Name: アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ酵素結合型マイクロ電極アレイを用いたアルツハイマー病マウスモデルの海馬におけるトニック・ファジックグルタミン酸動態の測定法。この技術は神経変性疾患の病態理解に有用です。

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（; U54GM104942 MNR）、NIA（MNR; R15AG045812）、アルツハイマー病協会（MNR; NIRG-12から242187）、WVU学部研究上院グラント（MNR）、およびWVU PSCORグラントこの作品は、国立総合医科学研究所によってサポートされていました（MNR）。

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<li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).</li>
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GGは、本研究では、グルタミン酸の測定に使用FAST-16記録システムを作るQuanteon、LLCの個人事業主です。 JEQはQuanteonのための有給コンサルタントです。

MEA技術は、in vitroおよびin vivoでの神経伝達物質の放出と吸収の速い反応速度を測定することができます。したがって、この技術は強壮、神経伝達物質のレベルを含むデータ出力、誘発神経伝達物質の放出、および神経伝達物質のクリアランスのさまざまなを生成します。 MEAの使用は、比較的複雑な手順であるため、しかし、成功した使用に最適化される必要があるかもしれない多くの要因があります。例えば、キャリブレーション時に、一方が無信号波形（オシロスコープ画面）または刺激に対する応答が最小の、または存在しないことがないことに注意してもよいです。システムの誤動作の可能性が高いが、記録システム、またはコンピュータを再起動し、問題を解決することがあります。また、問題が接続エラーである可能性があります。校正前に、MEAおよび基準電極接続が正しく接続されていることを再確認することが適切です。ヘッドステージ上のDIPソケットの交換は、MEA接続の問題を解決することができます。MEAは、溶液中に完全にないか、または不十分維持基準電極が使用される場合、これらは、また、...

脳内の神経伝達物質の変化を測定することは、多くの場合、神経伝達物質調節不全によって特徴付けられる中枢神経系（CNS）の疾患を研究する神経科学のための不可欠なツールです。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC / EC）と組み合わせた微小透析は、細胞外神経伝達物質レベルの変化1、2、3、4を測定するために最も広く使用される方法であったが、微小透析プローブの空間的及び時間的分解能は神経伝達物質のために理想的ではないかもしれませんこのようなしっかり外空間5,6に調節されるグルタミン酸塩、など。なぜなら遺伝学および画像化における最近の進歩により、 生体内でグルタミン酸をマッピングするために使用することができる追加の方法があります。遺伝的にコードされたグルタミン酸蛍光レポーターを用いて（iGluSnFR）AND二光子イメージング、研究者らは、in vitroおよびin vivo 7、8、9 の両方のニューロン及び星状細胞によってグルタミン酸放出を可視化することができます。注目すべきは、これはより広い視野からの録音を可能にし、脳の固有の接続が中断されることはありません。これらの新しい光学技術は、グルタミン酸動態および感覚誘発反応と神経活動の測定の可視化を可能にするが、それらは個別の脳領域における細胞外空間にグルタミン酸の量を定量化する能力を欠いています。 別の方法は、選択的に自己参照記録方式の使用を介して、例えば、グルタミン酸などの細胞外神経伝達物質レベルを、測定することができる酵素結合微小電極アレイ（MEA）です。 MEA技術は、外傷性脳以下の細胞外グルタミン酸の変化を研究するために使用されてきました損傷10、11、12、13、14、老化 、ストレス15、16、癲癇17、18、アルツハイマー病19、20、及びウイルス模倣21の注入および微小透析に固有の空間的および時間的な制限を超える改善を示します。微小透析は、シナプス22、23の近くに測定する能力を制限し、一方、MEAがシナプス24、25近くの細胞外グルタミン酸スピルオーバーの選択的測定を可能にする高い空間分解能を有しています。第二に、マイクロダイアリシスの低い時間分解能（1 - 20分）を調査する能力を制限します第二の範囲26にミリ秒で発生したグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクス。グルタミン酸のリリースやクリアランスの違いは強壮剤の対策では明らかではないかもしれないので、グルタミン酸レベルを休んで、グルタミン酸放出およびクリアランスを直接測定することが不可欠かもしれません。 MEAは、その高い時間分解能（2ヘルツ）及び検出の下限（&lt;1μM）にこのような対策を可能にします。第三に、MEAのは、ラットまたはマウスの海馬のような特定の脳領域内の神経伝達物質で小地域変動の検査を可能にします。例えば、細胞外グルタミン酸で小地域の違いを調べるために、我々は別々に歯状回（DG）、trisynaptic回路27を介して接続され、海馬のアンモン角3（CA3）およびアンモン角1（CA1）を標的とすることができるのMEAを使用。移植28 &lt;によって引き起こさ- （4mmの長さ1）及び損傷ため微小透析プローブのサイズの/ SUP&gt;、29、小地域の違いが対処するのは困難です。また、光学系は、小地域刺激7を許可しないようなウィスカ刺激または光のちらつきなどの外部刺激を介して刺激を可能にします。他の方法に比べてのMEAの最終利益は、彼らの外因性および内因性の接続を中断することなく、生体内でこれらの小領域を研究する能力です。 ここでは、セラミックベースのマルチサイト微小電極からなる膜電極アッセンブリと組み合わせて、どのように記録システム（ 例えば 、FAST16mkIII）記述、示差検体信号から検出して除去する干渉物質を可能にするために、記録部位に塗布することができます。我々は、これらのアレイは、麻酔RTG（TauP301L）4510匹のマウスのDG、CA3およびCA1海馬の小領域内のin vivoグルタミン酸調節、一般的に使用されるM個の電流測定に基づく研究のために使用することができ、また性を実証しますアルツハイマー病のウーズモデル。また、我々はリルゾールでマウスを処理することによりグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクスへのMEAシステムの感度の確認を提供し、in vitroで示された薬物は、グルタミン酸放出を減少させ、グルタミン酸の取り込み30、31、32、33を高めるために、そして、TauP301Lマウスモデルにおけるin vivoでのこれらのそれぞれの変化を実証します。

