組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

本プロトコルの総合的な目的は、3D in vitro 細胞培養モデルや細胞デリバリーシステムにおけるプロ再生スキャフォールドとしての応用に向け、組織特異的な細胞外マトリックス由来の非化学架橋フォームまたはマイクロキャリアのサイズを調整することです。本手法は、3D細胞微小環境が細胞機能や組織再生をどのように媒介するかといった、応用細胞生物学および組織工学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、天然の組織特異的ECM組成を模倣し、追加の架橋なしで長期培養において安定した、幾何学的な調整が可能なスキャフォールドの作製を可能にする点にあります。

テキストのプロトコルに従って組織由来のECMを凍結乾燥させた後、鋭利な外科用ハサミを使用して脱細胞化組織を細かく刻みます。処理した組織をクライオミルで粉砕するには、ラボ用ボールミルシステムの25 milliliterステンレス製ミリングチャンバーに刻んだ凍結乾燥ECMを満たし、10 milliliterのステンレス製ミリングボールを2個加えます。充填したミリングチャンバーを密閉し、液体窒素に完全に浸して3分間保持します。

次に、冷凍サンプルを30 Hzで3分間ミル処理します。ECMが微粉末になるまで、液体窒素への浸漬とミル処理を繰り返します。刻片またはクライオミル処理したECMを250 mg量り取り、15 mL遠心チューブに移します。

遠心チューブに22 molar NaH2PO4緩衝液を5 milliliters加え、チューブ上の液面をマークします。次に、22 molar NaH2PO4緩衝液1 milliliterにalpha amylaseを7.5 milligrams加えて、alpha amylaseストック溶液を調製します。続いて、このalpha amylaseストック溶液100 microlitersをサンプルに加えます。

次に、最終容量が10 millilitersになるまで22 molar NaH2PO4を加えます。この懸濁液を、室温で300 RPMにて72時間連続的に撹拌します。その後、懸濁液を1500 times Gで10分間遠心分離します。

消化したECMペレットを乱さないように注意して上清を回収し、廃棄します。次に、2回蒸留水で希釈した5% NaClを10 milliliters使用してペレット状の物質を再懸濁し、300 RPMで10分間連続的に撹拌します。この洗浄工程をさらに2回繰り返し、最後に2回蒸留水10 millilitersを用いてペレットを再懸濁します。

その後、懸濁液を室温で300 RPMにて10分間、連続的に撹拌します。サンプルを再度遠心分離した後、消化されたECMペレットを乱さないように注意して上清を回収し、廃棄します。5 mLの標線まで2 M 酢酸を加えます。

そしてボルテックスします。その後、懸濁液を120 RPM、37 °Cで一晩連続的に攪拌します。翌日、10 mm幅の鋸歯状プローブを備えたハンドホモジナイザーを用い、可視的な断片がなくなるまで、室温で10秒間隔でECM懸濁液をホモジナイズします。

過熱を防ぐため、ホモジナイズの合間に懸濁液を冷水のビーカーに入れてください。懸濁液が温まるまで、ECM懸濁液を37 °Cで120 RPMの連続攪拌しながらインキュベートします。その後、2 M 酢酸を用いてサンプル懸濁液を目的の濃度まで希釈します。

3 mLのシリンジと18ゲージの針を用いて、目的のモールドにECM懸濁液を満たします。フォームは、モールドの形状に応じてさまざまな形状で作製することが可能です。モールドに蓋をし、-20°Cまたは-80°Cで凍結させます。

その後、型を凍結乾燥機のフラスコに入れます。フラスコを研究用凍結乾燥システムに接続し、24時間または完全に乾燥するまで型を乾燥させます。凍結粉砕したECM懸濁液を、100 RPMで連続攪拌しながら一晩インキュベートします。

3 mLのECM懸濁液を3 mLのルアーロックシリンジに充填し、シリンジの先端に翼状点滴セットを取り付けます。シリンジポンプにシリンジを固定します。次に、針をレトルトスタンドに固定し、低形成デュワーフラスコの上端から4〜6 cm離れた位置に針先を垂直に配置します。

次に、ワニ口クリップ電極を針の先端に取り付けます。このとき、ワニ口クリップが高電圧電源の正極に接続されていることを確認してください。アルミホイルの帯を真空フラスコの縁に折り曲げて被せます。その後、2つ目のワニ口クリップ電極をホイルの外端に取り付けます。

