Name: に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング A。フミガーツス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶヒト一次好中球と単球の抗カビ活動を蛍光Aspergillusコンディアとライブイメージングでリアルタイム評価する方法。食細胞作用や細胞遊走の欠陥を特定し、真菌免疫応答を解明する。

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医真菌真菌免疫学（SFB、JMB、JK、AW） - この作品は、MRCとアバディーン大学（医真菌のためのMRCセンター）によっておよびウェルカムトラスト戦略的な賞でサポートされています。特別なあなたはクロエ基金からの支援に与えられて感謝しています。 TMHは、米国国立衛生研究所（NIH、コードRO1 093808）、メモリアルスローンケタリングがんセンターからの助成金によってサポートされているNIHのグラントP30のCA008748によってサポートされています。さらに、TMHはバローズウェルカム基金でサポートされている感染症の病因における研究者です。私たちは、彼らの助けと支援のためのアバディーン顕微鏡および組織学施設に感謝したいです。

好中球および末梢血単核細胞（PBMC）を得るためのプロトコルは、以前公開された方法9に基づいています。健康なボランティアからの血液サンプルの使用は、アバディーン大学の人間研究倫理委員会によって承認されました。開始する前に、すべての倫理的な承認が記載される実験の目的のために健康なボランティアおよび/または患者から血液を描画するための場所であることを確認してください。彼らの生存を増加させることができる細胞を氷上に保管してください。 1. A. fumigatusの培養条件<ol><li> 10に記載されているようにグルコース最小寒天培地を調製します。 <ol><li> 1 M NaOHを用いてpH6.5にメディアを調整し、20分間120℃でオートクレーブ。 </li><li> 65℃に冷却させます。 </li><li>滅菌流フード中で作業し、T75フラスコに冷却媒体の30mLの流動およびC 25 mlピペットでフラスコ休止の首と冷却させます寒天斜面をreate。 </li></ol></li><li>寒天上のDsRed Af293- A.フミガーツス株アウトストリークし、37℃+ 5％CO 2で7日間インキュベートします。 2つのフラスコを、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）プレビオチンに約10 9分生子をもたらします。 </li></ol> 2. A.フミガーツスラベリング及び準備注：最初にこのアッセイを行う場合、親Af293- A.フミガーツス株を調製します。マイクロ遠心チューブ中の両方の株のサンプルを採取し、以下に説明するようにのみ各株のいずれかを標識します。これは、1つは、セットアップや機器をテストするために、DsRedのかAF633のいずれか、単一の色と色なしと分生子を制御分生子を持つことができるようになります。 <ol><li> 30mLのPBS + 0.05％のTween-80で培養液を浸漬することにより収穫A.フミガーツス分生子。菌糸断片を除去するために、50mLのチューブに40μmのセルストレーナーを通して得られた懸濁液をフィルタリングします。 </li><li> C10分間、805×gでentrifuge、上清を除去し、無菌PBS 20mlに1回洗浄。洗浄工程中の同系統の二つのプレートからのプール分生子。 </li><li>洗浄工程後、マイクロ遠心チューブに5 mlのPBSと転送分生子懸濁液の1mLのアリコートでペレットを再懸濁します。各菌株の懸濁液の1mLを通常生細胞イメージングのために十分です。 4℃で箔とストア内の残りのアリコートを包みます。 </li><li>分生子懸濁液の遠心分離アリコートを室温で10分間、9,300×gで、慎重に上清を除去します。 1 mLの0.05 M NaHCO 3をpHが8.3に分生子ペレットを再懸濁します。 </li><li> 500μLのDMSO中に25mgのビオチンを再構成することにより、10 mgのビオチン/ 200μLのジメチルスルホキシド（DMSO）ストック溶液を調製します。アルミホイルに10μLビオチン/マイクロ遠心チューブにDMSOストック溶液、カバーを追加し、4℃でロッカー上で2時間インキュベートします。 <ol><li>ビオチン/ DMSOストックsolutioの残りをアリコートnと、その後の実験で使用するために-20℃で凍結します。 </li></ol></li><li> 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。自由浮動ビオチンを不活性化するために1時間、100mMのトリス-HCl pH8.0の1mLの分生子ペレットを再懸濁します。 </li><li> 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。滅菌PBS 1mLで二回ペレットを洗浄し、1mlのPBSにペレットを再懸濁します。 </li><li> 2mg / mLのストック溶液を作製するためにPBS 0.5mlのストレプトアビジン - AF633 1mgを溶解させます。分生子懸濁液1mlあたり2ミリグラム/ mLのストレプトアビジンAF633の10μLを加え、アルミホイルで覆われたロッカー上で室温で40分間インキュベートします。