Name: シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ マイクロ流体デバイスを用いた単一出芽酵母細胞の寿命と細胞表現型の測定法。母細胞の寿命と分子マーカーを同時に追跡し、細胞老化の初期分子イベントを解明する技術です。

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この研究は、NIHグラントAG043080と中国国家自然科学基金会(NSFC)のNo.11434001の支援を受けました。原稿の校正をしてくれたLucas Waldburgerに感謝します。

1.シリコンウェーハの金型製作注：フォトマスクは、AutoCADのソフトウェアで設計し、商業の会社によって製造されています。このデザインは異なるパターン（の三つの層が含ま<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">補足ファイル1</a> ）。第一、第二、及び第三の層の高さは、それぞれ、約4ミクロン、10ミクロン、および50ミクロンです。シリコンウェハモールドは、ソフトリソグラフィー9、10を用いてフォトマスクから作成されました。 <ol><li>水蒸気を蒸発させ、10分間200℃でシリコンウエハを焼きます。シリコンウェハ上にコートネガフォトレジストSU-8をスピン。 注：30秒間2000rpmで第二の層を生成するために30秒間3000rpmで第一の層、SU-8 2010を生成するために30秒間5000rpmでスピンコートSU-8 3005及びSU-8 3025を生成します第三層。 </li><li>ソフトベークトンの前に塗布されたウェハ彼は、パターン転写。合わせ、マスクアライナを使用して「直接接触」モードでウエハを露光します。 注：ソフトベーク第一層のために95℃で2分、第二層のために95℃で3分間、第3層のために95°Cで15分間ウェハ。第二層、第3層のために200ミリジュール/ cm 2のための第一の層、130ミリジュール/ cm 2で100ミリジュール/ cm 2の露光量を使用します。 </li><li>露光後、ウェハをポストベークし、SU-8現像液を使用してそれを開発。 N 2ガン及びハードベーク30分間200℃でウエハを用いてウェハを乾燥させます。 注：シリコンウェーハモールドは、パターン側を上に向けて、スコッチテープを用いて直径15cmのプラスチック製ペトリ皿に固定されています。通常、我々は、複数のマイクロ流体チップを同時に製造することを可能にする同じ金型、上のいくつかの同一のチップ構造を置きます。各金型は、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができます。 </li></ol> 2.マイクロ流体チップ製造<ol><li>バランスの上にきれいな計量ボートを置き、風袋引き。重ボートにPDMSベースの50グラムを注ぎます。 </li><li> （PDMSベースから1:10の重量/重量比）計量ボートにPDMS硬化剤を5g加えます。 注：このボリュームは、金型と直径15cmのペトリ皿に基づいています。異なるサイズのペトリ皿を使用する場合、試薬の量を調整します。 </li><li>使い捨てピペットを用いてPDMSベースと硬化剤を攪拌します。計量ボートの端からスタートし、徐々に内側に移動します。小さな気泡が混合物全体に形成されるまで、数分間十分に攪拌。完全な混合は、PDMSの重合のために不可欠です。 </li><li>ペトリ皿にゆっくりと混合物を注ぎます。混合物を完全にシリコンウェハ型をカバーしなければなりません。 </li><li> PDMSの混合物からすべての気泡を除去するために10分間真空中でペトリ皿を置き。気泡が混合物の表面に残っている場合は、それらを吹き飛ばすためにピペットを使用しています。 </li><li>シリコンをインキュベート約2時間75℃のオーブンでPDMSを有するウエハー型。 </li><li>穏やかウエハ型の構造への損傷を回避すること、シリコンウェハモールドオフ重合PDMSの層を剥がします。あるいは、単一のエッジ工業用カミソリの刃を使用して、パターンの周囲に最小5 mmのマージンを有するシリコンウェハ型から直接PDMSを切断;穏やかウエハモールドオフPDMS層を剥離。 </li><li>パターン面を上にしてベンチにPDMS層を配置してください。注意深く建設損傷を避けるために、各単一チップのエッジから十分なマージンを保持し、単一エッジ工業用カミソリの刃で個々のチップを切り出しました。 </li><li>パターン面を上に向けて、チャネルの両側に入口と出口の円を通ってまっすぐに穴をパンチするパンチペン（0.75 mmのID）を使用します。 注：これらの穴は、媒体の流れのための経路を作成します。したがって、円を通過し、PDMS層を介してすべての方法をパンチすることが重要です。に確認してください穴からPDMS列を削除します。 </li><li>穴に再びパンチペンニードルを挿入することにより、すべてのパンチ穴を確認してください。