細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

これらの手順の全体的な目標は、初期開発段階で標的細胞や腫瘍の内部に蓄積する抗体複合体の特異性と有効性を評価し、最終的に臨床で使用できるようにすることです。この方法は、核局在の効率や全体的な細胞間蓄積など、共役場の答えに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、PETイメージングを介して、研究者が候補抗体複合体の有効性と選択性を評価できることです。

これらの技術の意味は、がんの治療と診断にまで及びますが、これは、効果のない腫瘍細胞の蓄積が抗体複合体のこれらのアプリケーションの主要な制限であるためです。テキストプロトコールに従って疝痛酸核局在化配列抗体コンジュゲートを合成した後、標的TF1A細胞を200ナノモルの7G3コール酸MLS抗体コンジュゲートで処理します。修飾コントロールモノクローナル抗体で処理した細胞を含む。

6番目の抗原陽性細胞をコンジュゲートと10回5回インキュベートし、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、上清を取り除き、1ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄します。新鮮な培地を加え、細胞を摂氏37度でさらに1時間インキュベートします。

次に、0.25%トリプシンとEDTAを含む0.5ミリリットルのPBSを加え、細胞を摂氏37度で最大30分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するためにRPMI1640 10%FBSを含む1.5ミリリットルの培地を使用します。細胞をGの500倍で5分間遠心分離し、上清を取り除き、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を再度3回洗浄します。

0.5ミリリットルの1%PFAと1%スクロースとPBSを細胞に加え、氷の上に30分間置いて固定します。次に、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄し、サンプルをGの250倍で5分間遠心分離します。次に、0.15%Triton X-100とPBSを細胞に添加し、氷上で5分間浸透させます。

次に、氷冷したPBSで細胞を洗浄し、遠心分離を繰り返します。Alexa Fluor 647に結合したアンチミラーリングFC二次ポリクローナル抗体を1ミリリットルあたり2マイクログラム含有する0.1ミリリットルのPBSに細胞を懸濁し、サンプルを室温の暗所で1時間インキュベートします。細胞をGの250倍で5分間遠心分離し、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄します。

次に、細胞を0.5ミリリットルのPBSに懸濁します。ヨウ化プロピジウム1ミリリットルあたり10マイクログラムを細胞に加えます。次に、封入剤を使用して、10〜5番目のセルをスライドガラスに1回マウントしてから、サンプルをガラスカバースリップで覆います。

Plan APO 60X 油浸対物レンズ、開口数 1.42 で、倒立型レーザー走査型共焦点顕微鏡で細胞を検査します。488ナノメートルのアルゴンレーザーと600〜650ナノメートルのスペクトル走査プリズムセットを使用してPI蛍光を検出します。AF 647蛍光には、633ナノメートルのヘリウムネオンレーザーと650〜700ナノメートルのスペクトル走査プリズムセットを使用します。

PIとAF 647から、1024 x 1024ピクセル、2倍のライン平均で、セル全体の厚さにわたって0.5ミクロン間隔で撮影された画像を順番に収集します。画像を Z 投影として表示します。細胞を解析するには、細胞質内の細胞内蛍光がグループ化され、細胞表面近くにあるか、びまん性で均一であるかを評価し、記録します。

また、細胞あたりの相対蛍光強度も評価します。テキストプロトコルに従って放射性標識コール酸NLS抗体コンジュゲートを調製し濃縮した後、0.5マイクロリットルの0.1モルPH5.5クエン酸ナトリウムまたはITLC溶離液をITLCストリップに適用することにより、放射性標識効率を決定します。ストリップのオートラジオグラフを作成し、デジタル画像を取得します。

デンシトメトリーを実施して、結合銅と遊離銅-64の割合を取得します。遊離銅-64含有量が5%を超える場合は、サンプルをさらに濃縮します。Copper-64細胞蓄積研究では、前述したように、100ナノモルのCopper-64標識A14コンジュゲートを摂氏37度で1時間、6時間、および24時間処理します。

細胞を未修飾のA14で処理してIL5Rアルファサイトをブロックし、摂氏4度で受容体を介した内在化をブロックします。このビデオで前述したように、細胞を洗浄し、新鮮な培地でインキュベートした後、0.25%トリプシンとEDTAを含む0.5ミリリットルのPBSを加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、前回と同様に細胞を中和して洗浄した後、細胞にプラズマ膜溶解バッファーを加え、氷上で10分間インキュベートします。