残りのストレプトアビジンAF633は、その後の実験で使用するための一定分量で凍結させることができます。 </li><li> 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。 PBS 1mLに分生子ペレットを再懸濁し、1で血球計数器を使用して、分生子をカウント：1,000希釈（1：100、その後1:10）。 CO 2独立培地で3.6×10分生子濃度6 / mLに調整し、4℃で箔とストアに包みます。 注：分生子は今AF633で標識されており、FLARE分生子と呼ぶことにします。 </li><li>オプション：膨潤分生子による刺激が必要な場合、分生子（ステップ2.9）をカウントした後、酵母窒素塩基（YNB）培地中に7.2×10 6 / mLに分生子を希釈し、オートクレーブ50内に4.5 mLのYNB培地500μLを分生子懸濁液を追加mLの三角フラスコ。カバー6時間振盪インキュベーター（37℃、200 RPM）にフラスコを置きます。 <ol><li> 15mLのチューブに培地を移します。室温で10分間、805×gで遠心分離し、PBS中で1回洗浄します。遠心分離機再度1mLのCO 2独立培地中でペレットを再懸濁し、3.6×10 6分生子/ mLに与えます。 注：分生子は頻繁に彼らは困難数え正確作る腫れになった後、Cで計算することをお勧めされて凝集使用分生子を休んのounted番号。 </li></ol></li></ol>ヒト好中球および単球の3分離<ol><li>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む2本の10 mLの血液チューブに健康なボランティアから静脈血20mLのを描きます。別々に各ドナーのために、50 mLチューブに20mLの血液を注ぎ、15mLのPBSで希釈しました。 </li><li>シリンジおよび鉄針とリンパ球分離溶液（密度1.077グラム/ mL）を15 mLの血液を下敷き。チューブの底に針を置き、穏やかにリンパ球分離溶液を押し出します。ブレーキなし、低加速度で20分間、630×gで遠心します。 </li><li> PBS、氷上で冷却を準備します。 注：手順3.4と3.5は、単球（3.4）と好中球（3.5）を生成するために同時に従わなければなりません。 </li><li> pastetteを使用して、PBMC層を収穫。これは、黄色血清（上部）と透明リンパ球分離溶液（下部）層との間の中央に層であり、そして新しい50mlチューブに移します。 <ol><li> 10分間582×gで50冷PBSでmL及び遠心分離までPBMCでチューブを埋めます。上清を除去し、最初に使用されるドナー血液の20 1mLあたり1mlのPBSに再懸濁し、冷PBSとで二回洗浄します。 </li><li> PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）及びHBSS 500mLの0.5 M EDTAの2.1ミリリットルの26ミリリットルを添加することによって緩衝液を調製します。遠心分離機1×10 7個の細胞当たり緩衝液40μL中515×gで再懸濁で10分間細胞。 </li><li> 15mLのチューブに細胞懸濁液を移し、1×10 7細胞あたりのCD14マイクロビーズの10μLを追加し、よく混合し、5分毎のチューブを混合することを確認して、4℃で15分間インキュベートします。 </li><li> 1×10個の7細胞およびCEN当たり緩衝液1mlを添加することによって細胞を洗います10分間515×gでtrifuge。 </li><li>吸引完全上清および緩衝液500μLに1×10 8細胞まで再懸濁します。 </li><li>製造業者の指示に従って磁気分離にサンプル当たり1つのカラムを置き。第1緩衝溶液500μLで一度カラムを洗浄。 </li><li>乾燥した後、緩衝液でこの3回繰り返して洗浄する列を待ち、カラムを通して細胞懸濁液500μLをピペット。 </li><li>カラムの下に新しい15mLのチューブを配置し、磁気分離カラムオフを取ります。次いで、緩衝液1mLでチューブにカラムから細胞を洗い流します。 </li><li> 10分間、515×gで緩衝液及び遠心分離機の4 mLを加え、次いで、ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地1mLに再懸濁します。 </li><li> PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。で細胞を数えます血球計数器。 </li><li> RPMI 6×10 5 / mlに細胞濃度を調整し、35mmのガラスベースのイメージング皿上に200μLを播種。 5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>次の日、撮影に先立って、RPMIを除去し、CO 2独立培地200μLを加えます。 注：これらの単球も前に撮像種々マクロファージサブセットに分化させることができます。これは探求する手法であれば、優れた出発点はOhradanova-Repic らによる最近の論文です。 1 1。 </li></ol></li><li> PBMC層を採取した後、血清のすべてを削除し、リンパ球分離液のほとんどが、これは、好中球のほとんどが含まれていますよう赤ペレットの上に小さな白いバンドを削除しないように注意してください。 <ol><li> NH 4 Cl を 83gの滅菌水1LにKHCO 3 10gを添加することによって、10倍の低張溶解緩衝液ストックを調製します。 4℃で保存C. </li><li>滅菌水で、この株式の10倍に希釈し、チューブに追加します。