体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

このライブセルイメージング技術の全般的な目的は、固定操作を行うことなく、化学療法剤の取り込みや分布などの細胞内プロセスを追跡することです。これらの手法は、遊離状態またはナノ粒子に封入された化学療法剤が、どのように腫瘍細胞に取り込まれるかといった、がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、生細胞をイメージングするため、固定によるアーティファクトを防ぎ、リアルタイムで動的な評価が可能になることです。

この手法を考案したきっかけは、固定中にナノ粒子が崩壊し、薬物送達の誤認につながる様子を観察したことでした。イメージングチャンバーを組み立てるには、チャンバーの底部に25 millimeterのカバーガラスを配置し、上部を底部にねじ込みます。ガラスが破損する恐れがあるため、強く締めすぎないようにしてください。

チャンバー全体をオートクレーブで滅菌します。細胞を播種するために、ラミナーフローキャビネット内で滅菌バッグからイメージングチャンバーを取り出します。チャンバーを慎重に締め、ペトリ皿に設置します。

イメージングチャンバーのガラス面を、0.1%の滅菌ゼラチン1 mLで、37°C、5% CO₂の条件下で20分間コーティングします。細胞培養フラスコから培地を除去した後、細胞を1x PBSで1回洗浄し、0.25% Trypsinを用いて細胞を剥離させます。細胞培養培地を添加してTrypsinを不活化します。

次に、細胞を回収し、1,100 Gで5分間遠心分離します。ペレットを5 mLの細胞培養培地で再懸濁します。テキストプロトコルに従って細胞数をカウントした後、ゼラチンを吸引し、24時間以内に最大70%のコンフルエンスとなる希釈濃度で細胞を播種します。

5% 二酸化炭素、37°C の条件下で 24 時間おいて細胞を接着させます。顕微鏡下で細胞のコンフルエンシー、細胞形態、およびコンタミネーションの有無を確認します。その後、共焦点顕微鏡、蛍光灯、およびコンピュータの電源を入れます。

レンズヒーターを対物レンズに接続し、35°Cに設定します。テキストプロトコルに従ってインキュベーションユニットを準備します。インキュベーションユニットを顕微鏡ステージ上に設置し、二酸化炭素の流入および流出チューブを接続します。

二酸化炭素のメインバルブを開き、二酸化炭素コントローラーの電源を入れます。コントローラーが5%の二酸化炭素に設定されていることを確認してください。温度、CO2、pH、湿度、および無菌状態などの適切な細胞培養条件は、長期的な細胞イメージングにおいて極めて重要です。

したがって、各インキュベーターを適切にテストする必要があります。ステージ温度を37°Cに設定してください。インキュベーションユニットが設定温度および二酸化炭素濃度に達するまで待機してください。

二酸化炭素インキュベーターからイメージングチャンバーを取り出し、シャーレに入れて顕微鏡室まで運搬します。イメージングチャンバーを特製の直径35mmステージホルダーにセットし、特製のシーリングリッドでチャンバーを密閉します。インキュベーションユニットを開き、細胞の温度低下を防ぐため可能な限り迅速に、赤いパッチをイメージングチャンバーに交換して、ユニットを閉じます。

ステージと顕微鏡の間にケーブルが挟まっていないことを確認してください。装置を30分間静置して室温に馴染ませます。次に、ソフトウェアを起動し、レーザーの電源を入れます。

「File」タブの「New」をクリックして、新しいデータベースを作成します。データベースに名前を付けて保存してください。「Acquire」タブの「Config」をクリックして、設定を行います。

単一の蛍光色素を評価する場合は、「Channel Mode」と「Single Track」を選択してください。複数の蛍光色素を使用する場合は、「Multi Track」を選択します。その後、使用する蛍光色素に適合する適切なバンドパスフィルターを選択してください。