針が何の詰まりがないことを示し、他の側から出てくることができていることを確認します。その後、優しくダスト粒子をきれいにテープをはがし、パターン面にテープを適用します。このステップを少なくとも3回繰り返します。滅菌を維持するために、PDMS上のスコッチテープのきれいな作品を残します。 </li><li> PDMSの反対側に、この手順を繰り返し、同様にテープの最後の部分を残します。 </li><li> 0.13〜0.17ミリメートルの厚さ24ミリメートル×30ミリメートルのカバーガラスを準備します。表面を殺菌する除塵装置でガラス上に70％エタノールを噴霧し、乾燥しました。さらに、ガラスは、オートクレーブ水で洗浄し、除塵機で乾燥させることができます。 </li><li>プラスチック板にカバーガラスとPDMSを転送します。 PDMSからスコッチテープを外し、上向きパターン側に配置します。転送時のパターン面との接触を避けてください。 </li><li&gt;プラズマ機でプラスチック板を置き。 PDMSと次のような動作パラメータを使用して親水性表面レンダリングするカバーガラスに酸素プラズマ処理を適用する：曝露を、75秒;ガスの安定化、20 CC /分;圧力、200;そして、電力、100 W. </li><li>注意深く両方の親水性表面（プラズマ処理中上向き面）接続、カバーガラス上にPDMSを置きます。 PDMSとカバーガラスの間に気泡がないことを確認します。 </li><li>少なくとも2時間75℃のオーブン中にPDMSチップをインキュベートします。 注：欠損マイクロフルイディクスは、実験中に顕微鏡上に液漏れの原因となります。したがって、わずかにピンセットで縁からPDMSを持ち上げてPDMSとカバーガラスとの間の結合を確認することが重要です。穏やかに成功した結合を示し、カバーガラスからそれを分離してはならないPDMSを持ち上げます。 </li></ol> 3.テストの準備<ol><lI&gt;チューブの準備。 <ol><li>別々に1日PDMSチップの製造前に70％エタノール溶液中で入力と出力管を水没。 </li><li>チューブを洗浄するためにオートクレーブ水で5 mLの注射器を埋めます。注射器にチューブを接続し、水でチューブを洗い流すことにより、各チューブを洗浄します。 </li><li>エタノール残留物をきれいに洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。 </li></ol></li><li>構造は一貫して無傷であることを確認するために10倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡下でPDMSチャネルを調べます。スコッチテープを使用して、顕微鏡プラットフォームにPDMSチップを安定化させます。 注：最初にデバイスを作製する場合は特に、バックアップのチップが存在することを確認するために、ステップ2で、一度に複数のチップを作ります。 </li><li>オートクレーブ処理水で5 mLシリンジを埋めます。シリンジポンプにシリンジを固定し、対応する入力及び出力管を挿入します。約10分間、チップを洗浄するために750μL/ hに洗浄速度を設定します。分岐流路に空気の泡この期間中に洗い流されるべきです。残留気泡がある場合、手動で気泡を除去するために速度を調整。 </li><li>酵母サンプル調製。 <ol><li> 3,000×gで5分間のための2つの1.5 mlのマイクロ遠心チューブへmLで調製した酵母試料（OD 600 0.6〜0.8）の転送1及び遠心分離機。 </li><li>各チューブからの上清の大部分を除去し、0.5 mLのサンプルを形成するために、残りを組み合わせます。 </li></ol></li><li>シリンジポンプを一時停止し、PDMSチップからの入力管を取り除きます。 </li><li>手動で各入力チューブに（長さ1~2センチメートル）、小さな気泡を吸引するシリンジポンプを逆転。酵母サンプルを吸引するために移動します。気泡は、サンプルの境界を示し、描かれているどのくらいのサンプルを示します。 注：注射器内に試料を吸引しないでください。 </li><li>バックPDMSチップに入力されたチューブを挿入し、750μL/ hの速度で細胞をロードするためにポンプを再始動。 </li><li> 10分間にシリンジポンプを残しますnおよび顕微鏡下での細胞のローディングの進行を調べます。成功したロード柱を一時停止の60％以上下になるトラップ細胞。 </li><li>栄養液に切り替えて、細胞培養のための400μL/ hまでの速度を調整します。 </li><li>顕微鏡のための観察位置を選択します。 注：寿命測定のために、画像は、40X対物レンズを備えた光学顕微鏡で一回15分毎に採取しました。蛍光レポーター分析のために、画像は60倍のオイル対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で一度15分毎に採取しました。 </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