その後、慎重に3回を反転し、15分間氷上でインキュベートします。 </li><li>氷上で10分間低張溶解緩衝液中で10分間再懸濁のために394×gで遠心分離。 </li><li> 394×gで遠心分離し、冷たいPBSで2回洗浄します。ドナー当たりのCO 2独立培地1mLに再懸濁。 </li><li> PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>フローサイトメトリーのために、6×10 5 / mLの濃度に調整し、24ウェルプレートに400μLの細胞懸濁液を加えます。顕微鏡観察のために、35mmのガラスベースのイメージング皿に同一の細胞懸濁液200μLを加えます。 好中球イメージングのか、刺激されていない放置すればアポトーシスを受けるようにそれらの傾向に即座に開始すべきであるフローサイトメトリー：注意してください。これがない場合には可能性好中球が上に保持されなければなりません（同じ日以内に）できるだけ早く氷と使用。 </li></ol></li></ol> 4.フローサイトメトリー<ol><li> 24ウェルプレート中の細胞に1.2×10 6 / mLのFLARE分生子の200μLを追加し、20μgの/ mLのボリコナゾールの100μLを加えます。 RPMIの300μLを添加し、5％CO 2で37℃で16時間インキュベートします。 注：ボリコナゾールは、分生子発芽を防止するために添加されます。 </li><li> 25μMの最終濃度のために、各ウェルに1 mMのカルコフロアホワイト原液25μLを添加し、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 10分間582×gで遠心します。上清を除去し、PBSで2回洗浄します。 </li><li>付着細胞（単球）を採取するために、各ウェルに3 mMのEDTAを含むPBS 1 mLを加え、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を洗浄し、チューブ内の細胞を収集します。 </li><li> PBにFACSバッファーで1回洗浄（2％ウシ胎児血清S）、その後、FACS分析のためにFACSバッファーに再懸濁します。 <ol><li> FACS分析のために、第一のフローサイトメーターの補償パラメータを調整しない色の分生子を含む単一色補償管を使用して正のゲート、設定：のDsRed +の分生子、AF633 +分生子、及びカルコフロアホワイト+分生子（4.2のように生成します）。 </li><li>色のない分生子を使用して自由に前方に基づいて、分生子ゲートおよび側方散乱を設定します。無料の分生子ゲートを除くことにより、前方および側方散乱にセルのゲートを設定します。 </li><li>万回のイベントを記録することにより、サンプルチューブを分析します。 注：ライブの分生子に関連した細胞は、+のDsRedとAF633 +されます。死んだ分生子に関連した細胞は、唯一のAF633 +となります。分生子を従事していないバイスタンダー細胞はdsRed-とAF633-になります。分生子合さ細胞集団は、さらに、パシフィックブルーチャネルでカルコフロアホワイト染色について分析します。内在化されていカルコフロアホワイト+になり、細胞の外に残っている分生子、分生子は次のようになりますカルコフロア白 - 。 </li></ol></li></ol> 5.ライブセルビデオ顕微鏡注：顕微鏡の選択は局所的に利用可能なものに依存するが、顕微鏡の設定は反転ステージ、37°C​​とのDsRed（561分の532 nm）をAF633に適切な励起/発光フィルターに加熱し、環境チャンバを含める必要があります（633nmで）。 FLARE分生子はDsRedのための561分の532 nmのレーザーの代わりに488nmのレーザーでは動作しません。この最初に、この実験を行う際に、バックグラウンド蛍光について試験し、ブリードスルーのDsRedとAF633チャネルとの間には、no色および単色で制御分生子を使用します。 <ol><li>実験前に、顕微鏡ヒーターの電源をオンにし、環境制御室のための十分な時間が37°Cまで昇温することができます。安定化させるために、チャンバ温度に要する時間が異なる顕微鏡セットアップのために変化するであろう。 </li><li>顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、LO広告イメージングソフトウェア。顕微鏡ステージ上の撮像皿をマウントし、ヒト好中球または単球を見つけるために焦点を合わせます。 </li><li> DsRedとAF633ため、取得設定で1秒に10％と露光時間にレーザパワーを設定します。 </li><li>撮像スライドを削除し、適切なウェル（総容量300μL/ウェル）に3×10 6 / mLのFLARE分生子懸濁液100μLを加えます。分生子は皿に添加されているFLARE時間を記録します。 </li><li>ステージにスライドを戻し、明確に分生子を参照してくださいが、イメージを露出オーバーしないようにのDsRedとAF633用カメラの感度を調整します。マルチポイント取得が必要な場合は、ステージポイントのリストを設定します。 </li><li>全ての点が焦点にあるとき、チャネルが最適化され、サイクル時間および持続時間が設定された撮像開始。サイクルタイムとイメージングの期間は、実験的な質問に依存します。目標は1分UPTの深さの分析を可能にするとともに、できるだけ短いサイクルタイム（≤2分）維持することですダイナミクスAKE。 </li></ol>

