Name: 列およびレイヤーで樹状形態を分析します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ デュアルビューイメージングと計算ツールを用いて、ショウジョウバエの視床ニューロンの樹状突起配線を3次元空間で分析する手法。この方法は神経回路のマッピングと細胞タイプの決定に貢献します。

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この作品は、国立衛生研究所の学内研究プログラムによってサポートされていた、子どもの健康と人間開発（C.-HLへの助成金HD008913）のユニス・ケネディ・シュライバー国立研究所、情報技術のためのセンター（PGM、NP、ESM 、およびMM）。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、画像にどのように表示し、 ショウジョウバエの延髄ニューロンの樹状アーバーを分析します。最初のセクション、デュアルビュー画像は、高解像度の画像をスタックに2つの画像スタックのデコンボリューションおよび組み合わせが記載されています。第二セクション、樹状突起のトレースと登録は、参照列配列に延髄の神経細胞の樹状突起のトレースと登録について説明します。第3セクション、樹状分析は、樹状パターンを分析するためのカスタムスクリプトの使用を記載しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列に対する樹状パターンに関する情報を抽出し、樹状分岐及び終了周波数を決定するために、完全なワークフローを提供します。 ここで提示デュアルビューイメージング法は直交収集二つ以上の画像スタックが高い軸resolutioを達成するために再結合される光シート顕微鏡で実現多視点画像化技術、概念的に類似していますnは17、18。しかし、直交細長いデンドライトを撮像するために必要と...

開発中に複雑で、ニューロン精巧な樹状突起が、そのシナプス前パートナーとシナプスを形成するための分岐パターンをステレオタイプ。樹状分岐パターンは、ニューロンのアイデンティティと機能と相関します。樹状分岐の複雑さとフィールドのサイズは、入力された番号を管理しながら、樹状アーバーの場所は、彼らが受け取るシナプス前入力のタイプを決定します。このように、樹枝状の形態学的特性は、シナプス接続と神経計算のための重要な決定因子です。フライ視神経ローブと脊椎動物の網膜のような複雑な脳の多くの地域では、シナプス回路は、情報処理1、2を容易にするために、列およびレイヤーで構成されています。このようなコラムと層組織では、明確なモダリティプロジェクトの軸索のシナプス前ニューロンは特定の層（いわゆる層特異的標的）で終了すると整然とした2次元アレイを形成する（いわゆるのcalleD地形図）、シナプス後ニューロンは、正しい種類と数のシナプス前入力を受信するために特定の層に適切なサイズの樹状突起を拡張しながら。層と列への標的軸索は、よく3、4を研究してきたが、はるかに少ないが、樹状突起は、特定の層にルーティングし、正しいシナプス前パートナー5とのシナプス結合を形成するために、受容野を適切に展開する大きさであるかについては知られています。イメージングおよび層と列への標的定量化する樹状の難しさは、柱状の積層脳構造における樹状開発の研究を妨げてきました。 ショウジョウバエ髄質ニューロンは、列と層における樹状ルーティングおよび回路アセンブリを研究するための理想的なモデルです。フライ髄質の神経網は、3D 10層の格子と約750列として編成されています。各列は、pを含む求心性神経のセットによって神経支配されますその軸索端子層特異的なファッション6で地形を形成L5、 - hotoreceptors R7 / R8およびラミナニューロンL1。延髄のニューロンの約38種類が、これらの求心性神経7からの入力を受信するための特定の層で、適切なフィールドサイズを持つすべての髄質列と精巧な樹状突起に存在しています。髄質におけるシナプス回路は、電子顕微鏡レベルで再構築されてきました。従って、シナプスパートナーシップウェル7,8を設置しています。さらに、髄質ニューロンの様々な種類を標識するための遺伝的ツールは、9、10、11入手可能です。 transmedullaの3種類（Tm）は、ニューロン（TM2、TM9及びTM20）を調べることによって、我々は以前に二つの細胞型特異的な樹枝状の属性を特定した：（ⅰ）のTmニューロンは、平面PROJ（前方または後方方向のいずれかに樹状突起を投影しますection方向）、細胞の種類に応じて、及び（ii）の延髄の神経細胞の樹状突起は、細胞型特異的な様式（層特異的な終端）12で特定の髄質層で終端します。層および列合図へのTmの応答を破壊する突然変異が、これらの属性の異なる側面に影響を与えながら、平面投影方向と層固有の終端は、Tmのニューロンのこの3種類を区別するのに十分です。 ここでは、列および層（ 図1）におけるショウジョウバエ延髄ニューロンの樹状突起パターン形成を調べるための完全なワークフローを提示します。まず、2つの共焦点画像を結合するカスタマイズされたソフトウェアを使用してデュアルビューイメージング法は、高品質の等方性の画像を生成するためにスタックを示しています。この方法は、超解像顕微鏡法に頼らずに、樹状分岐の信頼性トレースを可能にする高品質の画像を生成するためにのみ、従来の共焦点顕微鏡検査を必要とするようなsのSTED（誘導放出枯渇）または構造的照明。第二に、我々は、樹状アーバをトレースするための、参照列配列に生じた神経突起のトレースを登録するための方法を提示します。第三に、我々は、樹状分岐および終了周波数の推定値を導出するための樹状突起の平面投影方向と層固有の終了に関する情報、ならびにを抽出するための計算方法を示しています。一緒に、これらの方法は、3D、樹状突起の形態に基づいて細胞種の分類における樹状パターンの特徴付け、および変異体における潜在的な欠陥の同定を可能にします。

