Name: 生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぼう、ハイブリッドβ-ラクタマーゼ技術を用いた伝導度バイオセンサー法で抗体-抗原相互作用を検出する方法。プロトン放出を測定し、従来の免疫センサーより迅速で低コストなタンパク質相互作用解析を実現します。

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著者は、SENSOTEM と NANOTIC の研究プロジェクトの枠組みの中でベルギーのワロン地域だけでなく、国家資金の科学研究 (F.R.S.-F.N.R.S) 金融支援を認めます。

1. タンパク質サンプル調製
<ol><li>生成し、ブッ cAb Lys3 私たちの以前の研究15で報告されたハイブリッドの蛋白質を浄化します。50 mM リン酸バッファー pH 7.4 次の組成のタンパク質を格納: 塩化ナトリウム 8 g、KCl の 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、800 mL の蒸留水に溶解した KH2PO4 0.24 g 前に 7.4 に溶液の pH を修正L. フィルター 1 の解決策の最終的な音量を調整するタンパク質溶液を滅菌します。</li>
	<li>鶏卵白リゾチーム (リゾチーム) 原液を準備します。リン酸バッファー生理食塩水 (PBS は、2.1.1 のステップを参照) の 10 mL の市販購入したリゾチーム (40,000 単位/mg) 100 mg を溶解します。0.22 μ m のカットオフ フィルターを用いたろ過によるタンパク質溶液を滅菌します。</li>
</ol>2. バイオ センサーを試金します。
<ol><li>
ソリューションおよびバッファーの準備
	<ol>
<li>50 mM PBS を準備するには、8 g の NaCl、KCl の 0.2 g、Na2HPO4、1.44 g と 800 mL の蒸留水で KH2PO4 0.24 g 溶解します。1 l. フィルター滅菌し、4 ° C で保存する溶液の量を調整する前に N HCl または 1 N NaOH pH 1 7.4 に調整します。</li>
		<li>100 mL の PBS は、前述のように準備にカゼイン加水分解物の 3 g を溶解することにより彩度/遮断ソリューションを準備 (2.1.1 の手順を参照してください)。フィルター滅菌し、4 ° C で保存</li>
		<li>100 mL の PBS は、前述のように準備にカゼイン加水分解物の 1 g を溶解することにより結合ソリューションを準備 (2.1.1 の手順を参照してください)。フィルター滅菌し、4 ° C で保存</li>
		<li>洗浄液の準備 (0.1% トゥイーン - PBS) 100 mL の PBS は、前述のように準備の Tween 20 (100%) 100 μ L の追加によって (2.1.1 の手順を参照してください)。4 ° C でのストア</li>
		<li>電極の準備ソリューションを準備 (1% トリトン X-100-PBS) トリトン X-100 (100%) 1 mL を 100 mL の PBS は、前述のように準備に追加して (手順 2.1.1 参照)。4 ° C でのストア</li>
		<li>最終巻の蒸留水で KCl の 26 g を溶解することにより電極再生液 (3.5 M KCl) を準備 100 mL。フィルター滅菌と 4 ° C で保存</li>
		<li>蒸留水 1 l. フィルター滅菌し、4 ° C で保存の最終巻ににおける NaCl の 0.29 g を溶解することにより 5 mM の NaCl 水溶液を準備します。5 mM の NaCl 水溶液 20 mL のベンジル ペニシリンの 26.7 mg を溶解することにより検出ソリューション (4 mM ベンジル) を準備します。フィルター滅菌し、-20 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>
センサーの作製と再生 注: ポリアニリン被覆センサー チップを開発し、博士 p. Bogaerts、s. ユヌス博士と教授 Y. Glupczynski (カトリック大学のルーバン ・ ラ ・ ヌーブ - 朱モン Godinne) によって提供されました。これらのセンサーを合成に使用するポリアニリンの電気重合プロトコルと同様に、センサーの説明は彼らの前の仕事17で詳細に説明します。簡単に言えば、このシステムは、古典的なプリント回路基板 (PCB) の技術によって製造された 8 つの個々 のチップの再利用可能なセンサーを使用します。個々 のチップは 3 つの電極から成るスポットをラウンドします。一番上は作用電極、ポリアニリンの電気合成だった。中間の 1 つは、参照電極と下部電極が対向電極を構成します。参照とカウンター電極の両方はカーボン層の上に固体の銀/塩化銀アマルガムを使用して官能基化します。<ol>