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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

この方法は、蛍光レポーターアスペルギルス （FLARE）分生子、生細胞イメージングを用いてA.フミガーツスに対するヒト初代食細胞の抗真菌活性を研究し、フローサイトメトリーにインビトロ方法で革新的に記載されています。以前の研究では、マウスの実験的真菌感染のin vivoでの抗真菌と耐性6、7の試験管評価の両方で FLAREの分生子を使用しての付加価値を実証しています。この次世代生細胞イメージング技術とFLAREの分生子を組み合わせることにより、in vitroでの動的な相互作用の間に、個々の分生子の生存率を測定するためのセットアップを可能にします。 記載されている方法は、その抗真菌応答に免疫細胞の特定の細胞プロセスの特定の役割と重要性を調査する可能性を秘めています。また、特定の患者の食細胞の抗真菌応答が苦しんでいます彼らの免疫系において定義された単一成分の欠陥は、より詳細に評価することができます。非常に早いと初期の抗真菌応答連続撮影の6時間かけて非常に詳細に研究することができます。これは、そのような真菌に向かって食細胞の遊走の速度として検出することも微妙な差異を可能に内在化速度、従来の食作用の方法を使用して区別できないであろう殺菌イベント12、のダイナミクス。 任意の細胞型がこの方法で使用することができます。これらの食細胞がA.フミガーツス 13に対するヒト気道における防御の1行目と2行目を構成するためにここで使用される細胞型を選択しました。興味深いことに、非常に明確な違いは、単球及び好中球が休息や腫れ分生子と菌糸と係合する方法との間で観察することができます。好中球がはるかに移動活性を示す一方、単球はほとんど、分生子に移行しません。追加の蛍光傷そのような免疫細胞の生死マーカーとしてKERSはアスペルギルスとの相互作用以下の食細胞の生存への洞察を提供するために、アッセイに含めることができます。この技術のための興味深い潜在的な将来のアプリケーションは、異なる宿主細胞種の共培養、抗真菌応答の結果を（ 例えば 、上皮単層、一緒に好中球と単球由来樹状細胞のマクロファージ）、および反応性のリアルタイム測定アスペルギルスによる刺激後の酸素種の生成や好中球細胞外トラップ形成。 反転ステージと顕微鏡、37℃で安定した環境室、及びDsRedの（561分の532 nm）をAF633（の励起/発光フィルター：いくつかのポイントは、まず、このプロトコルを使用するように注意する必要が実験室の設定を必要とします633 nm）を。 M中の焦点で細胞を維持し、油浸を保持する顕微鏡の能力（特に関連ultiポイント取得）による撮像の長い持続時間に定期的に監視しなければなりません。殺真菌活性の定量化のための設備が必要とされているフローサイトメトリー。また、適切な制度的、倫理的な承認は、血液サンプルおよび遺伝子操作菌類派生健康なドナーと患者と仕事をする場所にする必要があります。強く、細胞の生存率を高め、機能を維持するために、新鮮な血液サンプル（同じ日に使用）を使用することをお勧めします。理想的には、細胞の単離は、血液サンプルを描画した後、直ちに実行され、好中球が分離した直後に画像化されます。 結論として、A.フミガーツスに対する非常に詳細食細胞の抗真菌活性を評価するための次世代生細胞イメージング技術が記載されています。この技術は、アスペルギルスに対する初期の自然免疫防御における個々の細胞、真菌の相互作用にユニークな洞察を提供することができます。

アスペルギルス・フミガーツスは、日和見真菌病原体と免疫不全宿主1、2における侵襲性肺感染症の最も一般的な真菌の原因です。宿主免疫細胞が認識し、 アスペルギルス真菌研究の重要な分野である排除する方法を理解する、しかし、現在入手可能な殺真菌のアッセイは、重大な制限があります。殺菌活性を測定する一般的に使用される方法は、比色アッセイおよびコロニー形成ユニット3、4の決意を含みます。しかしながら、そのような方法は、単一の時点ではなく、宿主と病原体との間の動的相互作用を見るよりも、真菌の生存率に関する情報を提供します。したがって、これらの方法は、菌が殺されたり、単純に（一時的に）成長や代謝活性に制限されているかどうかを考慮に入れることができません。私たちは、fungiciを観察することができる方法を開発しました同時に食作用、食細胞の遊走および真菌の成長の阻害に関する詳細な情報を取得しながら、直接のdal活動。 以前に、プロトコルは、マウスマクロファージ細胞株5によってカンジダ・アルビカンスの食作用を測定する手段としてのリアルタイムイメージングを使用して公開しました。この概念は今、蛍光アスペルギルス・レポーター（FLARE）分生子6、7、8を利用した免疫細胞とアスペルギルス相互作用の我々の理解における知識のギャップに対処するために、さらに開発されました。これらの分生子は赤色のフルオロフォア（のDsRed）を発現し、第二のフルオロフォア（アレクサフルオロ633）で標識されています。 FLAREの分生子が殺されたら、それはDsRedの生産を停止し、AF633は、分生子の蛍光と結合したままながら、残りのDsRedは、フェード。これは、ライブと死ん府の間に明確な区別を作成し、ライブセルイメージング中のNGAL細胞およびフローサイトメトリー、および免疫細胞との相互作用次の個々の分生子の運命の追跡を可能にします。 記載されたアッセイは、宿主の免疫細胞およびAspergillusの間の相互作用を可視化する効果的な方法を提供し、自然免疫細胞における抗真菌エフェクター機構を担当する細胞シグナル伝達経路を解明においてかなりの価値があるだろう。他のアプリケーションは、このような腫れ分生子に休息からスイッチとしてアスペルギルス成長にどのように変化し、可視化する、または腫れ分生子からの菌糸に、食細胞認識や機能に影響を与えています。 以下のプロトコルは、ヒト単球および好中球を取得する方法を詳細に説明します。どのようにFLAREの分生子を準備します。そしてどのようにビデオ顕微鏡とフローサイトメトリーでそれらの応答をキャプチャします。ドナーの血液から単離されたヒトの免疫細胞の使用は、ここで説明されているが、このこの技術は、マウスの細胞集団のさまざまな方法を使っても同様に効果的であることが分かりました。