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>version 16.05</td><td>for image deconvolution (https://svi.nl).&nbsp; 商用ソフトウェア</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>version 7.3.0</td><td>for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); フリーウェア</td></tr><tr><td>MIPAV プラグイン: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td>フリーウェア</td></tr><tr><td>MIPAV プラグイン: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>フリーウェア</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>神経突起のトレースと画像登録の基準点の割り当て (http://www.bitplane.com); 商用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>swc ファイルを視覚化 (https://github.com/Vaa3D/release/releases/);樹</td></tr><tr><td>状突起(http://www.mathworks.com)の形態計測解析用の</td>フリーウェア<td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td>、商用ソフトウェア</tr><tr>Matlabツールボックス:<td>樹状突起形態測定パラメータ(http://www.treestoolbox.org/download.html)の解析用</td><td>TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td>、フリーウェア</tr><tr><td>Matlabツールボックス:Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>形態測定パラメータの計算用(https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration)。フリーウェア</td></tr><tr><td>名義</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sample files</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC ファイル定義</td><td></td><td></td><td>http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>画像の組み合わせとレジストレーション</td><td></td><td></td>のコードとサンプルファイル <td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>基準点の例&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>コンピュータシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 または Macintosh OS X 10.7 以降</td><td></td><td></td><td>3GHz 64 ビット クアッドコア プロセッサ、16G RAM (最小)</td></tr><tr><td>オプション: Quadro4000&nbsp;(またはそれ以上)樹</td><td>状突起の立体的視覚化のための</td>グラフィックカード<td>Nvidia</td><td></td>。</tr><tr><td>オプション: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>オプション: NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td><td>用</td> 120 Hz LCD ディスプレイ http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</イメージング用strong></td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10</td>抗体 <td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Antibody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 退色防止マウンティング ミディア</td>ム <td>ベクター ラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>マウンティング&nbsp;クレイ&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーS04179</td><td></td></tr><tr><td>70%グリセロール含有1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス、高性能、D = 0.17&nbsp;mm</td><td>ツァイス</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

このようなフライ光学ローブと脊椎動物皮質などの中枢神経系の多くの地域では、シナプス回路が発達した動物での開発と情報の処理中に脳の配線を容易にするための層と列に編成されています。特定の層における型特異的なパターンで精巧な樹状突起シナプス後ニューロンは、適切なシナプス前終末とシナプスします。フライ髄質の神経網は10層と約750列で構成されます。各カラムは、型特異的様式で求心性のいくつかの7種類の軸索の端末と一致延髄のニューロンの38種類以上の樹状突起によって神経支配されています。このレポートでは、画像に手順を詳しく説明し、延髄の神経細胞の樹状突起を分析します。ワークフローは、次の3つのセクションを含む：（I）デュアルビュー撮像部は、樹状突起の高解像度3D画像に直交する方向で集め2の共焦点画像スタックを結合します。 （ⅱ）デンドライトはトレースと登録部は、樹状をトレース3Dでアーバーと参照列配列に樹枝状のトレースを登録します。 （iii）は、樹状分析部は、樹状アーバーの層特異的な終端と平面投影方向を含む列と層に対する樹状パターンを解析して、樹状分岐および終了周波数の推定値を導出します。プロトコルは、マトリックス研究所言語でオープンソースのMIPAV（医療画像処理、分析、および可視化）プラットフォームとカスタムツールボックス上に構築されたカスタムプラグインを利用しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列にショウジョウバエ髄質ニューロンの樹状経路を分析する細胞型を同定するため、および変異体の欠陥を決定するために、完全なワークフローを提供します。