<li>ヒントを含む電極作製の 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルに浸すことによって電極の 3 洗浄を実行 (1% トリトン X-100-PBS を参照してくださいステップ 2.1.5。)。室温で穏やかな混合によって 2 分の各洗浄を実行します。</li>
		<li>含む室温で穏やかな混合で 2 分間蒸留水 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極をすすいでください。</li>
		<li>含む再生ソリューションの 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極を再生成 (3.5 M の KCl、参照 2.1.6) 4 ° C または室温で 1 h で一晩。</li>
		<li>含む生理食塩水リン酸バッファー 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極の 3 洗浄を実行 (手順 2.1.1 を参照)。室温で穏やかな混合で 2 分の各洗浄を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
センサーに対して結合の試金
	<ol>
<li>40 μ g/mL の PBS で電極表面上に作製したリゾチームの 15 μ L のドロップを堆積することにより電極のパニ (ポリアニリン) 表面にリゾチームのコート。4 ° C または 1 時間室温で一晩インキュベートします。</li>
		<li>リン酸バッファー生理食塩水で電極の 3 つの洗浄を実行 (手順 2.1.1 参照) 含む生理食塩水リン酸バッファー 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにセンサー チップの電極部分を浸すことによって。室温で穏やかな混合によって 2 分の各洗浄を実行します。</li>
		<li>ブロッキング溶液 50 μ L のドロップを追加することで、電極を飽和状態 (ステップ 2.1.2 参照) 電極表面上に。室温で 1 時間インキュベートします。洗浄 3 回、前に記載されているステップ (ステップ 2.3.2 を参照)。</li>
		<li>20 μ g/ml ソリューション バインドにブッ cAb Lys3 ソリューションを希釈 (手順 2.1.3 参照) の電極上にこの希釈液 15 μ L の滴を適用し、。室温で 10 分間インキュベートします。抗原生物学: ナノボディで反応後は洗浄液を使用して前の手順で 3 回に記載されて洗浄 (2.1.4 の手順を参照してください)。PBS で一度電極をすすいで (2.1.1 の手順を参照してください)。</li>
		<li>検出用センサー チップを経由してデジタル ・ マルチメータの銅回路部分を差し込みます。次に、50 μ L の滴検出ソリューションを適用することによってセンサー応答を開始 (2.1.7 のステップを参照) に、正極と負極 (2.1.7 のステップを参照) に食塩 5 mM の 50 μ L の滴を適用します。室温で 30 分間インキュベートします。デジタル ・ マルチメータとコンダクタンスを監視します。 注: マルチメータと定められた博士 p. Bogaerts、s. ユヌス博士と教授 Y. Glupczynski (カトリック大学のルーバン ・ ラ ・ ヌーブ - 朱モン Godinne。この電気化学測定装置は USB ポート経由でコンピューター制御し、センサーの 8 つの異なるチップを同時に分析します。ユヌス氏と同僚の17によって作成されたソフトウェアは、時間とリファレンスとサンプルの電極間のコンダクタンスの違いの測定を表すリアルタイム プロットを作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
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この作品で生物学: ナノボディでキャリア蛋白質としてブッ β-ラクタマーゼを使用しての高機能化する手法を提案し、電位差センサー アッセイで、結果として得られるハイブリッド タンパク質を正常に実装できることを示します。他のバイオ センサーの試金と比較して我々 の仕事の主な技術革新の側面は、電気信号を生成する酵素活性の抗体部分の共有カップリングです。このいわゆるタンパク質挿入技術提案する利点と制限事項このセクションの主な焦点となります。
Β-ラクタマーゼのハイブリッド技術の利点。
Β-ラクタマーゼは効率的な酵素 感度とバイオ センサーの信号対雑音比に影響を与える最も重要なパラメーターの 1 つは、信号を生成するために使用する酵素活性です。このコンテキストで β-ラクタマーゼは、いくつかの利点を提示: 小 (≈29 kDa)、単量体、非常に安定した、そしてより重要なは、高の特定のアクティビティとグルコースなど電位差センサー試金で使用される他の酵素と比較して高回転を展示オキシダーゼ、ウレアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダ...