<table><tbody><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>T75 フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 175</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.greinerbioone.com/ PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/ Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>10592955</td><td>https://nl.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>40 &micro;m フィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363547</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 261 http://www.greinerbioone.com/</td><td></td></tr> <tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.greinerbioone.com/ MilliQ</td><td>Millipore</td><td>QGARD00R1</td><td>ナノピュア水も同様に機能します http://www.merckmillipore.com/</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>分子プローブ</td><td>B-6352</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-AF633</td><td>分子プローブ&nbsp;</td><td>S-21375</td><td>AF633は、これまでに試験された唯一の蛍光色素体で、ファゴソームに見えるものです。 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>EDTA血管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455036</td><td>抗凝固剤を含むどの血液チューブでも機能するはずです。 http://www.greinerbioone.com/en/start/</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>http://www3.gehealthcare.com/</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SV3008401</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/ HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>CD14 microbeads</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>他の単球単離法も使用できますが、この方法により、労働集約的ではなく、一貫した高純度の単球が得られるため、この方法を好みます。 http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>MS Columns</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>CD14 microbeads のコメントを参照してください。 http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>72400-021</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>CO2 独立した培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18045054</td><td>イメージング中にCO2交換が十分でない場合に必要 https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td></tr><tr><td>&micro;-slide 8ウェルガラス底</td><td>同上</td><td>80827</td><td>これは私たちが使用するイメージングディッシュですが、適切なサイズのガラスイメージングディッシュであれば何でも機能するはずです。http://ibidi.com/</td></tr> <tr><td>UltraVIEW VoX 3D ライブセルイメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td>L7267000</td><td>取得および分析用の揮発性ソフトウェアが含まれています。 http://www.perkinelmer.com/</td></tr> <tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma</td><td>18909</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Voriconazole</td><td>Sigma</td><td>PZ0005</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>BD LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメーターを使用。https://www.bdbiosciences.com/</td></tr></tbody></table>

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; a。フミガーツス</em

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

アスペルギルス・フミガタスが高い場合、致死率と免疫不全宿主における侵襲性感染を引き起こす真菌の日和見病原体です。 A. fumigatusのに対して免疫応答を調査研究は、in vitroで特異的免疫細胞の抗真菌活性を測定するための一貫性と信頼性アッセイの欠如によって制限されています。新しい方法は、蛍光レポーターアスペルギルス （FLARE）分生子を用いてA.フミガーツスに対するヒトのドナーから初代単球および好中球の抗真菌活性を評価するために記載されています。これらの分生子は、構成ライブFLARE分生子で表され、外部従って生死A.フミガーツス分生子の区別を可能にする、ファゴリソソーム内分解に耐性であるアレクサフルオロ633で標識された遺伝的にコードされたDsRedレポーターを含みます。ビデオ顕微鏡およびフローサイトメトリーは、その後、相互作用を可視化するために使用されています分生子と自然免疫細胞間のイオンは、また、食細胞の遊走、貪食および真菌の成長の阻害に豊富な情報を提供しながら、殺真菌活性を評価します。この新しい技術は、すでにA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用にエキサイティングな新しい洞察を提供してきました。必要な顕微鏡を含めて、このアッセイを実施し、施設フローサイトメトリーするために必要な実験室でのセットアップ、および人間のドナーの血液や遺伝子操作菌類と仕事をする能力を注意することが重要です。しかし、このアッセイは、大量のデータを生成することが可能であり、抗真菌応答に詳細な洞察を明らかにすることができます。このプロトコルは、成功したA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用を研究するために使用されてきました。 必要な顕微鏡を含め、このアッセイを行うために必要な実験室のセットアップを、注意してくださいと、fフローサイトメトリーすることが重要ですacilities、人間のドナーの血液や遺伝子操作菌類と仕事をする能力。しかし、このアッセイは、大量のデータを生成することが可能であり、抗真菌応答に詳細な洞察を明らかにすることができます。このプロトコルは、成功したA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用を研究するために使用されてきました。

