生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

この導電率測定バイオセンサーアッセイの全体的な目標は、ハイブリッドβ-ラクタマーゼ技術を使用して生体分子の相互作用を検出することです。ここでは、キメラβ-ラクタマーゼタンパク質を用いて抗体抗原の相互作用を検出する方法について述べます。この方法の原理は、β-ラクタマーゼ活性のプロトン放出を測定することにより、結合を検出することに依存しています。

従来の免疫センサーに対するこの技術の主な利点は、キメラベータラクタマーゼの使用であり、分析物を検出するためにハイブリッドタンパク質を使用することにより、より安価で迅速な官能アッセイを行います。この手順は、テキストプロトコールに記載されているタンパク質サンプルと溶液の調製から開始します。再利用可能な電極を調製するには、ウェルあたり300マイクロリットルの電極調製溶液を含む96ウェルプレートのウェルにチップを浸し、室温で穏やかに混合しながら2分間

この手順を 3 回繰り返します。次に、室温で穏やかに混合しながら、蒸留水のウェルあたり300マイクロリットルを含む96ウェルプレートのウェルにチップを2分間浸して電極をすすぎます。電極を再生するには、再生溶液のウェルあたり300マイクロリットルを含む96ウェルプレートのウェルにチップを浸し、摂氏4度で一晩または室温で1時間浸します。

次に、リン酸塩緩衝生理食塩水のウェルあたり300マイクロリットルを含む96ウェルプレートのウェルにチップを浸すことにより、電極を3回洗浄します。室温で穏やかに混合しながら、各洗浄を2分間行います。リン酸緩衝液に調製したHEWL1ミリリットルあたり40マイクログラムの15マイクロリットルの滴を電極表面に沈着させることにより、電極のポリアニリン表面に鶏卵白リゾチームをコーティングします。

電極を室温で1時間インキュベートします。次に、センサーチップの電極部分を、ウェルあたり300マイクロリットルのリン酸バッファーを含む96ウェルプレートのウェルに浸すことにより、電極をリン酸塩バッファーで3回洗浄します。室温で穏やかに混合しながら、各洗浄を2分間行います。

電極の表面にブロッキング溶液の30マイクロリットルの滴を追加して、電極を飽和させます。室温で1時間インキュベートします。その後、前回と同じように3回洗います。

BlaP-cAb-Lys3またはBlaP溶液を結合緩衝液中で20μg/mLに希釈します。次に、この希釈溶液を15マイクロリットル滴で電極に塗布します。電極を室温で1時間インキュベートします。

抗原ナノボディ反応後、電極を洗浄液で3回洗浄します。次に、検出バッファーのウェルあたり300マイクロリットルを含む96ウェルプレートのウェルに電極を浸すことにより、センサーの電極を検出バッファーで洗浄します。そして、1分間短時間インキュベートします。

検出するには、デジタルマルチメータをコンピュータに接続します。次に、センサーチップを銅回路部分を介してデジタルマルチメータに接続します。50マイクロリットルの4ミリモルベンジルペニシリン溶液を正の標識電極に塗布することにより、センサー応答を開始します。

ネガティブラベル電極に50マイクロリットルの検出溶液を滴下して、ネガティブコントロールとして機能します。接続されたデジタルマルチメータで導電率値を30分間監視します。画面上で直接リアルタイムでデータを視覚化するか、デジタルデータをテキストファイルとしてエクスポートします。

これらの生データをプロットして、参照電極とサンプル電極間の時間に対する導電率変化の測定値を表すグラフ出力を作成できます。キメラタンパク質を構築するために、クラスAベータラクタマーゼBlaPをキャリアタンパク質として使用した。ここでは、触媒残基が赤で示されています。

溶媒にさらされたループにある挿入部位は黄色で示されています。cAb-Lys3と名付けられたラクダ科の抗体断片をBlaPに挿入しました。得られたキメラタンパク質であるBlaP-cAb-Lyse3は、β-ラクタマーゼ活性を保持したままHEWLに結合することができます。

HEWLは、BlaP-cAb-Lys3をロードする前に、ポリアニリンコード電極に固定化されました。固定化されたキメラタンパク質によるベンジルペニシリン加水分解によるプロトンの放出は、ユーザーが解釈できる伝導性の変化を誘発します。.センサーには、4つのペアに編成された8つのチップが含まれています。

各チップには、3つの電極、1つのポリアニリン被覆作用電極、1つの参照電極、および1つの対電極が含まれています。各ペアについて、ネガティブとラベル付けされたチップはネガティブコントロールに対応し、ポジティブとラベル付けされたチップはテストされたサンプルに対応します。ここに示されているのは、BlaP-cAb-Lys3とHEWLの特異的な相互作用を示すコンダクタンス測定値です。

導電率の変化は、固定化されたキメラβ-ラクタマーゼによる抗生物質の加水分解によって誘発されるプロトン放出に起因します。ネガティブコントロールであるネイティブβ-ラクタマーゼBlaPの結合は検出できませんでした。一度習得すると、この手法は、適切に実行され、実験条件が最適化されていれば、1日1/2で行うことができます。

一般に、この方法に不慣れな人は、抗体フラグメントをBlaPに挿入するのが難しいため、苦労するでしょう。この手順を試行する際、生成されるデータの品質はキメラβ-ラクタマーゼの機能に依存することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、この相互作用の平衡会合定数を決定するために、検出された相互作用の定量化を可能にする他の方法を実行することができます。

この技術は、その開発後、免疫バイオセンサーの分野の研究者が、生物からさまざまな環境に至るまでのさまざまなサンプルの分子相互作用を探索する道を開きました。キメラβ-ラクタマーゼ技術は、主成分の任意の抗体またはタンパク質断片を官能基化するための汎用性の高いツールであるため、この技術の意味は多数の生体分子の検出にまで及びます。したがって、人間や動物の健康など、多くの分野で安価で高速な診断ツールを開発するために使用できます。