ここで提示デュアルビュー画像化手順を使用して、まばらに標識TM20ニューロンを含むハエの脳は、二つの直交する方向で画像化しました。撮影の前に、脳は、膜繋留GFPと感光体軸索を可視化するための適切な一次および二次抗体で染色しました。イメージングのために、脳の第1の水平方向に取り付けた（ 図2A、B）。 GFP標識TM20ニューロンと周囲の光受容体の軸索は、共焦点顕微鏡（ 図3A）を使用して画像化しました。脳はその後、（ 図2A、B）再整列させたと同じTM20ニューロンは前頭向き（ 図3B）に再画像化しました。イメージングプロセスの間に、TM20ニューロンの位置は右延髄神経網（RV構成）の腹側半分であると同定されました。これら2つの画像スタックは、画像復元ソフトウェアとRECを使用してデコンボリューションしました。組換え画像スタック（ 図3C &#39;）を生成するMIPAV（ 図3C）を</...

ここでは、列およびレイヤーにショウジョウバエ延髄ニューロンの樹状突起のルーティングを分析する方法を示しています。ワークフローは、トレース基準列配列の樹状アーバーを登録すると、3次元空間内の樹枝状構造を分析するための画像品質と計算ツールを改善するためのデュアルビューイメージング技術を含みます。