代表的な結果を説明したプロトコールに従って示されています。 図1は、ヒト好中球及びFLARE分生子を有する代表的な6時間生細胞ビデオを示します。それらはAF633（マゼンタ）で標識されていながらのDsRed（赤色）は分生子自身によって表されます。 図2は、生と死FLARE分生子の間の差を示す、 図1の表示と同様の映画からの単一時点からの画像です。デッド分生子は明るいAF633（マゼンタ）蛍光を維持しながら、それらのDsRed（赤）信号を失うことにより、ライブ分生子は区別されます。 A.フミガーツス分生子は、多くの場合、6時間にわたってための食細胞内生き残ります。したがって、効果的に死滅を定量化するために、フローサイトメトリープロットは、 図3の16時間のインキュベーション期間のために示されています。このデータは、肺胞マクロファージ、CEを用いて得られました一例として、LLラインが、任意の細胞型を用いて行うことができます。 図4に、移行は、ヒト好中球に対する刺激ならびにそれらの速度及び方向移動の最初の時間で示されています。 図5は、 図6の菌糸に発芽分生子の数を表示しながら、1、2、3またはそれ以上の分生子を摂取している好中球および単球の割合を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> 図1：ヒト好中球とFLARE分生子のライブセルビデオ顕微鏡ムービー。好中球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは​​、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。 =10μmのスケールバー。ビデオズームイン左上のDICとFLARE分生子の役割を明確にするために分離チャネルで示され、右上でのDsRed（赤色）下で、AF633（緑色）は、左と右下のマージされたビデオ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">このビデオをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> 図2：単一の時点の画像は、ライブとデッドFLAREの分生子の違いを実証しました。ヒト好中球は、FLAREの分生子で刺激し、スピニングディスク共焦点顕微鏡で画像化しました。画像が生成され、映画から取りました。そのAF633蛍光（：左下緑色）を維持しながら信号：デッド分生子は、それらのDsRed（右上赤）を失ったことにより、菌糸から区別されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">こちらをクリックしてください。</a><html>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> 図3：定量化し、食作用およびA.フミガーツス分生子の殺害の検証。ボリコナゾールの存在下で16時間：1の比率マウス肺胞マクロファージ細胞（MH-S）が1でFLARE分生子と共にインキュベートしました。生の分生子に関連付けられているMH-S細胞を赤色ゲート（のDsRed + AF633 +）に示されています。デッド分生子に関連付けられているMH-S細胞はブルーゲート（のDsRed-AF633 +）に示されています。バイスタンダーMH-S細胞は、金門に示されています。カルコフロールホワイト、真菌の細胞壁に結合する細胞不透過性蛍光色素は、細胞内の分生子（カルコフロア白 - ）から外分生子（カルコフロールホワイト+）を区別するために使用されます。方法に余分な検証として、それが2μMサイトカラシンDによる処置MH-S細胞による分生子取り込みを阻害が示されています。e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Pleaseこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> 図4：A.フミガーツス分生子に対するヒト好中球および単球の遊走。好中球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは​​、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。フィールド当たりのすべての個々のヒト好中球の移動は、手動で1時間（A）および膨潤（B）分生子を休止に対して追跡ソフトウェアを使用して追跡しました。データは、同じドナーの各条件のための細胞の1つのフレームを表します。蛇行因子（C）、DIRECTIOの尺度NAL運動、および速度（D）は 、同じソフトウェアを用いて定量しました。 3人のドナーについて平均±SEMを2つの独立した実験にわたってドナー当たり30個の細胞を用いて示されています。 *：P &lt;0.05（Welchの修正t検定）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> 図5：ヒト好中球及び単球によるA.フミガーツス分生子の貪食。好中球および単球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは​​、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。細胞の量が含まれているとして、食作用を測定しました刺激の4時間後にFLAREの分生子をする。データは、2つの独立した実験の上に3人のドナーとドナーあたり3つのフレームからの平均±SEMとして提示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> 図6： 好中球及び単球による A.フミガーツス分 生子 の発芽の阻害 。好中球および単球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは​​、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。真菌の発芽の阻害は、胚を持っていた分生子の割合を測定することにより調べました共培養の2,4および6時間後にinated。データは、2つの独立した実験の上に3人のドナーとドナーあたり3つのフレームからの平均±SEMとして提示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、生細胞ビデオ顕微鏡と一緒に蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してリアルタイムに初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性を評価し、フローサイトメトリーするプロトコルを記述します。生成されたデータは、殺菌活性、食作用、細胞遊走および真菌の成長の阻害のような宿主細胞- アスペルギルス相互作用への洞察を提供します。