バイオ センサー、トランスデューサー1と呼ばれる物理または化学のシグナリング デバイスと生体分子の相互作用を結合した分析機器です。記録された信号の解釈および固定化と無料のパートナー間の相互作用を監視に変換できます。グルコのほとんどは、ホルモンなど異なる病原体マーカー2検体を検出する抗体の使用を含みます。別のセンサー フォーマットは使用でき、質量ベース、磁気、光学または電気化学バイオ センサーが含まれます。後者は最も一般に使用されるセンサーとバインディング イベントを電気信号に変換することによって機能します。公演とすべて抗体を用いたバイオ センサーの感度は、本質的に 2 つのパラメーターに強く依存する: i) 抗体と ii)2の信号を生成するために使用するシステムのプロパティの品質。
抗体は 2 つの重鎖および 2 つの軽鎖から成る高分子質量二量体蛋白質 (150-160 kDa) です。光と重鎖間の相互作用を主に保存されたジスルフィド結合と同様に、疎水性相互作用によって安定させます。各チェインには、本質的に補完決定領域 (CDR1-2-3) という 3 つの超可変領域を介して抗原と相互作用変数の領域が含まれています。フィールド、大規模な低コスト式システム (例えば、エシェリヒア属大腸菌) とフルレングス抗体発現の多数の進歩にもかかわらず、しばしば不安定で集約された蛋白質の生産に 。だからこそ、さまざまな抗体フラグメント、単一鎖変数3 (ScFvs ≈ 25 kDa) の断片のように設計されてです。彼らは、それぞれ 1 つの重いと共有結合合成アミノ酸シーケンスによってリンクされている 1 つの軽鎖の可変領域で構成されます。ただし、これらのフラグメントはしばしば安定性の悪いを表示され、集計、溶剤4その疎水性領域の大きい部分を公開するために傾向があります。この中で、nanobodies または VHHs と呼ばれる、単一のチェーン ラクダ科動物抗体フラグメントは ScFvs に優れた選択肢と思われます。これらのドメインは、ラクダ科一本鎖抗体の可変領域に対応します。従来の抗体と対照をなしてラクダ科動物抗体軽鎖を欠いている、のみ 2 つの重鎖5が含まれます。したがって、nanobodies は、従来の抗体6のような親和性を持つ抗原に結合することができる最小単量体抗体フラグメント (12 kDa)。さらに、安定性の向上と他のフルレングスの抗体や抗体フラグメントと比較して溶解性を呈する。最後に、その小さなサイズと、拡張 CDR3 ループに、不可解なエピトープを認識し、酵素活性部位7、8にバインドする許可にします。今日では、これらのドメインはかなりの注目を受けているし、バイオ センサー技術に結合されています。たとえば、黄ら。検出と人間の前立腺特異抗原 (PSA)9の定量化のための生物学: ナノボディでベースのバイオ センサーを開発しました。
言及した上としてバイオ センサーの試金で重要なパラメーターは電気信号を生成するために使用するシステムの効率です。このため、酵素法による電気化学バイオ センサーはますます注目を集めている、健康管理、食品の安全性や環境モニタリングなど様々 な用途に広く使用されています。これらのバイオ センサーは、電気信号を生成する酵素による基質の触媒加水分解に依存します。この文脈では、β-ラクタマーゼより具体的より敏感とアルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ10など多くの他の酵素よりも実験的に実装する方が簡単に示されていた。Β-ラクタマーゼは β-ラクタム系抗生物質に耐性菌の責任、それらを加水分解する酵素です。彼らは、単量体、非常に安定した、効率的、かつ小さなサイズが。さらに、β-ラクタマーゼ挿入ドメイン/ペプチドはタンパク質-リガンド相互作用を研究する効率的なツールであることが示された bi 機能のキメラ蛋白質を生成します。確かに、最近の研究はその標的抗原に高い親和性と結合することができるままキメラ蛋白質 TEM1 β-ラクタマーゼ結果に変数の抗体のフラグメントをその挿入を示しています。興味深いことに、抗原結合 TEM1 触媒活性11,12のアロステリック効果を誘導するために示されました。