2017年3月30日
この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。
この実験の全体的な目標は、特殊なマイクロ流体デバイスを作成し、それを使用して単一の酵母細胞の寿命と細胞表現型を測定することです。この方法は、母細胞が老化して死滅する理由や、細胞の恒常性の喪失、ひいては細胞の老化と死を引き起こす初期の分子イベントは何かなど、酵母の老化分野における重要な疑問のいくつかに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、母細胞を追跡し、その寿命を追跡し、さまざまな分子マーカーを同時に追跡できるため、寿命と相関する分子イベントを探すことができることです。
この方法は酵母の老化に関する洞察を提供することができますが、何世代にもわたって細胞チェックを必要とする参加に対する二次応答のモニタリングなど、他の領域にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、マイクロ流体デバイスの作製、細胞ローディング、顕微鏡のセットアップを成功させるために多くの練習が必要なため、苦労するでしょう。この方法の事前のデモンストレーションは、マイクロ流体デバイスに酵母を適切にロードすることが難しいため、非常に重要です。
付属のテキストプロトコルで説明されている標準的な技術を使用して、デバイス用のシリコンウェーハモールドの製造を開始する。フィーチャー面を上にして15センチのシャーレに入れます。型をペトリ皿にテープで固定します。
次に、きれいな計量ボートを天びんに置き、天びんを引き裂きます。50グラムのPDMSベースを計量ボートに注ぎ、次に5グラムのPDMS硬化剤を追加します。PDMSベースと硬化剤を使い捨てピペットで攪拌します。
計量ボートの端から始めて、ゆっくりと内側に移動します。混合物全体に小さな泡が形成されるまで、混合物を数分間完全に攪拌します。混合物をゆっくりとペトリ皿に注ぎ、シリコンウェーハの型を完全に覆います。
次に、ペトリ皿を真空に10分間置き、PDMS混合物からすべての気泡を取り除きます。真空から取り出した混合物の表面に気泡が残っている場合は、ピペットを使用して気泡を吹き飛ばします。次に、デバイスを摂氏75度で2時間焼きます。
室温に戻したら、金型の周りのPDMSを慎重に切断し、重合したPDMSの層をシリコンウェーハ金型から穏やかに剥がし、ウェーハ金型の構造に損傷を与えないようにします。PDMSレイヤーをパターン面を上にしてベンチに置きます。単一のエッジの工業用かみそりの刃で個々のチップを慎重に切り取り、建設上の損傷を避けるために各シングルチップの端から適切なマージンを保持します。
パターン側を上にして、パンチペンを使用して、チャネルの両側にある入口と出口の円にまっすぐ穴を開けます。パンチペンの針を穴に再度挿入して、各穴を確認します。針が反対側から出てきて、詰まりがないことを確認してください。
次に、テープを使用して、上面のほこりや破片を取り除きます。この手順を少なくとも 3 回繰り返し、ほこりのない表面を維持するために、PDMS にきれいなスコッチテープを残します。次に、デバイスを裏返し、PDMSの反対側のサイトでこの手順を繰り返します。
最後のテープもこの面に残しておきます。次に、デバイスのベース用にガラス面を準備します。厚さが 13 mm から 17 mm の 24 mm x 30 mm のカバーガラスを選択します。
ガラスに70%エタノールをスプレーし、ダストリムーバーで乾燥させて表面を滅菌します。次に、カバーガラスとPDMSをプラスチックプレートに移します。PDMSからスコッチテープをはがし、パターン面を上に向けてプレートの上面に接触しないように配置します。
次に、プレートをプラズマチャンバーに移します。PDMSとカバーガラスに酸素プラズマ処理を施し、表面を親水性にします。次に、プレートをプラズマチャンバーから取り外し、PDMSのプラズマ処理面をカバーガラスで慎重に接続します。
PDMSとカバーガラスの間に気泡がないことを確認します。最後に、デバイスをオーブンに移し、摂氏75度で少なくとも2時間焼きます。PDMSチップ調製の1日前に、入力チューブと出力チューブを70%エタノール溶液に浸します。
翌日、5ミリリットルのシリンジにオートクレーブ水を入れ、チューブをシリンジに置き、チューブを水で洗い流して各チューブを洗浄します。洗浄ステップを少なくとも3回繰り返して、残留エタノールを除去します。次に、光学顕微鏡でPDMSチャンネルを調べます。
10 X 対物レンズを使用して、構造が一貫しており、損傷していないことを確認します。無傷のPDMSチップをスコッチテープを使用して顕微鏡プラットホーム上で安定させます。滅菌水を入れた5ミリリットルのシリンジをシリンジポンプに固定し、対応する入力チューブと出力チューブをデバイスに挿入します。
流量を毎時750マイクロリットルに設定し、チップを約10分間すすぎます。チャネルを監視して、気泡が洗い流されていることを確認します。10分間のすすぎ後に気泡が残っている場合は、手動で速度を調整して気泡をなくします。
準備した酵母サンプルの1ミリリットルを2つの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、サンプルを3、000回G.Removeで5分間遠心分離します各チューブから上清の大部分を取り除き、残りを組み合わせて5ミリリットルのサンプルを形成します。酵母サンプルの準備ができたら、PDMSチップからインプットチューブを取り外します。シリンジポンプを手動で逆にして、長さ1〜2センチメートルの小さな気泡を各インプットチューブに吸い込み、細胞培養物を吸い込みます。
次に、入力チューブをPDMSチップに戻し、ポンプを再起動して、毎時750マイクロリットルの速度でセルをロードします。シリンジポンプを10分間オンにし、顕微鏡で細胞負荷の進行を調べます。ローディングが成功すると、懸濁液柱の60%以上の下に細胞がトラップされます。
酵母細胞を維持するために、シリンジ内の溶液を栄養溶液に切り替え、速度を毎時400マイクロリットルに調整します。酵母の寿命表現型は、トラップされた各母細胞によって生成される芽の数を数え、Kaplan-Meier推定量を推定することによって取得できます。このプロトコルを使用して、デバイスは、すでにトラップされた細胞から出芽した新鮮な娘細胞を頻繁にトラップします。
その後、これらの細胞は新鮮な母細胞に変わり、ダウンストリームの画像解析ソフトウェアを使用して同定できます。これらの新鮮な母細胞は、より正確な寿命測定を提供します。この実験では、新鮮な母細胞の平均寿命は約2世代わずかに長かった。
つぼみの数に加えて、2つの連続する出芽イベント間の時間間隔をイメージングデータから抽出できます。出芽は寿命の終わりに向かって劇的に遅くなり、これらの老化した細胞の不健康な状態を示しています。この手順を試みる際には、気泡を避けるために作りたてのチップを使用することと、必要に応じて細胞のローディング効率を向上させるために細胞濃度を上げることの両方を覚えておくことが重要です。
その開発後、この技術は、酵母老化分野の研究者が老化表現型の原因となる初期の分子変化を探求する道を開きました。このビデオを見れば、このマイクロ流体デバイスの作り方と、それを使用して単一細胞の寿命と細胞表現型を測定する方法について十分に理解できるはずです。
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この記事では、単一の酵母細胞の寿命と細胞表現型を測定するための特殊なマイクロ流体デバイスを作成するためのプロトコルを提示します。この方法は、酵母の老化分野における重要な問題、特に母細胞の老化プロセスに関して対処することを目指しています。
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.