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

本手順の全体的な目的は、蛍光アスペルギルス・リポーター分生子と生細胞ビデオ顕微鏡を用いて、ヒト初代免疫細胞の抗真菌活性をリアルタイムで評価することである。この手法は、特定の患者集団における真菌感染に対する免疫応答、特に真菌への曝露初期に起こる自然免疫応答に関する重要な疑問を解決するのに役立つ。本手法の主な利点は、食作用、細胞移動、殺菌、真菌増殖の抑制といった、自然免疫および抗真菌免疫における特定の欠損を特定できることである。まず、蛍光dsRedレポーター遺伝子を保持する Aspergillus fumigatus 株AF293を、2本のT75フラスコで調製した寒天培地にストリークします。培養物を37 °C、5% CO2で7日間インキュベートし、約10⁹個の分生子を得ます。インキュベーション後、培養物を0.05% Tween 80を含む20 mLのPBSに浸し、A. fumigatus 分生子を回収します。次に、40 µmのセルストレーナーを用いて、得られた懸濁液を50 mLチューブにろ過し、菌糸断片を除去します。ろ過後、懸濁液を805 ×gで10分間遠心分離します。その後、上清を捨て、ペレットを20 mLの滅菌PBSで再懸濁します。最後に、サンプルをまとめて、得られた懸濁液をもう一度遠心分離します。ペレットを5 mLのPBSで再懸濁し、得られた分生子懸濁液を1 mLずつマイクロ遠心チューブに分注します。分注したサンプルを室温、9,300 ×gで10分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、分生子のペレットをpH 8.3の0.05 M重炭酸ナトリウム1 mLで再懸濁します。分生子を標識するために、マイクロ遠心チューブにビオチンストック溶液10 µLを加え、サンプルをアルミホイルで覆い、ロッカを用いて4 °Cで2時間インキュベートします。ビオチン標識したサンプルを9,300 ×gで10分間遠心分離した後、上清を慎重に取り除きます。次に、分生子のペレットをpH 8.0の100 µM Tris-HCl溶液1 mLに再懸濁します。この懸濁液を4 °Cで1時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートし、未結合のビオチンを不活化させます。その後、サンプルを9,300 ×gで10分間遠心分離します。得られた上清を注意深く取り除き、ペレットを1 mLの滅菌PBSで洗浄し、さらに1 mLのPBSで再懸濁します。次に、分生子懸濁液1 mLにStreptavidin-AF633ストック溶液を10 µL加えます。この懸濁液をアルミホイルで遮光し、ロッカを用いて室温で40分間インキュベートします。サンプルを9,300 ×gで10分間遠心分離します。その後、上清を注意深く取り除き、分生子ペレットを1 mLのPBSで再懸濁します。血球計数計を用いて、1:1,000に希釈して分生子数を計数し、CO2独立培地を用いて分生子濃度を3.6 × 10⁶ conidia/mLに調整します。最後に、懸濁液をアルミホイルで包み、4°Cで保存します。ヒト血液サンプルを採取し、PBSで希釈します。次に、鉄製針付きシリンジを使用して、血液サンプルの下に単核細胞分離用培地15 mLを層状に加えます。サンプルを630 ×gで20分間、ブレーキなし、低加速で遠心分離します。黄色の血清と透明なリンパ球分離溶液の層の間に位置する、中央のPBMC層をパスツールピペットで回収します。その後、回収した懸濁液を新しい50 mLチューブに移します。PBMCをPBSで希釈して50 millilitersの懸濁液とし、細胞を洗浄します。洗浄後、細胞懸濁液20 microlitersにPBS 160 microlitersとトリパンブルー20 microlitersを混ぜ、血球計数計で細胞数をカウントします。カウント後、15 milliliterチューブ内で適切な濃度に希釈し、515 ×gで10分間遠心分離した後、細胞1 × 10⁷個あたり40 microlitersの緩衝液を用いて再懸濁します。1×10⁷個の細胞あたり10 µLのCD14 MicroBeadsを加え、十分に混合する。サンプルを4 °Cで15分間インキュベートし、その間5分ごとにチューブを混ぜ合わせる。結合後、1×10⁷個の細胞あたり1 mLの緩衝液で細胞を洗浄し、懸濁液を515 ×gで10分間遠心分離する。次に、最大1×10⁸個の細胞を500 µLの緩衝液に再懸濁します。メーカーの指示に従って、単一サンプルに使用するカラム1本を磁気セパレーターにセットし、500 µLの緩衝液でカラムを1回洗浄します。細胞懸濁液500 µLをカラムにロードします。乾燥後、緩衝液を用いてカラムを3回洗浄します。カラムの下に新しい15 milliliterチューブを配置し、磁気セパレーターからカラムを取り外します。次に、1 milliliterの緩衝液を用いて、カラムからチューブ内へ細胞を溶出させます。溶出した細胞を洗浄し、RPMI培地で再懸濁します。細胞密度を6×10⁵ cells/mLに調整した後、懸濁液200 µLを35 mmガラスボトムイメージングディッシュに播種します。37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。好中球を単離するには、PBMC回収後に残った血液検体から、すべての血清およびリンパ球分離溶液の大部分を除去します。赤血球ペレットの上にある薄い白い帯状の部分を除去しないように注意してください。細胞を氷上に保持したまま、次に赤血球を溶血させ、残った好中球を394 ×gで遠心分離します。その後、冷PBSで細胞を2回洗浄し、1 mLのCO2インディペンデント培地に再懸濁します。フローサイトメトリー用に、細胞密度を6×10⁵ cells/mLに調整し、細胞懸濁液400 µLを24ウェルプレートに分注します。顕微鏡観察用に、同細胞懸濁液200 µLを35 mmガラスボトムイメージングディッシュに分注します。顕微鏡観察中にdsRedおよびAlexa Fluor 633を可視化させるため、顕微鏡ヒーターを予熱し、顕微鏡とコンピュータの電源を入れます。次に、3 × 10⁶/mLのFLARE分生子懸濁液を100 µL、イメージングディッシュの適切なウェルに加えます。FLARE分生子を加えた時間を記録してください。イメージングディッシュを顕微鏡ステージに設置し、取得設定でレーザー強度を10%に、露光時間を1秒に設定します。dsRedおよびAF633の画像が、過剰露光にならずに鮮明に写るようカメラの感度を調整し、ステージポイントのリストを設定します。すべてのポイントでピントが合い、蛍光チャンネルが最適化され、サイクル時間と期間が設定された状態でイメージングを開始します。ここでは、好中球とFLARE分生子を共培養している間に撮影した画像を示します。AF633染色に対応する緑色の蛍光信号は、生存している分生子と死滅した分生子の両方で観察されます。一方、dsRed蛍光は生存している分生子のみで観察されます。したがって、検出されたすべての分生子のうち、両方の色素で同時に染色され、マゼンタ色のスポットとして見えるものだけが生存しています。マウス肺胞マクロファージ細胞と共培養したA. fumigatus分生子の食作用および殺菌能を、フローサイトメトリーを用いて定量しました。解析において、バイスタンダーマクロファージはオレンジ色のゲートで示され、死滅した分生子と結合しAF633染色のみが陽性であるマクロファージは青色のゲート内に示されています。さらに、死滅した分生子はcalcofluor white染色を示しておらず、細胞内に局在していることが示唆されます。dsRedとAF633の両方で染色された生存分生子は赤色のゲートで示されており、これらの分生子はcalcofluor white染色の減衰によって証明されるように、マクロファージ細胞内に取り込まれています。最後に、A. fumigatusがヒト好中球の遊走に及ぼす影響を評価したところ、休止状態の分生子と比較して、膨潤した分生子に対する免疫細胞の移動量および速度が増加していることが明らかになりました。習得すれば、この手法は単一の細胞集団に対して8時間で完了させることができます。この手順を行う際は、細胞を常に氷上で保持することが重要です。本手順に続き、活性酸素種の測定やサイトカイネシスの解析などの他の手法を実施することで、同一の細胞集団における自然抗真菌免疫応答に関するさらなる情報を得ることができます。本技術の開発により、真菌免疫学分野の研究者が、一次免疫細胞を用いて真菌病原体による食作用および抗真菌殺菌能を探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、蛍光アスペルギルス・レポーター分生子と生細胞ビデオ顕微鏡を用いて、ヒト初代免疫細胞の自然抗真菌免疫応答をリアルタイムで評価する方法について深く理解することができます。ヒト血液の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、感染伝播を防ぐために常に適切なPPE（個人用保護具）による予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。...

