シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

この実験の全体的な目的は、特殊なマイクロ流体デバイスを作製し、それを用いて単一の酵母細胞の寿命と細胞表現型を測定することです。この手法は、母細胞がなぜ老化して死に至るのか、また、細胞のホメオスタシスの喪失、そして最終的な細胞の老化と死を駆動する初期の分子イベントは何であるかなど、酵母の老化研究におけるいくつかの重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の大きな利点は、母細胞の追跡、寿命の追跡、および様々な分子マーカーの観察を同時に行えるため、寿命と相関する分子イベントを探索できることです。

この手法は酵母の老化に関する知見を提供できるだけでなく、多くの世代にわたる細胞確認を必要とする刺激に対する二次応答のモニタリングなど、他の領域にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、マイクロ流体デバイスの作製、細胞の充填、顕微鏡の設定を適切に行うために多くの習熟が必要となるため、苦労することがあります。マイクロ流体デバイスへの酵母の充填を適切に行うことは困難であるため、事前に本手法の実演を確認しておくことが極めて重要です。

まず、付属のテキストプロトコルに記載されている標準的な手法を用いて、デバイス用のシリコンウェハーモールドを作製します。これを、パターン面を上にして15 centimeterのペトリ皿に配置します。テープを用いてモールドをペトリ皿に固定してください。

次に、清潔な薬衡舟を天秤に載せ、風袋引きを行います。50 gramsのPDMSベースを薬衡舟に注ぎ、そこに5 gramsのPDMS硬化剤を加えます。使い捨てピペットを用いて、PDMSベースと硬化剤を撹拌します。

ウェイボートの端からゆっくりと内側に向かって動かします。混合物全体に小さな気泡が生じるまで、数分間十分に撹拌します。シリコンウェハー型を完全に覆うように、混合物をシャーレにゆっくりと注ぎます。

次に、ペトリ皿を真空状態に10分間置き、PDMS混合物からすべての気泡を取り除きます。真空から出した後、混合物の表面に気泡が残っている場合は、ピペットを使用してそれらを吹き飛ばしてください。次に、デバイスを75 °Cで2時間加熱処理します。

室温まで冷却後、モールド周囲のPDMSを慎重に切り離し、ウェーハモールドの構造を傷つけないように注意しながら、重合したPDMS層をシリコンウェーハモールドからゆっくりと剥離させます。PDMS層を、パターン面を上にしてベンチに置きます。単刃の工業用カッターを使用して個々のチップを慎重に切り出します。この際、構造的な損傷を避けるため、各チップの端から十分なマージンを確保してください。

パターン面を上に向け、パンチペンを使用して、チャネルの両側にある入口および出口の円に垂直に穴を開けます。パンチペンの針を再度穴に挿入して、各穴を確認してください。針が反対側から突き抜けていることを確認し、詰まりがないことを確かめます。

次に、テープを使用して上面から埃やゴミを除去します。この手順を少なくとも3回繰り返し、表面を清潔に保つために、きれいなセロハンテープをPDMS上に貼ったままにします。その後、デバイスを裏返し、PDMSの反対側でも同様の手順を繰り返します。

こちらの側にある最後のテープもそのままにしておきます。次に、デバイスの底部となるガラス面を準備します。厚さが 13 から 17 mm の、24 mm × 30 mm のカバーガラスを選択してください。

ガラスに70% ethanolをスプレーし、ダストリムーバーで拭き取って表面を滅菌します。次に、カバーガラスとPDMSをプラスチックプレートに移します。PDMSからスコッチテープを取り除き、上面に触れないように注意しながら、パターン面を上にしてプレートに配置します。

その後、プレートをプラズマチャンバーに移動させます。PDMSとカバーガラスに酸素プラズマ処理を施し、表面を親水性にします。次に、プレートをプラズマチャンバーから取り出し、プラズマ処理したPDMSの表面とカバーガラスの表面を慎重に接合させます。

PDMSとカバーガラスの間に気泡が入っていないことを確認します。最後に、デバイスをオーブンに移し、75 °Cで少なくとも2時間焼成します。PDMSチップの作製の1日前に、入口および出口のチューブを70%エタノール溶液に浸しておきます。

翌日、5 mLのシリンジにオートクレーブ滅菌水を満たし、チューブをシリンジに装着して水でフラッシングすることで、各チューブを洗浄します。残留エタノールを除去するため、この洗浄ステップを少なくとも3回繰り返します。次に、光学顕微鏡でPDMSチャネルを確認します。

10倍の対物レンズを用いて、構造に一貫性があり、損壊していないことを確認します。損壊のないPDMSチップを、スコッチテープで顕微鏡ステージ上に固定します。滅菌水を充填した5 mLシリンジをシリンジポンプに装着し、対応する入口および出口チューブをデバイスに挿入します。

流速を750 µL/hrに設定し、チップを約10分間洗浄します。チャネルを観察し、気泡が完全に洗い流されていることを確認してください。10分間の洗浄後も気泡が残っている場合は、速度を手動で調整して気泡を除去してください。

調製した酵母サンプル1 mLを2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、3,000 ×gで5分間遠心分離します。各チューブから上澄みの大部分を除去し、残りを合わせて5 mLのサンプルを作成します。酵母サンプルの準備が整ったら、PDMSチップから導入チューブを取り外します。シリンジポンプを手動で逆転させ、各導入チューブから1〜2 cmの小さな気泡を吸い込み、その後、細胞培養液を吸い込みます。

次に、入力チューブをPDMSチップに再度挿入し、ポンプを再始動して、750 microliters per hourの速度で細胞をロードします。シリンジポンプを10分間作動させた後、顕微鏡下で細胞のロード状況を確認します。正常にロードされた場合、吊り下げピラーの60%以上に細胞がトラップされます。

酵母細胞を維持するために、シリンジ内の溶液を栄養溶液に切り替え、速度を 400 µL/h に調整します。酵母の寿命表現型は、捕捉された各母細胞によって生成された出芽数をカウントし、カプラン＝マイヤー推定量を算出することで得られます。このプロトコルを用いることで、デバイスは、すでに捕捉されている細胞から出芽した新しい娘細胞を頻繁に捕捉します。

その後、これらの細胞は新しい母細胞となり、後続の画像解析ソフトウェアを用いて特定することが可能です。これらの新しい母細胞を用いることで、より正確な寿命の測定が可能になります。本実験において、新しい母細胞の平均寿命は、約2世代分わずかに長い結果となりました。

出芽数に加えて、2回の連続した出芽イベント間の時間間隔をイメージングデータから抽出することができます。寿命の終盤に向けて出芽は劇的に遅くなり、これは老化細胞の不健康な状態を示しています。この手順を行う際は、気泡の混入を防ぐために新しく作製したチップを使用すること、および必要に応じて細胞充填効率を向上させるために細胞濃度を上げることが重要です。

この手法の開発により、酵母の老化研究分野の研究者が、老化表現型の原因となる初期の分子変化を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、このマイクロ流体デバイスの作製方法と、それを用いて単一細胞における寿命および細胞表現型を測定する方法について十分に理解できるはずです。