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

本プロトコルの目的は、成体ショウジョウバエの髄体ニューロンにおける樹状突起のコラムおよびレイヤーへのルーティングを解析し、樹状突起パターンの特性評価、形態に基づく細胞型の決定、および変異体の同定を行うことです。この手法は、脳回路のマッピングや樹状突起の配線メカニズムの解明など、神経科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、三次元空間における樹状突起の特性を継承して解析できるため、樹状突起の配線ロジックと機能に関する理解を深められる点にあります。本手順の目的は、目的のニューロンについて、直交する2方向（水平方向および前面方向）から2つの画像スタックを取得することです。標準的な手法を用いて、解剖したショウジョウバエの脳をウサギ抗GFP抗体および光受容体軸索を標識する一次抗体で染色します。次に、一次抗体を蛍光二次抗体で標識し、70% glycerolおよび1X PBSで脳を透明化します。脳を水平方向にマウントするには、グリセロールで透明化した脳を、顕微鏡スライドの中央に滴下した20 µLの抗退色マウント剤に移します。次に、カバーガラスの四隅に少量の粘土を貼り付け、カバーガラスが脳を圧迫するのを防ぎます。その後、解剖顕微鏡下で、脳を腹側が上になるように配置します。脳の凸状の背面をランドマークとして、脳サンプルの向きを確認します。これにより、ニューロンを水平方向から観察することが可能になります。その後、カバーガラスを固定します。GaAsP検出器を搭載した共焦点顕微鏡を使用し、高開口数対物レンズと2.5倍のデジタルズームを用いて、水平方向の画像スタックを取得します。光学切片を少なくとも180枚、画素数を512×512ピクセル、ステップサイズを2 micronsに設定して撮影してください。最初の画像スタックを取得後、スライドからカバーガラスを取り外し、前方（anterior）が上になるように脳を再配置して、前頭方向からの視野を確保します。次に、同じ手法を用いて、水平視で撮影したのと同じニューロンの正面視の新しいイメージスタックを作成します。その際、髄質ニューロパイルに対する目的のニューロンの位置も必ず記録してください。同一のニューロンの特定は、低倍率下で可能です。ただし、組織が深いために信号が失われる場合は、脳の腹側半分のみを撮影してください。また、画像スタックを確認し、画像取得中にサンプルが移動していないかチェックしてください。画像のデコンボリューションおよび画像合成の詳細については、テキストプロトコルに記載されています。この手順の目的は、ニューライトをトレースし、レジストレーションのためのリファレンスポイントを指定することです。まず、再構成された画像ファイルを開きます。次に、「編集」に移動します。次に、ディスプレイ調整を表示し、赤色である光受容体チャネルをオフにします。続いて、サパスモードで画像を可視化します。コンピュータにステレオグラフシステムが搭載されている場合は、ステレオ機能をオンにし、クアッドバッファモードを使用して3D画像を可視化してください。新しいフィラメントを追加するには、surpassからfilamentsに移動し、「skip automatic creation, edit manually」というラベルのタブをクリックします。次に、drawタブをクリックしてAutoDepthを選択し、settingsを選択します。ラインオプションを切り替え、視認性を高めるために適切なピクセル数を入力します。次に、「樹状突起を表示（show dendrites）」、「開始点（beginning point）」、「分岐点（branching point）」を切り替え、レンダリング品質を100%に設定します。その後、「描画（draw）」タブを選択し、ニューライトのトレースを開始します。まず軸索から行い、次に樹状突起へと移ります。trans medulla ニューロンの軸索と樹状突起は容易に区別できるはずです。ニューライトのトレース後、「settings」に戻り、「beginning point」と「branching point」の両方のトグルをオフにします。その後、「surpass」に進み、「export」してください。オブジェクトを選択し、フィラメントをInventorファイルとして保存します。次のステップは、参照点を割り当てることです。まず、「表示調整を表示（show display adjustment）」を選択し、両方のイメージングチャネルをオンにします。次に「surpass」に移動し、「measurement」を選択します。そして「edit」タブの下で「specific channel」を切り替え、今回は光受容体（photoreceptor）チャンネルを選択してください。これで、最上層のリファレンスポイントを割り当てます。「surpass」を選択し、次に「measurement points」を選択して、m1層の開始点を上層としてマークします。クリッピングプレーン機能を使用して、ポイントの割り当てを容易にします。ポイントの順序は、equatorial、anterior equatorial、anterior、anterior ventral、ventral、posterior ventral、posterior、posterior equatorial、そしてcenterの順です。中心光受容細胞を特定するには、最も多くの樹状突起を持つ細胞を選択します。次に、同様の手法を用いてR8層およびR7層の参照点を割り当てます。各参照点のセットを定義した後、座標をエクスポートします。「統計」を選択し、次に「詳細」、そして「特定の数値」と「位置」を選択します。次に、「タブ表示からファイルへ統計をエクスポート」を選択し、座標をCSVファイルとして保存します。続いて、3つのCSVファイルをスプレッドシートエディタで開きます。27個のリファレンスポイントの座標を、上部、R8、R7の順に従って新しいファイルにコピーして貼り付けます。その後、樹状突起の分岐および終末頻度の算出において、右腹側構成への剛体およびTPS非線形レジストレーション標準化のためのテキストプロトコルに従って進めます。最終的に、これらのデータを用いてさまざまな情報プロットを作成します。ここで提示したデュアルビューイメージング手順を用いて、疎にラベル付けされた tm 20 ニューロンを含むショウジョウバエの脳を、互いに直交する2方向からイメージングしました。画像の再構成により、軸方向の分解能が向上します。再構成された画像は、水平方向および正面方向の画像よりも高い分解能を有しています。3Dモデルを確認した後、15 tm 20ニューロンから樹状突起のトレースを収集し、15 tm 2ニューロンの樹状突起のトレースと比較しました。これらのニューロンの分枝確率および終端確率を分析した。4 µm未満のセグメントについては、両方のタイプで同様の結果であった。樹状突起終端の層特異的分析により、2つのニューロンタイプが異なる層特異的な形態で分布していることが示された。tm 2 樹状突起は m2 および m5 で入力を受け取ります。一方、tm 20 樹状突起は m1 から m3 層で終端します。平面解析により、tm 2 樹状突起は前方に、tm 20 樹状突起は後方に投射することが示されています。このビデオを視聴することで、2枚の共焦点画像を撮影する方法について十分に理解できるはずです。撮像ファイルのスタディマークを確認し、これらの画像から樹状突起の特性を抽出してください。この手順を行う際は、共焦点撮像の前にサンプルを適切にマーキングすることが重要です。イメージング中にサンプルが移動すると、イメージングの組み合わせに失敗するためです。

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神経科学

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出典:Ting, C., et al., Analyzing Dendritic morphology in Columns and Layers.J. Vis.

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CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

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樹状枝の自動同定とその向き

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自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

学ぶ デュアルビューイメージングと計算ツールを用いて、ショウジョウバエの視床ニューロンの樹状突起配線を3次元空間で分析する手法。この方法は神経回路のマッピングと細胞タイプの決定に貢献します。

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

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