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

このビデオは、蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してヒト好中球の抗真菌活性を分析するためのライブセルイメージングを示しています。最初に、好中球内では赤色とマゼンタの両方の蛍光が検出されますが、赤色の蛍光は時間とともに減少し、分生子の劣化を示し、好中球の抗真菌活性を確認します。...

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

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真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

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共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

植物のディフェンシンは、病原体に対する植物の防衛のために重要な役割を果たします。アクション (MOA) の彼らのモードについての抗真菌剤としてこれらの抗真菌ペプチドの有効利用は重要なです。ここでは、これらのペプチドの MOA...

エントリのモードと抗真菌植物のディフェンシンの細胞内局在を検討する真菌細胞の生細胞イメージング

このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。...

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

本明細書に記載されるプロトコルは、ヒト痰中の好中球プロテアーゼの活性を可視化し定量するためのガイドを提供する。このような分析の用途は、抗炎症治療の評価から、バイオマーカーの検証、薬物スクリーニングおよび大規模なコホート臨床研究まで及ぶ。...

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。...

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。...

好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

学ぶヒト一次好中球と単球の抗カビ活動を蛍光Aspergillusコンディアとライブイメージングでリアルタイム評価する方法。食細胞作用や細胞遊走の欠陥を特定し、真菌免疫応答を解明する。

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング

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