血漿膜溶解細胞をGの90倍で5分間遠心分離します。上清を取り除き、新しいチューブに移します。これは細胞質画分を表します。

次に、氷冷PBSを使用して核を3回洗浄し、その洗浄液を細胞質画分に加えます。核画分と細胞質画分を含むバイアルが密封されていることを確認し、生カウントをメガベカリルに変換するために、銅-64用に較正されたガンマカウンターにそれらを置きます。制限された核タンパク質であるラミンACのウェスタンブロット分析を行うことにより、核単離の品質を決定します。Rab-7は、豊富な細胞質タンパク質で、ライセート、核、および細胞質画分を卸売りしています。

500マイクロリットルの放射性アミノ沈殿アッセイ、またはRIPAバッファー、および1%2%および4%NP-40を含むプラズマ膜溶解バッファーで、6つの細胞に10の5倍を処理します。さらに、単離された核を500マイクロリットルのRIPAバッファーで処理して、単離された核タンパク質を取得します。単離された核タンパク質、細胞質タンパク質、およびホールセールタンパク質に、サンプル量の4倍の冷アセトンを加え、マイナス20°Cで60分間インキュベー

サンプルを 13, 000 倍 G で 10 分間遠心分離します。タンパク質ペレットが外れないように注意しながら、上清をデカントします。次に、100マイクロリットルのPBSを加えてタンパク質を溶解します。

前述のようにウェスタンブロッティングを行った後、40キロダルトンの分子量マーカーでメンブレンを半分に切断します。高分子タンパク質を含むブロットのプローブにはLamin-AC特異的抗体を使用し、メンブレンの下半分のプローブにはRab-7特異的抗体を使用します。4匹のノドスキットマウスを含むグループで、20〜30マイクログラムの放射性標識A14疝痛酸NLS抗体複合体、放射性標識A14 NLS、および放射性標識A14を尾静脈に注入します。

同じ日に、5メガベカリルの銅-64が入った円筒形のファントムをPETスキャナーにセットし、1秒あたりの放射性物質の数を組織のグラムあたりの注射線量に変換します。48時間後、テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、マウスをイソフルランのノーズコーンを使用して頭を最初に腹臥位にしてPETスキャナーテーブルに迅速に移します。通常のサンプリングモード設定と250〜650キロ電子ボルトのエネルギーウィンドウを使用して、PETデータ集録を開始します。

スキャン後、マウスをスキャナーから取り外し、ケージに戻します。この図に示すように、矢印はトリプシン化の有無にかかわらず抗体複合体の蓄積を評価する場合の違いを示しています。トリプシン化されていない細胞では、標的細胞の表面受容体が過剰に発現するため、細胞内の蓄積と分布を評価することは困難です。

矢印は、細胞が適切にトリプシン化された場合の2つの抗体標識候補の細胞内蓄積と分布の違いを示しています。放射性標識されたA14疝痛酸NLS抗体コンジュゲートは、IL5Rαに対してナノモル親和性を示します。放射性標識A14コール酸NLS抗体コンジュゲートの濃度が上昇すると、A14コール酸NLS抗体コンジュゲートの特異的結合は、HT-1376細胞とHT-B9細胞の両方で3.5ナノモルの濃度で飽和に近づきました。

ガンマ計数により、放射性標識A14コール酸NLS抗体複合体による核内および細胞質内の放射能の増加は特異的であり、時間とともに増加することが明らかになりました。HT-1376およびHT-B9細胞を、1%2%または4%NP-40を含む血漿膜溶解緩衝液とインキュベートしました。HT-1376およびHT-B9細胞では、1つまたは2%NP-40 Rap-7を含む溶解バッファーは核画分では検出されず、ラミンACは細胞質画分で検出されませんでした。

PETイメージングでは、抗原陽性腫瘍を標的とする能力、赤と青の矢印、およびそれらに関連する生体内分布特性について、親の非ペプチド修飾抗体と比較して、候補抗体コンジュゲートの評価が可能になります。腫瘍内のシグナルの蓄積が見られ、開発された抗体複合体の可能性を選択するのに役立ちます。PETイメージングでは、肝臓などの健康な組織における抗体標識の取り込み候補の評価も可能になります。

これらの技術を習得した後、分子ペイロードの標的腫瘍送達の分野の研究者は、エンドソームの閉じ込めにより腫瘍細胞の蓄積が妨げられる追加の薬剤を探索できるようになります。