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8 channel</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode arrays</td><td>CenMet</td><td>W4 or 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (1ヶ月後に有効期限が切れます)</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (6ヶ月後に有効期限が切れます)</td></tr><tr><td>グルタミン酸オキシダーゼ</td><td>US BiologicalまたはSigma Aldrich</td><td>G4001-01 または 100646</td><td>50 UI (6 か月後に有効期限が切れます)</td></tr><tr><td>Hamilton Syringes</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 シリンジ</td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td>BDH UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>m-フェニレンジアミン二塩酸塩 (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>参照電極 (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 電極</td></tr><tr><td>電池式 磁気攪拌板</td><td>コールパーマー</td><td>EW-04804-01</td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>酸 Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td></td><td>TCI 50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>ドーパミン塩酸塩</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>過塩素酸</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>塩化後</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>ガラス圧力排出ピペット</td><td>CenMet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スティッキーワックス</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>別のサプライヤー</td></tr><tr><td>から購入できますMicrosyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>モデリング クレイ</td><td>ウォルマート</td><td></td><td>さまざまなサプライヤーから購入できます</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シルバー ワイヤー</td><td>AM システム</td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>プラチナ ワイヤー</td><td>AM システム</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>はんだガン</td><td>ロウズまたはホームデポ</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>マルチメーター</td><td>ウォルマート</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td></td> 異なる<td>サプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Stoelting</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>デジタルラボスタンダード</td><td>Stoelting</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>Meiji EMZ 顕微鏡</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>ドレメル</td><td>マイクロ</td><td></td></tr><tr><td>メトリック</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入できます</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>VWR</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>ピューリタン</td><td>25806</td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>Puralube 獣医軟膏</td><td></td><td>獣医から入手</td></tr><tr><td>ヨウ素スワブ</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>地元のドラッグストア</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>滅菌手術用ドレープ</td><td>ダイナレックス</td><td>4410</td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>テクノバ</td><td>S5815</td><td>フィルターを使用して独自の溶解を作ることができます</td></tr><tr><td>過酸化水素 (3%)</td> <td>地元のドラッグストア</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>ウォルマート</td><td></td><td>異なるサプライヤーから購入可能サプライヤー</td></tr></tbody></table>

