ のHbOεの値を公開（λ）そしてεHBR（λ））を 表1に示します。 </li><li> 3重回帰係数HBO、HBR、0の二次元マップ（画像）を確認。 </li><li>順HBO、HBR、及び0に重回帰係数の画像を積層した三次元マトリックスを生成します<eM&gt; X - y平面は、脳の表面およびz -軸について得られた構造情報を示しているが、複数の回帰係数を示しています。 </li><li>次の実験式を用いて座標酸素化ヘモグロビン濃度C HBO、脱酸素化ヘモグロビン濃度C HBRを計算し、多重回帰のセットからの散乱電力Bは、それぞれXYでHBO、HBR、及び0係数 （彼は、βの値HBO、I、βHBR、I、およびβ0、I（I = 0,1,2,3）は、表2に提供されます）。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq2.jpg" /> （2） <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq3.jpg" /> （3） <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq4.jpg" /> （4） </li><li>酸素化ヘモグロビン濃度C HBO、脱酸素化ヘモグロビン濃度C HBR、散乱電力Bの二次元マップ（画像）を確認。 </li><li>各xにおけるC のHbO及びC HBRを加算することにより総ヘモグロビン濃度C HBTの二次元マップを計算- y座標 。 </li><li>各xにおける総ヘモグロビン濃度C HBTによって酸素化ヘモグロビン濃度C のHbOを分割して局所脳酸素飽和度RSO 2の二次元マップを計算- y座標 。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルの中で最も重要なステップは、頭蓋窓を作るために薄くなった頭蓋骨領域の除去です。これは予期せぬ出血を避けるために、慎重に行われるべきです。この工程は、高い精度で反射率画像を拡散多重スペクトルの高品質を得るために重要です。可能な場合は実体顕微鏡の使用は、外科的処置のために推奨されます。ゼラチンスポンジの小片は、止血のために便利です。 この資料に記載された光学系は、光源の前方に位置する干渉フィルタを通して単色光を通過させます。これは、ビデオカメラのレンズやCCDカメラの前にフィルタホイールを配置することによって修飾することができます。ただし、この場合、異なる厚さを有する干渉フィルタを使用する場合の焦点面を可変することができ、これは、画像品質の劣化の原因となります。記録電極が挿入された場合には頭蓋窓のガラス板を除去する必要がありますこのような電気局所電場電位の測定値としての電気生理学的測定のための皮質組織へ。この場合、撮像システムは、皮質表面から望ましくない鏡面反射を検出することができます。この問題は、クロスニコル配向と偏光板のセットを使用することによって回避することができま...

マルチスペクトル拡散反射率イメージングは​​、皮質組織に固有の光信号（IOSs）の空間的マップを取得するための最も一般的な技術です。形態学的変化によって誘導される光散乱性の光吸収の変化とによる皮質血行動態の散乱特性、低減又はミトコンドリアにおけるシトクロムの酸化に依存して吸収の変化、および変形：IOSsは、主に3つの現象に起因するインビボ脳で観察され1。 近赤外（NIR）スペクトル範囲（VIS）可視光の光を効果的に吸収され、生体組織によって散乱されます。 インビボで脳の拡散反射スペクトルは、吸収および散乱スペクトルによって特徴づけられます。換算散乱係数は単調散乱スペクトルの展示にVIS-に-NIR波長範囲の結果で脳組織のs &#39; を μより長い波長で小さい大きさをINGの。等価散乱係数μスペクトルS「（λ）は、μSなどのべき乗則関数2、3の形態であると近似することができる」（λ）×λ-bを =。散乱電力Bは、組織2,3生体内生物学的散乱体の大きさに関連しています。組織及び皮質生体組織の生存率の減少の形態学的変化は、生物学的散乱体4、5、6、7、8、9の大きさに影響を与えることができます。 マルチスペクトル拡散反射結像光学系は、容易白熱リチウムから構築することができますGHTソース、簡単な光学部品、及びモノクロ電荷結合素子（CCD）。したがって、様々なアルゴリズムおよびマルチスペクトル拡散反射撮像のための光学系が皮質血行動態および/または組織形態10、11、12、13、14、15、16、17、18を評価するために使用されてきました。 この資料に記載された方法は、血行動態及び従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムを用いて、in vivoでのラット脳組織の光散乱特性の両方を可視化するために使用されます。代替技術に比べて、この方法の利点は、脳の血行動態および皮質組織の両方における時空間変化を評価する能力です形態学だけでなく、様々な脳機能障害の動物モデルへの適用。したがって、この方法は、外傷性脳損傷、てんかん発作、脳卒中、および虚血の調査のために適切であろう。