いずれかのトラックで明視野チャンネルを選択してください。スキャンにおいては、化合物の蛍光信号と画像品質の間にトレードオフが生じます。過剰露光、光退色、S/N比、細胞の状態、および添加した化合物はすべて結果に影響を与える要因であり、適切に検証する必要があります。

Acquireタブの下にある「Scan」をクリックして、スキャン制御を設定します。次に「Mode」をクリックし、フレームサイズ、スキャン速度、スキャン方向、およびスキャン平均回数を設定します。「Channels」をクリックして、ピンホール、ゲインおよびオフセット、ならびにレーザー出力を設定します。

「Configuration」タブの「Config」をクリックしてこれらの設定を保存し、Configurationデータベースに保存します。「Macro」タブの「Muti TimeX」をクリックしてタイムラプスを設定します。「Single Location」をクリックします。

「Single Track」をクリックして保存済みの構成を適用し、構成データベースから必要な構成までスクロールします。時間間隔とスキャン回数を設定します。「Load Conf」をクリックして構成をロードします。

「Base File Name」にタイムラプスの名前を入力し、「Image Data Base」をクリックしてタイムラプスを保存するデータベースを選択します。「Temporary Image Folder」をクリックして一時フォルダを設定します。次に、インキュベーションユニットを開き、イメージングリングを持ち上げて、対物レンズに浸漬油を1滴滴下し、速やかにユニットを閉じます。イメージングチャンバー内の位置を選択し、ピントを合わせます。

層流キャビネット内で、遊離薬物またはナノ粒子を、薬物濃度 5 µg/mL または脂質 0.05 µmol となるように細胞培養培地で希釈します。薬物またはナノ粒子が滅菌されていない場合は、0.22 µm のシリンジフィルターでろ過してください。インキュベーションチャンバーを開き、天井蓋を持ち上げます。

次に、細胞から培地を除去し、1 mLの希釈した薬剤またはナノ粒子を加え、可能な限り速やかにユニットを閉じます。細胞にフォーカスを合わせ、「Scan Control」タブの「Single」をクリックして高速スキャンを行います。明視野像で細胞にピントが合っていることが確認できたら、「Multi TimeX Macro」の「Start Time」をクリックしてタイムラプス撮影を開始します。

繰り返し回数と残り時間は、マクロおよび画像内に表示されます。細胞が依然としてフォーカス内にあるか定期的に確認するか、オートフォーカスを使用してください。プログラムによって、タイムラプスは自動的にデータベースに保存されます。

プログラムの実行中にデータベースを閉じないでください。これは、遊離ドキソルビシンにさらされた細胞の3時間のタイムラプス動画です。赤色蛍光ドキソルビシンの取り込みと、核への即時転位を観察してください。

ここでは、細胞をカプセル化されたDoxorubicinとともに3時間インキュベートします。蛍光シグナルは大幅に低下しており、細胞質に位置しています。核におけるシグナルはほとんど視認できません。

これらのタイムラプス動画をImage Jに転送し、核の周囲に関心領域（ROI）を設定することで、画素密度を測定できます。ここに提示したグラフは、遊離のドキソルビシンまたはカプセル化されたドキソルビシンを添加して培養した細胞における、核への取り込み量の経時的な差を示しています。ここでは、カプセル化されたドキソルビシンを用いて培養した細胞を赤色で示しています。

紫色のシグナルはキャリアを示し、リソソームは緑色の生細胞マーカーで染色されています。両方の細胞型を比較すると、リソソームの分布に違いがあることがわかります。B16BL6細胞のリソソームは、細胞質全体に分布しています。

BLM細胞では、リソソームは核の近傍に位置しています。しかし、どちらの細胞株においても、リソソーム内で赤色と紫色の信号が高い共局在を示しており、ドキソルビシンとそのキャリアがこれらの細胞小器官に捕捉されていることがわかります。このビデオを視聴することで、生細胞における化学療法剤やその他の蛍光マーカーの取り込みを、数時間または数日間にわたってイメージングする方法について深く理解することができるはずです。