PDMSデバイスは、作りたてする必要があります。そうでない場合、デバイスにチューブを挿入することによって引き起こされる気泡は除去するのが困難であろう。ステップ3.4は、細胞を濃縮することによって、細胞の積載効率を向上させることが重要です。実験のスループットを増大させるために、同じPDMSチップ接続独立して動作するポンプに4〜6のモジュールは、典型的には同時に4〜6の異なる実験（異なる株又は培地組成）を実行するために使用されます。 （顕微解剖を使用）は、従来の酵母複製老化アッセイと比較して、ここに提示マイクロ流体の方法は、より少ない労力と時間がかかります。また、マイクロ流体デバイスは、細胞のサイズ、細胞周期動態、細胞形態、および様々な分子マーカーを含む、種々の細胞または分子パラメータの詳細な定量を可能にします。このマイクロ流体方法は、保持することにより、高解像度の顕微鏡との長期的な細胞追跡を実現します娘細胞としてPDMSマイクロパッドの下で母細胞が自動的にフラッシュされます。 このデバイスはHuberts ら</em...

出芽酵母は、研究の高齢化で強力なモデル生物です。しかしながら、酵母における従来の寿命アッセイは労働集約的でなく、低スループット1、2だけでなく顕微解剖、に依存しています。彼らの年齢としてまた、従来の顕微解剖のアプローチは、単一の母細胞の様々な細胞および分子機能の詳細図を提供していません。マイクロ流体デバイスの開発は、酵母寿命を測定するだけでなく、母細胞3、4、5、6、7、8の寿命全体の分子マーカー及び様々な細胞の表現型に従うように自動化された手順を可能にしました。酵母細胞は、マイクロ流体デバイス内にロードされた後、それらは、自動時間ラップを用いて顕微鏡下で追跡することができます電子イメージング。寿命、サイズ、蛍光レポーター、細胞形態、細胞周期動態、 等を含む、撮像処理ツールの助けを借りて、様々な細胞及び分子表現型は3を抽出することができ、6、8、その多くは、使用して得ることが困難または不可能です従来の顕微解剖方法。マイクロ流体デバイスは、数年前に3、4、6、7彼らの開発に成功以来、酵母の老化の研究で注目を集めています。いくつかのグループが、その後、以前のデザイン5のバリエーションに公開している、と多くの酵母ラボは、彼らの研究のためのマイクロ流体デバイスを採用しています。 指数関数的な成長を受けて、細胞培養では、観察のために利用可能な老人母細胞の数はminiscuですル。したがって、寿命測定のためのマイクロ流体デバイスの一般的な設計原理は、母細胞を保持し、娘細胞を除去することです。そのようなデザインは、酵母が非対称細胞分裂を受けるという事実を利用します。デバイス意志トラップ大きな母細胞内の構造と小さな娘細胞を洗い流すことを可能にします。この資料に記載のマイクロ流体チップは、トラップ母細胞へのソフトポリジメチルシロキサン（PDMS）パッド（垂直鉛筆列）（ 図1）を使用します。同様の設計のデバイスは、以前に3、4、6、7報告されています。このプロトコルは、マイクロ流体デバイスとタイムラプスイメージング実験のために最適化された単純セルローディング方式を製造するために簡単な手順を使用します。マイクロ流体デバイスの重要なパラメータの一つは、トラップ母細胞に使用さPDMSパッドの幅です。当社のDeviceは、その寿命全体で追跡することができ、新鮮な母細胞のかなりの部分を含め、各パッドの下に、より母細胞を維持することができ、より広いパッドを使用しています。細胞は、多くの世代場合や全体寿命を通して観察が必要であるために追跡する必要がある場合に寿命の測定に加えて、このプロトコルは、単一細胞タイムラプスイメージング実験のために有用です。