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

神経伝達物質の破壊は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、および不安の根底にある病理学において役割を果たし、多くの場合、中枢神経系（CNS）の疾患の重要な要素です。伝統的に、微小透析は、これらの疾患で発生する神経伝達物質の変化を調べるための最も一般的な（賞賛）技術となっています。微小透析は、組織の広い領域にわたる遅い1-20微細な変化を測定する能力を持っているので、しかし、それは潜在的に脳と低速サンプリング機能内の固有の接続を破壊し、侵襲性の欠点を持っています。比較的新しい技術は、微小電極アレイ（MEA）は、彼らが起こるように、空間的および時間的に正確なアプローチを行う、別個の脳領域内の特定の神経伝達物質の変化を測定するための多くの利点を有しています。また、MEAのを使用して、インビボでの神経伝達物質の変化の測定を可能にする、低侵襲性です。私たちの研究室では、我々ヘクタールアルツハイマー病の病理学に関連する神経伝達物質の変化、グルタミン酸、中に特に興味を持ってきまし。そのため、ここで説明する方法は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、グルタミン酸の潜在的な海馬の中断を評価するために使用されてきました。簡潔には、使用される方法は、対象の神経伝達物質のための非常に選択的な酵素によるマルチサイト微小電極を被覆し、バックグラウンドノイズと干渉を減算する自己参照サイトを使用することを含みます。めっき及び較正後、MEAは、マイクロピペットを用いて構築することができ、定位装置を用いて、関心のある脳領域に低下しました。ここで、この方法は、RTG（TauP301L）4510匹のマウスを麻酔し、正確海馬のサブ領域（DG、CA1およびCA3）を標的とするために、定位装置を使用することを含む説明しました。

この技術は、このような外傷性脳損傷、加齢、ストレス、およびてんかんなどの動物モデル、多くの種類のシグナリンググルタミン酸の変化を測定するために使用することができますが、ここでは、MEAの技術は、トランスジェニックマウスモデルにおけるグルタミン酸作動性の変化を調べるために使用することができる方法を示し人間タウオパチー19、20の。 RTG（TauP301L）4510マウスは、第17染色体にリンクされた前頭側頭型認知症及びパーキンソン関連付けられたタウにおけるP301L突然変異を表し、一般にアルツハイマー病、神経変性タウオパチーおよび前頭側頭型認知症に関連したタウ病理を研究するために使用されます。我々はまた、グルタミン酸作動性シグナル伝達は、薬理学的介入によって変更することができることを示しています。我々は、リルゾールで安定化することによりグルタミン酸作動性シグナル伝達を調節する筋萎縮性側索硬化症（ALS）のためのFDA承認疾患修飾薬をTauP301Lマウスを...

