列およびレイヤーで樹状形態を分析します

このプロトコルの全体的な目標は、成虫のショウジョウバエの髄質ニューロンの樹状突起ルーティングを列および層で解析して、樹状パターンを特徴付け、形態に基づいて細胞タイプを決定し、変異体を同定することです。この方法は、脳回路のマッピングや樹状突起の配線メカニズムの理解など、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、樹状突起特性を3次元空間で受け継ぐため、樹状突起配線のロジックと機能の理解が向上することです。

この手順の目標は、直交する、水平する、および正面の2つの向きで、目的のニューロンの2つの画像スタックを取得することです。標準的な技術を使用して、解剖したハエの脳をウサギ抗GFPと光受容体軸索一次抗体を標識する抗体で染色します。次に、一次抗体を蛍光二次抗体で標識し、70%グリセロールと1X PBSで脳を透明にします。

脳を水平方向にマウントするには、グリセロールで透明化した脳を、顕微鏡スライドの中央に堆積した20マイクロリットルの退色防止封入剤に移します。次に、カバースリップの四隅に粘土の小さなパッチを取り付けて、カバースリップが脳を押しつぶさないようにします。次に、解剖顕微鏡の下で、脳を腹側を上にして位置に配置します。

脳の凸面の背側を目印にして、脳サンプルの向きを特定します。これにより、ニューロンの水平方向のビューが提供されます。次に、カバースリップを取り付けます。

GaAsP検出器を理想的に装備した共焦点顕微鏡を使用すると、高開口対物レンズと2.5のデジタルズームを備えた水平ビュー画像スタックが得られます。少なくとも 180 の光学セクションを取得し、512 の正方形ピクセルと 2 ミクロンのステップ サイズを持ちます。最初の画像スタックを撮った後、スライドからカバースリップを取り外し、脳を正面図を提供する前方を上にした位置に再配置します。

次に、同じ手法を使用して、水平図で画像化された同じニューロンの正面図の新しい画像スタックを作成します。また、髄質神経細胞に対する目的のニューロンの位置も必ず記録してください。同じニューロンを同定することは、低倍率で実現可能です。

ただし、組織が深いために信号が失われた場合は、脳の腹側半分をイメージしてください。また、画像スタックを調べて、画像取得中にサンプルが移動したかどうかを確認します。イメージ・デ・コンボリューションとイメージ結合については、テキスト・プロトコルで詳しく説明しています。

この手順の目標は、神経突起を追跡し、登録のための参照ポイントを割り当てることです。まず、再結合された画像ファイルを開きます。次に、編集に移動します。

次に、ディスプレイ調整を表示し、赤の視細胞チャネルをオフにします。次に、超越モードで画像を視覚化します。コンピューターにステレオグラフシステムが装備されている場合は、ステレオをオンにし、クワッドバッファモードを使用して3D画像を視覚化します。

新しいフィラメントを追加し、surpass、次にフィラメントに移動し、[自動作成をスキップし、手動で編集する]というラベルの付いたタブをクリックします。次に、描画タブをクリックして、AutoDepthを選択します。次に、設定を選択します。

線オプションを切り替えて、適切なピクセル番号を入力すると、見やすくなります。次に、樹状突起、始点、分岐点の表示を切り替え、レンダリング品質を100%に設定します次に、描画タブを選択して、神経突起のトレースを開始します。軸索から始めて、次に樹状突起に移動します。

トランス髄質ニューロンの軸索と樹状突起は、簡単に区別できるはずです。神経突起をトレースした後、設定に戻り、開始点と分岐点の両方を切り替えます。次に、surpassに移動し、次にエクスポートします。

オブジェクトを選択し、フィラメントをインベンターファイルとして保存します。次のステップは、参照ポイントを割り当てることです。まず、表示調整の表示を選択し、両方のイメージングチャンネルをオンにします。

次に、surpasse、次に測定に進みます。また、編集タブで特定のチャンネルを切り替え、この場合は光受容体チャンネルを選択します。次に、最上位レイヤーに参照ポイントを割り当てます。

[surpass] を選択し、次に [測定点] を選択し、m1 レイヤーの先頭を最上位レイヤーとしてマークします。クリッピング平面機能を使用して、ポイントの割り当てを容易にします。ポイントの順序は、赤道、前赤道、前、腹側、腹側、腹側、後、赤道、および中心です。

中心の光受容体を見つけるには、最も樹状突起に関連する光受容体です。次に、同じ手法を使用して、R8 レイヤーと R7 レイヤーの参照ポイントを割り当てます。参照点の各セットを定義したら、座標をエクスポートします。

統計を選択し、次に詳細、特定の値、および位置を選択します。次に、タブ表示の統計をファイルにエクスポートを選択し、座標をCSVファイルとして保存します。次に、スプレッドシートエディタで3つのCSVファイルを開きます。

27 個の参照点の座標をコピーして、top、R8、R7 の順に新しいファイルに貼り付けます。剛体およびTPS非線形レジストレーション標準化のためのテキストプロトコルに従って、樹状突起分岐および終端周波数の計算において、右腹側配置への標準化を進めます。最終的に、データはさまざまな有益なプロットを作成するために使用されます。ここで提示したデュアルビューイメージング手順を使用して、まばらに標識されたtm 20ニューロンを含むハエの脳を2つの直交方向にイメージングしました。

画像の再結合により、軸方向の解像度が向上します。再結合された画像は、水平ビュー画像や正面図画像よりも解像度が高くなります。3Dモデルを参照した後、15 tm 20ニューロンから樹状突起痕跡を収集し、15 tm 2ニューロンからの樹状突起痕跡と比較しました。

これらのニューロンの分岐確率と終了確率を分析しました。どちらのタイプも、4ミクロン未満のセグメントで類似していました。樹状突起終結の層特異的解析により、2つのニューロンタイプが異なる層特異的な方法で分布することが示されました。

Tm 2 樹状突起は、m2 と m5 で入力を受け取ります。tm 20樹状突起はm1からm3の層で終端します。平面解析では、tm 2 樹状突起は前方に突き出ており、tm 20 樹状突起は後方に突き出ていることが示されています。

このビデオを見れば、2つの共焦点画像を取得する方法についてよく理解できるはずです。イメージングファイル上のスタディマークを読み取り、これらの画像から樹状突起特性を抽出します。この手順を試行する際は、共焦点イメージングの前にサンプルを適切にマーキングすることが重要です。

イメージング中にサンプルが移動すると、イメージングの組み合わせが失敗します。