<table><tbody><tr><td>3インチ <111>シリコンウェーハ</td>ア<td>ディソンエンジニアリング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000および3000シリーズ</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184シリコーンエラストマーキット</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Sylgard&reg;シリコーンエラストマーベースと硬化剤</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>ハリスUni-core&trade;パンチ(ID:0.75ミリメートル)</td><td>シグマAldrichが含まれています</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; カバーガラス</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M スコッチテープ</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg;かみそりの刃VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>純粋なエタノール、Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD シリンジ (ルアーロック &trade;ヒント)</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE標準ウォールチューブ(100フィート、AWGサイズ:22、公称ID:0.028)</td><td>コンポーネント供給会社</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>ニードルアソートメント</td><td>コンポーネント供給会社</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr>デ<tr><td>シケー</td><td>ターHACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>ラボオーブン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 顕微鏡 40X および 60X 対物</td>レンズ <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 40X および 60X 対物</td>レンズ <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは、老化研究における重要なモデル生物です。遺伝学的研究により、種を超えて寿命に保存された影響を与える多くの遺伝子が明らかになりました。しかし、老化や死の分子的原因は未だに解明されていません。酵母の老化の根底にある分子メカニズムを体系的に理解するためには、単一細胞の寿命を測定し、さまざまな細胞および分子表現型を定量化するためのハイスループットな方法が必要です。これまでに、出芽酵母の母細胞を生涯にわたって追跡し、新生児の娘細胞を洗い流すマイクロ流体デバイスを開発しました。この記事では、マイクロ流体チップの調製方法とマイクロ流体実験の設定方法について説明します。複数のチャンネルを使用して、異なる条件下で、または異なる酵母株からの細胞を同時に追跡できます。一般的なセットアップでは、チャンネルごとに数百の細胞を追跡でき、細胞の寿命全体を通じて高分解能の顕微鏡イメージングが可能になります。また、私たちの手法では、単一細胞の寿命、分子マーカー、細胞形態、細胞周期動態の詳細な特性評価も可能です。 また、当社のマイクロ流体デバイスは、下流の画像解析で同定できる新鮮な母細胞を大量に捕捉することができるため、より高精度な寿命測定が可能です。

実験後、細胞および多くの細胞及び分子表現型の寿命が記録タイムラプス画像から抽出することができます。各細胞から抽出することができる異なる機能の数があるので、解析の最初のステップは、位置とセルの境界と追跡されている様々なイベントのタイミングを含む細胞およびイベントを、注釈を付けるようになっています出芽イベントとして。これらのアノテーションは、それが簡単に細胞の同じセットに戻ることにし、将来的に異なる特徴を分析します。そのようなImageJの11および関連のプラグインとして、画像解析ソフトを用いて、表現型のリストは、その後、細胞の記録された注釈を用いて画像データから抽出することができます。 マイクロ流体デバイスを用いて測定した表現型のいくつかの例を以下に示します。酵母の寿命表現型各捕捉された母細胞によって産生さ芽の数をカウントし、カプラン - マイヤー推定と推定することによって得ることができます。当初、マイクロ...