<table><tbody><tr><td>150W ハロゲンランプ光源</td><td>林時計製作所 (東京)</td><td>LA-150SAE</td><td></td></tr><tr><td>光ガイド</td><td>林時計製作所 (東京)</td><td>LGC1-5L1000</td><td></td></tr><tr><td>収集レンズ</td><td>林時計製作所 (東京)</td><td>SH-F16</td><td></td></tr><tr><td>干渉フィルター l@ 500 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) 東京</td> <td>#65088</td><td></td></tr><tr><td>干渉フィルター l@ 520 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン株式会社 (東京</td><td>)#65093</td><td></td></tr> 干渉<tr><td>フィルター l@ 540 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京</td><td>)#65096</td><td></td></tr> 干渉<tr><td>フィルター l@ 560 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京)</td> <td>#67766</td><td></td></tr> 干渉<tr><td>フィルター l@ 570 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京)</td> <td>#67767</td><td></td></tr><tr><td>干渉フィルター l@ 580 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン株式会社 (東京</td><td>)#65646</td><td></td></tr> 干渉<tr><td>フィルター l@ 600 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京</td><td>)#65102</td><td></td></tr><tr><td>干渉フィルター l@ 730 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京)</td> <td>#65115</td><td></td></tr> 干渉<tr><td>フィルター l@ 760 nm</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン (株) (東京)</td> <td>#67777</td><td></td></tr><tr><td>電動フィルターホイール&nbsp;</td><td>Andover Corporation, NH, USA</td><td>FW-MOT-12.5</td><td></td></tr><tr><td>8ビットモノクロCCDカメラ</td><td>THE IMAGINGSOURCE, Germany</td><td>DMK21BU618.H</td><td></td></tr><tr><td>ビデオズームレンズ</td><td>エドモンド・オプティクス・ジャパン株式会社</td><td>VZMTM300i</td><td></td></tr><tr><td>拡散反射率99%</td> 分光白色標準 <td>Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA SRS-99-020</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脳血行動態との光散乱特性の同時評価<em&gt;インビボ</emマルチスペクトル拡散反射率イメージングの使用&gt;ラット脳

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

脳血行動態とin vivoラット脳組織の光散乱特性の同時評価は、従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムを使用して実証されています。このシステムは、広帯域白色光源、狭帯域干渉フィルターのセットを備えた電動フィルターホイール、ライトガイド、収集レンズ、ビデオズームレンズ、および単色電荷結合デバイス(CCD)カメラで構成されています。楕円形の頭蓋窓は、イソフルラン麻酔下のラットの頭蓋骨に作られ、皮質表面のin vivoマルチスペクトル拡散反射画像をキャプチャします。ガス混合装置を使用して吸気酸素の割合を調節することで、正常酸素症、高酸素症、無酸素症などのさまざまな呼吸器状態を誘導することができます。次に、9つの波長(500、520、540、560、570、580、600、730、および760 nm)で測定されたマルチスペクトル拡散反射率画像に対してモンテカルロシミュレーションベースの重回帰分析を実行し、血行動態の2次元マップとin vivoラット脳の光散乱特性を視覚化します。

インビボラットの脳から得られた拡散反射の代表的なスペクトル画像を図3に示す.500,520,540,560,570,580nmの画像は、大脳皮質の血管の緻密なネットワークを明瞭に視覚化する。 600,730,760nmの画像で観察される血管と周囲組織との間のコントラストの低下は、より長い波長およびNIR波長でのヘモグロビンによる光のより低い吸収を反映する。 図4は、酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、全ヘモグロビン濃度、局所脳酸素飽和度、および散乱力についての暴露されたラット脳の代表的な推定画像を示す。 図3のより短い波長の拡散反射像から予想されるように、血液中の全ヘモグロビン濃度SEL領域は、周囲の組織の領域におけるよりも高いです。一方、細動脈における酸素化ヘモグロビン濃度は動脈血中のヘモグロビンは、はるかに酸素静...

