モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

このプロトコルの目的は、逐次切断された組換えタンパク質およびペプチドスキャニングを用いたドットブロットハイブリダイゼーションにより、モノクローナル抗体が認識する線形B細胞エピトープを特定することです。この手法は、抗原と抗体の分子間相互作用に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、簡便さと効率性にあります。

特定されたエピトープは、その後、治療的および診断的な応用などのより詳細な研究に利用できます。本手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるChien-Wen Chenが行います。まず、RGM56マウスモノクローナルハイブリドーマ細胞をハイブリッド無血清培地で培養します。

細胞培養は、37°C、5% 二酸化炭素条件下で175 Tフラスコを用いて維持します。5日間のインキュベーション後、培地が黄色に変化したところで回収し、その上清を4°Cで4,500 ×g、30分間遠心分離します。その後、沈殿した細胞残渣を廃棄し、溶液中の抗体を得ます。

次に、50% Protein G アグロスラリーを2mL、5mLカラムに加え、氷冷PBS 10mLで樹脂を平衡化します（これはあらかじめ充填された樹脂の10倍量に相当します）。事前に調製した抗体溶液200mLを平衡化したカラムにロードし、カラムを通過して流出する分画は廃棄します。氷冷PBS 10mLを用いて、カラムを2回洗浄します。

最後に、レジンから抗体を溶出させるため、pH 2.7のミリモル濃度グリセリン溶液10 millilitersをカラムに加えます。あらかじめ10X中和バッファー100 microlitersを入れたマイクロ遠心チューブに、900 microliterずつ分画して回収します。精製した抗体は、アジ化ナトリウムを添加した50%グリセロール溶液中でマイナス 20 degrees Celsiusで保存してください。

テキストプロトコルに従ってコンストラクトを調製し、E.coli BL21細胞に形質転換させます。次に、単一のコロニーを、100 µg/mLのアンピシリンを添加した3 mLのLB培地を含む15 mLチューブに移し、チューブのキャップを緩く締めます。培養液を37 °Cで150 RPMの振盪条件下でインキュベートします。

600ナノメートルで培養液の光学密度をモニターします。OD600が約0.6に達したら、培養液を25℃まで冷却します。その後、最終濃度0.4ミリモルとなるようにIPTGを添加し、組換えタンパク質の発現を誘導します。

培養液を25°Cで200 RPMで振とうしながら、さらに4時間インキュベートします。インキュベーション後、細菌培養液1 mLをマイクロ遠心チューブに移します。細胞を12,000 ×gで1分間遠心分離し、上清を捨てます。

マイクロピペットでピぺッティングを行い、細胞ペレットを100 µLの変性緩衝液で再懸濁します。得られた懸濁液を激しくボルテックスミックスし、使用可能なリコンビナントタンパク質試料を作成します。ドットブロットハイブリダイゼーションに進むために、各合成ペプチドをDMSOに溶解し、10 mg/mLの溶液を作成します。

次に、PVDF膜をメタノール中で2分間活性化させ、さらに改変Towbinバッファーで2分間平衡化させます。クロマトグラフィーペーパーを改変Towbinバッファーですすぎ、その上に平衡化したPVDF膜を載せます。膜の表面からバッファーが消失するまで静置します。

10 µLのチップを用いて、各ペプチドまたはリコンビナントタンパク質サンプルの2 µLをメンブレン上に添加し、10分間自然乾燥させます。メンブレンへのスポット操作はこのプロトコルにおいて最も重要な工程です。PVDFメンブレンの狭い領域に正確な量のサンプルをロードするには、細心の注意が必要です。

次に、5%脱脂粉乳を添加したTBSTバッファーを用いて、室温で30分間、緩やかに振盪しながらメンブレンをブロッキングします。RGM56モノクローナル抗体を5%脱脂粉乳添加TBSTバッファーで希釈し、その抗体溶液をメンブレンに加えます。

メンブレンを37°Cで1時間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。インキュベーション後、抗体溶液を除去します。その後、メンブレンをTBSTバッファーで5分間、緩やかに振盪しながら2回洗浄します。

次に、5%脱脂乳を添加したTBST緩衝液で希釈した二次抗体溶液をメンブレンに加えます。メンブレンを37°Cで1時間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。インキュベーション後、抗体溶液を除去し、メンブレンをTBST緩衝液で5分間、緩やかに振盪しながら2回洗浄します。

次に、室温の暗所で基質溶液を用いて15分間、メンブレンを発色させます。シグナルが出現したら、二回蒸留水でメンブレンを洗浄し、反応を停止させます。メンブレンを風乾させた後、イメージングシステムを用いてドットブロット画像を撮影します。

最後に、画像解析ソフトを用いて各ドットブロットの強度を測定します。ここでは、1番から338番のアミノ酸からなる全長神経壊死ウイルス外殻タンパク質と、その連続的な切断変異体を示します。形質転換した細菌細胞におけるタンパク質の発現を確認するため、抗6XHis抗体を用いたドットブロット解析を行い、調査対象となったすべてのタンパク質が存在することを確認しました。

次に、RG-M56モノクローナル抗体を用いて、リコンビナントタンパク質をドットブロットハイブリダイゼーションにより解析した。解析の結果、当該抗体が認識するタンパク質エピトープは、ペプチド195から338の領域に存在することが明らかになった。最終的に、ペプチドスキャニングにより、20個または8個のアミノ酸残基からなるエピトープが同定された。

アラニンスキャニングにより、197番目と199番目のバリン残基、および201番目のシステインの置換によって、エピトープの結合能およびドットブロットハイブリダイゼーションが消失することが示されました。同様に、結合強度分析において結合親和性の低下が観察され、同定された残基がエピトープのRGM56モノクローナル抗体への結合に不可欠であることが確認されました。このペプチド同定手法は、治療用ペプチド薬やペプチド医薬品の開発に利用可能です。