さらに、我々 はバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼの寛容なループにタンパク質ドメイン挿入が蛋白質-リガンド相互作用13 を監視に適しています機能のキメラ蛋白質を生成するいくつかの研究で示した ,14。生物学: ナノボディで、ブッ15のこの寛容な挿入部位にという名前の cAb Lys3、最近挿入した.この生物学: ナノボディで示した鶏卵白リゾチーム (リゾチーム) にバインドする16その酵素活性を阻害します。ブッ-タクシー-Lys3 の名前生成されたハイブリッド蛋白質は高い特異性を保持/親和性リゾチーム β-ラクタマーゼ活性のまま変更しないことを示した.そして我々 は正常に β-ラクタマーゼ技術のハイブリッド電気化学バイオ センサーを組み合わせるし、生成された電気信号の量がブッ cAb Lys3 と電極に固定化したリゾチームの相互作用に依存していたことを示した。確かに、ブッによる β-ラクタム系抗生物質の加水分解は、定量的な電気信号に変換することができますプロトン放出を誘導します。このハイブリッド β-ラクタマーゼ技術電気化学バイオ センサーとの組み合わせは、高速、高感度、定量、生成された信号のリアルタイム測定が可能.この方法を次に記載します。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash;HCl</td><td>ロシュ</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>alanine</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 溶液、販売代理店 : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>casein hydrolysate</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>benzylpenicillin sodium</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白リゾチーム</td><td>ロシュ</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液</td><td>シグマ・アルドリヒト</td><td>380539</td><td>28% NH3&nbsp;H2Oで、再蒸留によって精製(濃縮?</td></tr><tr><td><ストロング>ラボ用消耗品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6ウェル プレート</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>ラボpHメーター inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>真空およびろ過システム</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>レシーバー、ディストリビューター付きフィルターホルダー:VWR</td></tr><tr><td>ポテンショメトリックセンサーチップ</td><td></td><td></td><td>Yunus製同僚(参照16</td></tr><tr><td>)PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>は廃止され、後継者はAutolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>デジタルマルチメーター、METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>は廃止、後継者はMetrahit Base</td></tr></tbody></table>

生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