この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

この実験の全体的な目的は、特殊なマイクロ流体デバイスを作製し、それを用いて単一の酵母細胞の寿命と細胞表現型を測定することです。この手法は、母細胞がなぜ老化して死に至るのか、また、細胞のホメオスタシスの喪失、そして最終的な細胞の老化と死を駆動する初期の分子イベントは何であるかなど、酵母の老化研究におけるいくつかの重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の大きな利点は、母細胞の追跡、寿命の追跡、および様々な分子マーカーの観察を同時に行えるため、寿命と相関する分子イベントを探索できることです。この手法は酵母の老化に関する知見を提供できるだけでなく、多くの世代にわたる細胞確認を必要とする刺激に対する二次応答のモニタリングなど、他の領域にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、マイクロ流体デバイスの作製、細胞の充填、顕微鏡の設定を適切に行うために多くの習熟が必要となるため、苦労することがあります。マイクロ流体デバイスへの酵母の充填を適切に行うことは困難であるため、事前に本手法の実演を確認しておくことが極めて重要です。まず、付属のテキストプロトコルに記載されている標準的な手法を用いて、デバイス用のシリコンウェハーモールドを作製します。これを、パターン面を上にして15 centimeterのペトリ皿に配置します。テープを用いてモールドをペトリ皿に固定してください。次に、清潔な薬衡舟を天秤に載せ、風袋引きを行います。50 gramsのPDMSベースを薬衡舟に注ぎ、そこに5 gramsのPDMS硬化剤を加えます。使い捨てピペットを用いて、PDMSベースと硬化剤を撹拌します。ウェイボートの端からゆっくりと内側に向かって動かします。混合物全体に小さな気泡が生じるまで、数分間十分に撹拌します。シリコンウェハー型を完全に覆うように、混合物をシャーレにゆっくりと注ぎます。次に、ペトリ皿を真空状態に10分間置き、PDMS混合物からすべての気泡を取り除きます。真空から出した後、混合物の表面に気泡が残っている場合は、ピペットを使用してそれらを吹き飛ばしてください。次に、デバイスを75 °Cで2時間加熱処理します。室温まで冷却後、モールド周囲のPDMSを慎重に切り離し、ウェーハモールドの構造を傷つけないように注意しながら、重合したPDMS層をシリコンウェーハモールドからゆっくりと剥離させます。PDMS層を、パターン面を上にしてベンチに置きます。単刃の工業用カッターを使用して個々のチップを慎重に切り出します。この際、構造的な損傷を避けるため、各チップの端から十分なマージンを確保してください。パターン面を上に向け、パンチペンを使用して、チャネルの両側にある入口および出口の円に垂直に穴を開けます。パンチペンの針を再度穴に挿入して、各穴を確認してください。針が反対側から突き抜けていることを

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生物学

酵母の老化時系列は定常期での時間に関連付けられている細胞の生存率の損失を指します。ここでは、定量的に酵母系列寿命を決定するためのハイスループット法を説明します。...

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

この記事では、酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。...

出芽酵母の複製寿命の測定

ここでは、エージング中規制またはゲノムDNAの不安定性に寄与する遺伝子/経路を研究するために酵母の時系列の寿命モデルと組み合わせることができるDNAの突然変異試験のセットを説明します。...

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単​​な方法を提示する。...

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ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。...

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。...

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。...

微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

私たちは、個々の酵母細胞の成長表現型を、酵母（ODELAY）の生存アレイの1細胞倍加評価と称する経時的顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニー中に増殖させる際に定量する方法を提示する。コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞の集団の異種性を直接観察および定量することができる。...

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

例として枯草菌を使用して個々...

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2...

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。...

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

学ぶ マイクロ流体デバイスを用いた単一出芽酵母細胞の寿命と細胞表現型の測定法。母細胞の寿命と分子マーカーを同時に追跡し、細胞老化の初期分子イベントを解明する技術です。

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

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