脳血行動態およびin vivoでのラット脳組織の光散乱特性の同時評価は、従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムを用いて実証されています。

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

この手順の全体的な目的は、生体内脳組織の血液動態および光散乱特性を可視化することです。この手法は、ラット脳組織における固有光学信号のイメージングを用いることで、バイオメディカル光学分野における重要な課題の解明に寄与します。本技術の主な利点は、脳血流動態および皮質組織形態における特有の時間的変化を評価できる点にあります。この手法の意義は、さまざまな脳疾患モデルにおいて、脳機能および生存能のモニタリング全般に及ぶと考えられます。なぜなら、これらの動物モデルを用いた実験は、多くの場合、頭蓋窓（cranial window）を通じて行われるためです。したがって、本手法は固有光学信号に関する知見を提供することができ、また他のスペクトルイメージング技術にも適用可能です。まず、ラットの頭部を脳定位固定装置に固定します。麻酔後、皮膚表面が見えるまで、予定切開部位より広い範囲の頭部をバリカンで除毛します。次に、外科用メスを用いて、頭部正中線に沿って約20 millimetersの縦切開を加えます。そして、皮下結合組織を露出させます。鋭利なキュレットを用いて皮下結合組織を取り除き、頭部の両側に引っ張って頭蓋骨を露出させます。次に、高速ドリルを使用して、頭蓋縫合線内の頭蓋骨に楕円形の溝を掘ります。次に、溝の中の頭蓋骨をゆっくりと均一に削り取ります。脳血管が現れたら、ピンセットの先端で薄くなった頭蓋骨の表面を軽く押し、骨の厚さと強度を推定します。その後、ピンセットの先端を用いて、薄くなった頭蓋骨の楕円形の境界線を少しずつ切り取ります。そして、薄くなった頭蓋骨を脳表面からゆっくりと取り除きます。最後に、生理食塩水で頭蓋窓を穏やかに洗浄し、厚さ約0.1ミリメートルの透明なガラス板で覆います。まず、チューブを用いて、コネクター1と呼ばれるY字型チューブの第1ポートを、コネクター2と呼ばれる別のY字型チューブの第1ポートに接続します。次に、マウスピースの入口ポートをチューブコネクタ1の第2ポートに接続します。続いて、チューブを用いてチューブコネクタ1の第3ポートを酸素濃度モニター装置に接続します。同様に、チューブを用いてチューブコネクタ2の第2ポートを麻酔機の出口ポートに接続し、別のチューブを用いてチューブコネクタ2の第3ポートをガス混合装置の出口ポートに接続します。次に、チューブを用いてガス混合装置の一方の入口ポートを高圧の95%O2 5%CO2ガスシリンダーに接続します。同様に、ガス混合装置のもう一方の入口ポートを高圧の95%N2 5%CO2ガスシリンダーにチューブで接続します。その後、ガス混合装置の回転ノブを使用して、O2およびN2のガス流量を調整します。最後に、酸素濃度モニターを使用して、吸入酸素分画（fio2）を確認し調整します。ラットを静かにステージ上に配置し、カメラがラット脳の表面に焦点を合わせられるよう、ゆっくりとステージの高さを調整してください。画像取得ソフトウェアのファイルメニューから保存コマンドを選択し、サンプル名と波長に従って名前を付けて画像をファイルに保存します。次に、フィルターホイールを回転させてフィルターの位置を変更します。9つの波長のそれぞれで画像取得を繰り返します。その後、ハロゲンランプ光源をオフにします。遮光板を使用して、単色電荷結合素子（CCD）カメラシステムへの光路を遮断します。最後に、ファイルメニューから保存コマンドを選択し、サンプルを識別できるファイル名を指定します。ここでは、生体内で露出させたラット脳のヘモグロビン濃度、酸素飽和度、および散乱能の推定画像を示します。動脈における酸素化ヘモグロビン濃度および局所酸素飽和度は、静脈におけるそれらよりも高くなります。ここでは、光散乱能Bにおける FiO₂ の変化に伴う、露出したラット脳の画像を示します。Bの値は、アノキシア（無酸素状態）の開始から呼吸停止までの期間にわずかに増加しましたが、アノキシア開始後5分から30分までの期間には継続的に減少しました。この手法を習得し、適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。分光画像を測定する際は、光学部品の配置を維持することが重要です。本手順に続いて、急速マルチスペクトルイメージングなどの他の手法を行うことで、光学的な内在性信号に関するさらなる疑問を解消することができます。このビデオを視聴することで、生体内で露出させたラット脳の血行動態および光散乱特性を可視化する方法について十分に理解できるはずです。イソフルランの使用には危険が伴うため、麻酔ガスの流量は麻酔ガス回収装置を用いて制御する必要があることに留意してください。

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