バイオ センサーは、病原体検出、分子診断、環境監視、および食品安全性の管理などさまざまな分野でますます重要かつ実装になっています。この文脈では、いくつかのタンパク質間相互作用研究の効率的なレポーター酵素と β-ラクタマーゼを使用しました。さらに、強くペプチッドまたは構造化蛋白質/ドメインの挿入を受け入れる能力はキメラ蛋白質を生成するこれらの酵素の使用を奨励しています。最近の研究ではバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼに単一ドメイン抗体フラグメントを挿入されます。Nanobodies とも呼ばれるこれらの小さなドメインは、ラクダから一本鎖抗体の抗原結合ドメインとして定義されます。共通の二重鎖抗体のよう彼らは高い親和性と特異性の目標を表示します。結果のキメラ蛋白質 β-ラクタマーゼの活性を維持しながらその目標に対して高い親和性を展示しました。機能生物学: ナノボディで、β-ラクタマーゼの鎖を維持することが示唆されました。現在の仕事では、バイオ センサー技術に当社のハイブリッド β-ラクタマーゼのシステムを組み合わせた詳細なプロトコルを報告します。生物学: ナノボディでターゲットの特定の結合は、酵素の触媒活性が発表したプロトンの伝導度測定のおかげで検出できます。

デザインとエンジニア リングのキメラ蛋白質ブッ cAb Lys3
図 1 は、バチルス リチェニホルミス由来 BalP クラス A の β-ラクタマーゼの寛容なループに cAb Lys3 の挿入を表します。残基 Asp198 と Lys199 間挿入を行った。トロンビン切断部位は、cAb Lys3 の各側に導入されました。ブッ cAb Lys3 キメラ蛋白質発現プラスミドで形質転換細胞アンピシリンの小さな濃度の存在下で成長することができた。この結果は、ハイブリッドの β-ラクタマーゼは正しく折り返されて溶ける、効率的にアンピシリンに対して抵抗を提供することができますそれ細菌のペリプラズム空間に正常に排泄できることを示します。さらに、私達のキメラ蛋白質の bifunctionality を行った。私たちの以前の研究で報告は、我々 のデータ キメラタンパク質の cAb Lys3 鎖と同様、β-ラクタマーゼが彼らの生物学的活動の<sup clas...

この作品は、ハイブリッドの β-ラクタマーゼ技術に基づく伝導度センサーを用いたタンパク質間相互作用を研究する手法を報告する.このメソッドは、β-ラクタムの加水分解時に陽子のリリースに依存しています。

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

このコンダクトメトリック・バイオセンサー・アッセイの全般的な目的は、ハイブリッドβ-ラクタマーゼ技術を用いて生体分子間の相互作用を検出することです。本稿では、キメラβ-ラクタマーゼタンパク質を用いて抗原抗体相互作用を検出する方法について説明します。この手法の原理は、β-ラクタマーゼ活性によるプロトン放出を測定することで、結合を検出することに基づいています。従来の免疫センサに対する本手法の主な利点は、キメラ型β-ラクタマーゼを使用している点にあり、ハイブリッドタンパク質を用いて分析物を検出することで、より安価で迅速なセンサアッセイが可能になります。本手順の実演は、大学院研究員のMathieu Dondelingerが行います。まず、テキストプロトコルに記載されているタンパク質サンプルおよび溶液の調製から開始してください。次に、再利用可能な電極の先端を、電極調製溶液を1ウェルあたり300 µLずつ分注した96ウェルプレートのウェルに浸し、室温で緩やかに混合しながら2分間保持して、電極を調製します。この工程を3回繰り返します。その後、電極の先端を、1ウェルあたり300 µLの蒸留水が入った96ウェルプレートのウェルに浸し、室温で緩やかに混合しながら2分間洗浄します。電極を再生させるには、電極の先端を、1ウェルあたり300 µLの再生溶液が入った96ウェルプレートのウェルに浸し、4 °Cで一晩、または室温で1時間置きます。次に、1ウェルあたり300 µLのリン酸緩衝生理食塩水が入った96ウェルプレートのウェルにチップを浸し、電極を3回洗浄します。各洗浄は室温で穏やかに混合しながら2分間行います。リン酸緩衝液で調製した40 µg/mLのHEWLを15 µL、電極表面に滴下し、電極のポリアニリン表面に鶏卵白リゾチームをコーティングします。電極を室温で1時間インキュベートします。