体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

この生細胞イメージング技術の全体的な目標は、固定を必要とせずに化学療法剤の取り込みや分布などの細胞プロセスを追跡することです。これらの方法は、がん分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます:化学療法剤が遊離型またはナノ粒子にカプセル化されたものが腫瘍細胞にどのように取り込まれるか。この技術の主な利点は、生細胞をイメージングすることで、固定アーチファクトを防ぎ、リアルタイムの動的評価を可能にすることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ナノパーティカルが固定中に壊れ、薬物送達の誤解につながることを観察したときでした。イメージングチャンバーを組み立てるには、チャンバーの底部に25mmのカバーガラスを置き、上部を下部にねじ込みます。ガラスが割れる可能性があるため、強く締めすぎないでください。

チャンバー全体をオートクレーブします。細胞をプレートするには、層流キャビネット内の滅菌バッグからイメージングチャンバーを取り出します。チャンバーを慎重に締め、ペトリ皿に入れます。

イメージングチャンバーのガラスに1ミリリットルの0.1%滅菌ゼラチンを37°C、5%の二酸化炭素で20分間コーティングします。細胞培養フラスコから培地を取り除いた後、1x PBSで細胞を一度洗浄し、0.25%トリプシンを使用して細胞を剥離します。細胞培養培地を添加してトリプシンを不活性化します。

次に、細胞を回収し、1,100Gで5分間スピンダウンします。ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。テキストプロトコールに記載されているように細胞をカウントした後、ゼラチンを吸引し、24時間以内に最大70%のカバレッジを可能にする希釈で細胞をプレート化します。

細胞を5%の二酸化炭素と摂氏37度で24時間接着させます。顕微鏡下で細胞のコンフルエンシー、細胞形態、および汚染について評価を行います。次に、共焦点顕微鏡、蛍光灯、およびコンピューターのスイッチを入れます。

レンズヒーターを対物レンズに接続し、35度に設定します。テキストプロトコルに示されているようにインキュベーションユニットを準備します。インキュベーションユニットを顕微鏡ステージに置き、インとアウトフローの二酸化炭素チューブを接続します。

メインの二酸化炭素バルブを開き、二酸化炭素コントローラーのスイッチを入れます。コントローラーが5%の二酸化炭素に設定されていることを確認します。温度、CO2、pH、湿度、無菌性などの適切な細胞培養条件は、長期的な細胞イメージングにとって非常に重要です。

ですから、各インキュベーターについて、適切にテストする必要があります。ステージの温度を摂氏37度に設定します。インキュベーションユニットが選択した温度と二酸化炭素の割合に達するまで待ちます。

メインの二酸化炭素インキュベーターからイメージングチャンバーを取り出し、チャンバーをペトリ皿に入れて顕微鏡室に運びます。イメージングチャンバーをカスタムメイドの直径35mmのステージホルダーに入れ、カスタムメイドのシーリング蓋でチャンバーを閉じます。インキュベーションユニットを開き、細胞の冷却を防ぐためにできるだけ早く作業します。赤いパッチをイメージングチャンバーと交換してから、ユニットを閉じます。

ステージと顕微鏡の間にケーブルが挟まっていないことを確認してください。ユニットを放置して30分間順応させます。次に、ソフトウェアを開き、レーザーのスイッチを入れます。

[ファイル] タブの [新規] をクリックして、新しいデータベースを作成します。データベースに名前を付けて保存します。[Acquire] タブの [Config] をクリックして、設定を設定します。

「Channel Mode」と「Single Track」を選択して、単一の蛍光色素を評価します。「マルチトラック」を選択して、いくつかの蛍光色素を検出します。次に、蛍光色素に一致する適切なバンドパスフィルターを選択します。

トラックの 1 つで明視野チャネルを選択します。スキャンは、化合物の蛍光シグナルと画像の品質の間で損なわれます。露出過多、光退色、S/N比、細胞の品質、添加された化合物はすべて結果に影響を与える要因であり、適切にテストする必要があります。

[取得]タブの下の[スキャン]をクリックして、スキャンコントロールを設定します。次に、「モード」をクリックして、フレームサイズ、スキャン速度、スキャン方向、およびスキャン平均を設定します。「チャンネル」をクリックして、ピンホール、ゲインとオフセット、およびレーザー出力を設定します。

これらの設定を「Configuration」タブで「Config」をクリックして保存し、Configuration データベースに保存します。[マクロ]タブで[Muti TimeX]をクリックしてタイムラプスを設定し、[シングルロケーション]をクリックします。

[Single Track] をクリックして保存した構成を適用し、構成データベース内の必要な構成までスクロールします。スキャンの時間間隔と回数を設定します。[Load Conf] をクリックして設定をロードします。

「Base File Name」でタイムラプスに名前を付け、「Image Data Base」をクリックしてデータベースを選択し、タイムラプスを保存します。「Temporary Image Folder」をクリックして一時フォルダを設定します次に、インキュベーションユニットを開き、イメージングリングを持ち上げ、対物レンズにイマージョンオイルを一滴加え、できるだけ早くユニットを閉じます。イメージングチャンバー内の位置に焦点を合わせて選択します。

層流キャビネットでは、細胞培養培地中の薬物1ミリリットルあたり5マイクログラムの濃度または0.05マイクロモルの脂質で、遊離薬物またはナノ粒子を希釈します。薬物またはナノ粒子が無菌でない場合は、0.22ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。インキュベーションチャンバーを開け、天井蓋を持ち上げます。

次に、細胞から培地を取り出し、1ミリリットルの希釈薬物またはナノ粒子を加え、できるだけ早くユニットを閉じます。セルに焦点を合わせ、[スキャン制御]タブの[シングル]をクリックして高速スキャンを行います。明視野画像にフォーカスされた細胞が表示されたら、Multi TimeX Macroの「Start Time」をクリックしてタイムラプスを開始します。

繰り返し回数と残り時間は、マクロと画像に表示されます。セルにまだ焦点が合っているかどうかを定期的に確認するか、オートフォーカスを使用します。プログラムは、タイムラプスをデータベースに自動的に保存します。

プログラムの実行中はデータベースを閉じないでください。これは、遊離ドキソルビシンに曝露された細胞の3時間のタイムラプスです。赤色蛍光ドキソルビシンの核への取り込みと即時転座を観察します。

ここでは、細胞をカプセル化したドキソルビシンで3時間インキュベートします。蛍光シグナルははるかに低く、細胞質に位置しています。信号は原子核ではほとんど見えません。

これらのタイムラプス動画を画像Jに伝送することで、原子核の周囲に関心領域を描き、画素密度を測定することができます。ここに示すグラフは、遊離ドキソルビシンまたはカプセル化ドキソルビシンでインキュベートされた細胞の経時的な核吸収の違いを示しています。ここに示されているのは、カプセル化されたドキソルビシンとインキュベートされた細胞です(赤で示されています)。

紫色のシグナルはキャリアを表し、リソソームは緑色のライブセルマーカーで染色されています。両方の細胞タイプを比較すると、リソソームの分布に違いがあることがわかります。B16BL6細胞のリソソームは、細胞質全体に分布しています。

一方、BLM細胞のリソソームは核の近くに位置しています。しかし、どちらの細胞株もリソソームでは赤シグナルと紫シグナルの高い共局在を示しており、ドキソルビシンとそのキャリアがこれらのオルガネラに閉じ込められていることを示しています。このビデオを見れば、生細胞における化学療法剤やその他の蛍光マーカーの取り込みを数時間または数日間どのように画像化するかを十分に理解できるはずです。