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

本手順の全体的な目的は、酵素修飾マイクロ電極アレイを用いて、in vivoで細胞外グルタミン酸のトニックおよびフェイジックな変化を測定することです。この手法は、疾患状態において細胞外神経伝達物質のレベルや、神経伝達物質の放出および除去の高速なダイナミクスが変化するかどうかなど、神経科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、マイクロ電極アレイによって脳の特定の領域における特定の神経伝達物質の変化を測定できることであり、低侵襲でありながら空間的および時間的に精密なアプローチが可能となる点にあります。本手順の実演は、私の研究室のHolly HunsbergerとRyan Heslinが行います。まず、MEA上の1組の記録部位に目的の酵素を、別の1組の記録部位に不活性タンパク質マトリックスをコーティングします。次に、10 µLのHamiltonシリンジを用いて、グルタミン酸酸化酵素またはタンパク質マトリックスを吸い上げます。プランジャーをゆっくりと押し、シリンジの先端に溶液を少量のビーズ状に dispense します。解剖顕微鏡下で、溶液の滴を目的の記録部位に短時間接触させることで、MEA記録部位に溶液を適用します。これで1層分となります。記録部位へのコーティングを繰り返す際は、塗布の間隔を1分間に設定してください。次に、基準電極をプラスチックアームの開口部に通します。基準電極をPBSが入ったビーカーの中に浸し、ビーカーの底に接触しないようにしてください。続いて、基準電極をヘッドステージに接続し、MEAをヘッドステージに装着されたmPDに接続します。MEAを溶液の入ったビーカーの中に下げ、MEAのチップ部分のみが溶液に浸かるようにします。MEAのチップを黒い気泡より深く溶液に浸さないでください。そうするとMEAが損傷する恐れがあります。次に、デスクトップ上の電気めっきアイコンを選択します。電気めっきツールのメニューで、設定が正しく入力されているか確認してください。その後、「ソフトウェアを終了」を選択して、電気めっきを完了します。mPDコート電極チップをDI水で洗浄し、校正前に24時間保存します。この手順では、ヒーティングパッドを37 °Cに設定してオンにし、ヘッドステージを記録制御システムに接続します。次に、撹拌した0.5 M PBS 40 mLにMEAチップを挿入します。次に、参照電極をヘッドステージに接続します。参照電極の先端を軽く弾き、気泡がないことを確認してください。その後、記録プログラムを開き、設定が正しいことを確認してMEA番号を選択し、「Calibration」をクリックして「start」を押します。平衡化に5〜10分間時間を置き、ベースラインが安定したら校正を開始します。次に、Baselineを選択し、500 µLのアスコルビン酸を加えます。その後、電流値が新たな定常プラトーに達したら、Interferentを選択します。MEAの電析が適切に行われていれば、変化は見られないはずです。次に、20 millimolarのL-glutamateを40 µL加えます。電流が新しい定常プラトーに達したら、この1回目の添加を分析物として記録します。これを3回繰り返し、計3回のグルタミン酸添加を行います。次に、40 µLのドーパミンを添加します。そして、「Test Substance」を選択します。続いて、過酸化物を40マイクロリットル添加します。「Test Substance」を選択し、キャリブレーションが完了したら停止ボタンをクリックしてください。このステップでは、マイクロピペットを4つの白金記録電極のすべての中央に配置し、粘着ワックスと模型用粘土を用いて、MEAから50〜100マイクロメートルの高さに固定します。DCアダプターを使用し、赤色の正極線を金ピン側の準備した銀線に、黒色の負極線を白金浴陰極にそれぞれクランプします。次に、DCアダプターをコンセントに差し込み、メッキプロセスが正しく行われているかを確認します。浴電極に気泡が発生し、参照電極が銀灰色に変化している必要があります。この手順では、動物を脳定位固定装置に設置し、イヤーバーを用いて頭部を固定します。動物がしっかりと固定され、頭部が動かないことを確認してください。その後、滅菌綿棒を使用して眼軟膏を塗布します。その後、トリマーで頭部を剃毛します。耳の周りの被毛は、小型の手術用鋏を用いて除去してください。続いて、頭皮にヨウ素剤とアルコールを交互に3回塗布します。続いて、頭皮の中央を切開し、皮膚を広げます。滅菌綿棒で血液を吸収させ、過酸化水素を塗布して、ブレグマとラムダを視認しやすくします。ブレグマとラムダの背腹方向および正中・外側方向の距離を測定し、頭部が適切に配置されているかを確認してください。ブレグマにおける座標をゼロに設定し、標的座標をマークします。次に、マークの周囲をドリリングします。その後、MEAをヘッドステージに取り付けます。最初に目的の溶液をピペットに後方から充填します。この際、排出される溶液を確認できるよう、ピペット内に溶液のない隙間を必ず設けてください。その後、ガラスマイクロピペットにチューブを接続します。MEAを装着した状態で前頭縫合（bregma）を確認し、座標をゼロに設定します。MEAを目的の座標まで移動させ、チップが脳に接触するまでゆっくりと降ろします。次に、背腹方向（dorsal-ventral）の座標をゼロにし、MEAをゆっくりと脳内に挿入します。参照電極を、回路を完結させるために脳と液的に接触したまま、MEAから離れた位置に配置します。記録プログラムで、校正済みの目的の電極をクリックし、「perform experiment」をクリックして記録を開始します。安定したベースラインが得られた後、プレッシャーエジェクターを0.6秒および0.5 psiに設定し、プレッシャーエジェクターの赤ボタンを押して注入します。注入シートに時間と圧力、および移動した容量の目盛りを記録し、必要に応じてメモを記入します。その後、マイクロピペットが付いたままの状態でMEAを取り出し、DI waterで洗浄し、血液がすべてなくなるまで一晩PBSに浸漬します。海馬のCA3およびCA1領域において、vehicle投与TauP301Lマウスでは緊張性グルタミン酸レベルが有意に上昇していましたが、この効果はリルゾール投与によって減弱しました。ここで、塩化カリウム誘発性のグルタミン酸放出のベースラインを一致させたCA3の代表的な記録では、Vehicle-TauP301Lマウスで観察されたグルタミン酸放出振幅の有意な増加が、リルゾール処理によって減弱したことが示されました。塩化カリウムの局所投与により、細胞外グルタミン酸の強固な増加が誘発され、その後速やかに緊張性レベルへと戻りました。Vehicle処理を施したTauP301Lマウスにおいて、塩化カリウムの局所投与後にDG、CA3、およびCA1で観察された塩化カリウム誘発性のグルタミン酸放出の有意な増加は、リルゾール処理によって減弱しました。このクレシルバイオレット染色された海馬切片により、CA3およびCA1におけるMEAトラックの位置が確認されました。この手順を行う際は、原稿に記載されているトラブルシューティングの手順を念頭に置くことが重要です。例えば、ノイズ信号を低減させるには、システムの接地（アース）を行い、各手順を適時適切に実施してください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

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