次に、センサーチップの電極部分を、1ウェルあたり300 µLのリン酸緩衝液が入った96ウェルプレートのウェルに浸し、電極を3回洗浄します。各洗浄は室温で、緩やかに混合しながら2分間行います。ブロッキング溶液を30 µL滴下して電極表面を飽和させます。室温で1時間インキュベートしてください。その後、前述と同様に3回洗浄します。BlaP-cAb-Lys3またはBlaP溶液を結合バッファーで20 micrograms per milliliterに希釈します。次に、この希釈溶液を15-microliterずつ電極上に滴下します。電極を室温で1時間インキュベートします。抗原ナノボディ反応後、洗浄液で電極を3回洗浄します。次に、1ウェルあたり300 µLの検出バッファーを入れた96ウェルプレートのウェルに電極を浸し、センサーの電極を検出バッファーで洗浄します。その後、1分間短時間インキュベートします。検出を行うため、デジタルマルチメータをコンピュータに接続します。次に、銅回路部分を介してセンサーチップをデジタルマルチメータに接続します。正極にラベル付けされた電極上に 50 µL の 4 mM ベンジルペニシリン溶液を滴下し、センサー反応を開始させます。ネガティブコントロールとして、陰性ラベル電極に検出液を50 µL滴下します。接続されたデジタルマルチメーターを用いて、導電率の値を30分間モニタリングします。データは画面上でリアルタイムに視覚化するか、デジタルデータとしてテキストファイルにエクスポートしてください。これらの生データをプロットすることで、参照電極とサンプル電極間の導電率変化の測定値を時間に対して表すグラフを作成できます。キメラタンパク質を構築するために、キャリアタンパク質としてクラスA β-ラクタマーゼ BlaP が使用されました。ここでは、触媒残基が赤色で示されています。溶媒に露出したループに位置する挿入部位を黄色で示しています。cAb-Lys3と名付けられたキャメリド抗体断片をBlaPに挿入しました。得られたキメラタンパク質BlaP-cAb-Lyse3は、β-ラクタマーゼ活性を保持したままHEWLに結合することができます。BlaP-cAb-Lys3をロードする前に、HEWLをポリアニリンコート電極に固定化しました。固定化されたキメラタンパク質によるベンジルペニシリンの加水分解に伴いプロトンが放出され、それが導電性の変化を誘発することで、ユーザーによる解析が可能となります。センサーは、4組のペアとして構成された8つのチップで構成されています。各チップには、ポリアニリンでコーティングされた作用電極、参照電極、および対極の3つの電極が含まれています。各ペアにおいて、「negative」と表記されたチップは陰性対照に、「positive」と表記されたチップはテストサンプルに対応します。ここでは、BlaP-cAb-Lys3とHEWLの特異的な相互作用を示すコンダクタンス測定結果を示しています。導電率の変化は、固定化キメラβ-ラクタマーゼによる抗生物質の加水分解に伴い誘起されるプロトンの放出に起因します。陰性対照である天然のβ-ラクタマーゼBlaPについては、結合は検出されませんでした。この手法に習熟し、適切に実施され、かつ実験条件が最適化されていれば、半日で完了させることができます。一般的に、この手法を初めて行う方は、BlaPへの抗体フラグメントの挿入が困難であるため苦労することになります。この手順を行う際は、得られるデータの質がキメラβ-ラクタマーゼの機能性に依存することを念頭に置くことが重要です。本手順の後、検出された相互作用を定量化できる他の手法を実施することで、この相互作用の平衡解離定数を決定することが可能です。本手法の開発後、免疫バイオセンサ分野の研究者は、生体から多様な環境に至るまでの様々なサンプルにおいて分子相互作用を探索することが可能となりました。キメラβ-ラクタマーゼ技術は、あらゆる抗体やタンパク質断片を主に機能化できる多才なツールであるため、本手法の意義は数多くのバイオ分子の検出へと広がります。したがって、ヒトや動物の健康管理など、多くの分野において安価で迅速な診断ツールの開発に利用できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオセンサー法の使用

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