アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

この手順の全体的な目標は、酵素結合微小電極アレイを使用して、in vivoで強直性および相性の細胞外グルタミン酸の変化を測定することです。この方法は、細胞外神経伝達物質のレベルや神経伝達物質の放出とクリアランスの速いダイナミクスが疾患状態で変化するかどうかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、MicroElectrode Arraysが離散的な脳領域内の特定の神経伝達物質の変化を測定できるため、空間的および時間的に正確なアプローチでありながら、低侵襲

この手順を実演するのは、私の研究室のHolly HunsbergerとRyan Heslinです。この手順を開始するには、MEA上の一対の記録部位を目的の酵素でコーティングし、別の記録部位のペアを不活性タンパク質マトリックスでコーティングします。次に、10マイクロリットルのハミルトンシリンジを使用してグルタミン酸オキシダーゼまたはタンパク質マトリックスを作成します。

プランジャーをそっと押して、シリンジの先端に小さな溶液のビーズを分配します。MEA記録部位を標的とするには、解剖顕微鏡下で、記録部位に溶液液滴(1つの層を表す)を短時間接触させることにより、溶液を適切な記録部位に適用します。収録現場への塗装と塗装の合間に1分間のタイマーをセットします。

次に、プラスチックアームの開口部に参照電極を配置します。参照電極をPBSを含むビーカーに下げ、ビーカーの底に接触しないようにします。次に、参照電極をヘッドステージに接続し、MEAをヘッドステージにメッキしたmPDに接続します。

MEAの先端だけが溶液に沈むように、MEAを溶液のビーカーに下げます。MEAチップを黒い泡の向こうの液体に浸さないでください。MEAが損傷する可能性があります。

次に、デスクトップ上の電気めっきアイコンを選択します。電気めっきツールのメニューで、正しい設定が入力されていることを確認します。その後、終了ソフトウェアを選択して電気めっきを終了します。

mPDメッキ電極チップをDI水ですすぎ、24時間保存してからキャリブレーションします。この手順では、摂氏37度で加熱パッドをオンにし、ヘッドステージを記録制御システムに接続します。次に、MEAチップを攪拌した0.5モルPBSの40ミリリットルに挿入します。

次に、ヘッドステージに参照電極を接続します。参照電極の先端をフリックして、気泡がないことを確認します。その後、録音プログラムを開き、設定が正しいことを確認し、MEA番号を選択して、[キャリブレーション]をクリックし、[開始]を押します。

平衡化のために5〜10分待ち、ベースラインが安定したらキャリブレーションを開始します。次に、ベースラインを選択し、500マイクロリットルのアスコルビン酸を追加します。次に、電流が新しい定常プラトーに達したら、干渉を選択します。

MEAが適切に電気メッキされている場合、変化は観察されません。次に、40マイクロリットルの20ミリモルL-グルタミン酸を追加します。電流が新たな定常プラトーに達したら、最初の添加物を分析種としてマークします。

3回繰り返して、合計3つのグルタミン酸を添加します。次に、40マイクロリットルのドーパミンを追加します。そして、試験物質を選択します。

続いて、40マイクロリットルの過酸化物を追加します。試験物質を選択し、キャリブレーションが完了したら停止ボタンをクリックします。このステップでは、マイクロピペットを4つのプラチナ記録サイトすべての中央に配置し、粘着性ワックスとモデリング粘土を使用してMEAの50〜100マイクロメートル上に取り付けます。

DCアダプターを使用して、赤いプラス線を金のピン側に用意した銀線にclし、黒い負極線をプラチナバスカソードにclします。次に、DCアダプターを接続して、正しいメッキプロセスを探します。バス電極に気泡が現れ、参照電極がシルバーグレー色に変わります。

この手順では、動物を定位固定装置に入れ、イヤーバーを使用して頭を安定させます。動物が固定され、頭が動かないことを確認してください。次に、滅菌綿のアプリケーターを使用して目の軟膏を塗布します。

その後、トリマーで頭を剃ります。そして、小さな手術用ハサミを使って耳の近くの毛皮を取り除きます。その後、ヨウ素とアルコールを交互に3回頭皮に塗ります。

これに続いて、頭皮の中央に切開を行い、皮膚を広げます。滅菌綿の先端で血液を吸収し、過酸化水素を塗布してブレグマとラムダの出現を促進します。ブレグマとラムダの背腹側と内側外側を測定して、頭が適切に配置されていることを確認してください。

bregma の座標を 0 に設定し、ターゲット座標をマークします。次に、マークの周りをドリルで囲みます。その後、MEAをヘッドステージに取り付けます。

ピペットを最初に必要な溶液で埋め戻します。排出される溶液を検査できるように、溶液のないピペットに隙間を必ず残してください。次に、チューブをガラスマイクロピペットに取り付けます。

MEA がアタッチされた bregma を見つけ、座標を 0 に設定します。MEAを目的の座標に移動し、先端が脳に触れるまでMEAをゆっくりと下げます。次に、背腹座標をゼロにし、MEAをゆっくりと脳に下げます。

参照電極をMEAから離れた場所に配置し、脳と液体で接触したままになるようにして、回路を完成させます。記録プログラムで、目的の校正済み電極をクリックし、[実験の実行]をクリックして記録を開始します。安定したベースラインを取得したら、圧力エジェクターを0.6秒と0.5psiに設定し、圧力エジェクターの赤いボタンを押して排出します。

注射シートに動かした時間と圧力、および体積ティックを記録し、必要に応じてメモを取ります。その後、マイクロピペットを取り付けた状態でMEAを取り外し、DI水ですすぎ、すべての血液がなくなるまでPBSに一晩浸します。海馬のCA3およびCA1領域では、ビヒクルで治療したTauP301Lマウスで強直性グルタミン酸レベルが有意に増加し、リルゾール治療によってその効果が弱まりました。

ここでは、CA3における塩化カリウム誘発グルタミン酸放出のベースライン一致した代表的な記録は、リルゾール処理がVehicle-TauP301Lマウスで観察されたグルタミン酸放出の振幅の有意な増加を減衰させたことを示しました。塩化カリウムの局所適用により、細胞外グルタミン酸が強力に増加し、急速に強壮性レベルに戻りました。塩化カリウムの局所適用がリルゾール処理で弱毒化された後、ビヒクル処理されたTauP301Lマウスで観察されたDG、CA3、およびCA1で有意に増加した塩化カリウムは、グルタミン酸放出を誘発しました。.

海馬のこのクレシルバイオレット染色切片は、CA3およびCA1のMEAトラックの位置を確認します。この手順を試行する際は、原稿に記載されているトラブルシューティングの手順を覚えておくことが重要です。たとえば、ノイズの多い信号を減らすには、システムを接地し、タイムリーに手順に従うことを忘れないでください。