電源の接地端子に接続します。デュワー瓶に液体窒素を上端から約1 cmまで満たし、ホイルの4分の3が浸るようにします。次に、シリンジポンプの注入速度を30 mL/hに設定し、テキストプロトコルに従ってサンプルのエレクトロスプレーを行います。

注入が完了したら、マイクロキャリアが凍結したままであることを確実にするため、デュワー瓶の中に約 25 milliliters の液体窒素を残し、余分な液体窒素を注意深く捨てます。その後、液体窒素とともにマイクロキャリアを、一度のスムーズな動作で 50 milliliter の遠心チューブに速やかに移します。次に、スクープラを使用して、デュワー瓶に残っている凍結したマイクロキャリアを回収します。

それらも同様に遠心分離管に加えます。凍結乾燥の準備として、小さな穴を開けたアルミホイルで遠心分離管を覆います。覆った遠心分離管を凍結乾燥機のフラスコに入れます。

その後、直ちにフラスコを凍結乾燥機に接続し、サンプルを一晩乾燥させます。凍結乾燥させたフォームを、十分な量の絶対エタノールを含む50 milliliter遠心チューブに慎重に転移します。同様に、回収に使用した元の遠心チューブ内で、凍結乾燥させたマイクロキャリアを十分な量の絶対エタノールで再懸濁します。

セロロジカルピペットを用い、マイクロキャリアを規定のメッシュサイズのステンレス製ふるいでろ過し、新しい50 milliliter遠心チューブに移して凝集物を取り除き、目的のサイズ範囲を選別します。サンプルを4 °Cで4時間、または泡やマイクロキャリアが遠心チューブの底に沈殿するまでインキュベートします。その後、ラミナーフローフード内で無菌操作を行い、セロロジカルピペットを用いてスキャホールドから絶対エタノールを除去し、滅菌PBSで希釈した過剰量の95% ethanolを加えます。

スキャフォールドを4°Cで4時間、またはスキャフォールドが再水和容器の底に沈むまでインキュベートします。エタノール系列を用いて、スキャフォールドを徐々に再水和させます。各ステップにおいて、溶液を交換する前に、スキャフォールドが容器の底に沈むまで4°Cでインキュベートしてください。

滅菌PBSを用いてさらに2回洗浄し、残留エタノールを除去します。細胞培養の準備が整うまで、サンプルを100%滅菌PBS中で4°Cで保存してください。再水和後1〜2週間以内にスキャフォールドを使用してください。

ここでは、脱細胞化脂肪組織を用いて作製されたECM由来フォームおよびマイクロキャリアの例を示しています。また、ブタ脱細胞化真皮組織およびブタ脱細胞化左心室も示しています。これらの結果は、さまざまな脱細胞化組織をECM源として用いることで、組織特異的なバイオスキャフォールドを生成する手法が適用可能であることを実証しています。

クライオミルによる粉砕または刻砕、酵素消化、およびホモジナイズの後、サンプルをボウルに分注し、凍結および凍結乾燥を行うことができます。この図は、48ウェル組織培養プレート型を用いて合成され、再水和させたDAT、DDT、およびDLVのミル処理済みフォームを示しています。これらのDAT、DDT、およびDLVフォームは、35 mg/mLの濃度のクライオミル処理済みECMを用い、-80 °Cの凍結温度で作製されました。

エレクトロスプレー法を用いてECM由来のマイクロキャリアを作製する場合、各ECMソース懸濁液の濃度、ニードルゲージ、注入速度、および電圧を調整することで、制御された再水和後に直径350から500 µmの範囲の独立した球状マイクロキャリアを生成できます。最終的に、ここにSEMで示すDAT、DDT、およびDLVマイクロキャリアからは、脱細胞化ECMソースによってサイズの微細構造が異なることが分かります。本ビデオで提示した手法を用いることで、脱細胞化組織をマトリックスソースとし、純粋で化学的に架橋されていないECMから構成される、多様な組織特異的マイクロキャリアおよびフォームを作製することが可能です。

これらの手順に従い、フォームおよびマイクロキャリアに静的または動的条件下で細胞を播種させることができ、in vitro 細胞培養および in vivo への適用のための細胞誘導性基質として利用することが可能です。