BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析
2017年3月12日
出芽酵母における鎖特異的転写ランオン(TRO)アプローチによるBrUTPを用いたin vivoでのRNAポリメラーゼIIによる転写の終結解析のための基本的な実験的アプローチについて説明します。このプロトコールは、酵母および高等真核生物における他のRNAポリメラーゼによる転写終結を研究するために拡張することができます。
この手順の全体的な目標は、RNAポリメラーゼによる出芽酵母への転写の終了をin vivo条件下で、鎖特異的な転写アプローチによって研究することです。この方法は、遺伝子の3つのプライムエンドを超えて検出された転写活性ポリメラーゼがプロモーター領域から開始されたものであるかどうかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、転写を開始し、遺伝子の3つのプライムエンドに位置する広範に転写するポリメラーゼと、mRNA転写ポリメラーゼを区別できることです。
この技術は、異なるポリメラーゼによる終結の保存特性により、他のRNAポリメラーゼおよび酵母による転写の終結を研究するために拡張することができます。この方法は、酵母の転写サイクルにおける終結因子の正確な役割についての洞察を提供することができますが、高等真核生物の終結を研究するために拡張することもできます。一般に、この方法に不慣れな個人は、慎重な実行が必要であり、新生転写産物の精製も困難であるため、細胞の透過化と転写の停止に苦労します。
この手法のアイデアは、転写活性ポリメラーゼの位置を鎖特異的にゲノムワイドに把握できるGRO seekアプローチから最初に思いつきました。この方法は、新生転写産物の量が少なく不安定な性質のため、転写ランとRNA精製が困難であるため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。転写を開始する前に、反応上、指数関数的に増殖する酵母細胞を増殖させ、収穫し、透過処理して、透過処理された細胞パレットを得る。
反応を開始するには、透過処理した細胞パレットに150マイクロリットルの転写をバッファー上に加えます。切り捨てられたP-200チップを使用して、ピペッティングで上下に穏やかに混合します。サンプルを氷の上に置きます。
すべてのサンプルを転写液で再懸濁した後、サンプルを摂氏30度で5分間水浴でインキュベートします。各サンプルに500マイクロリットルの冷たいRNA分離試薬を追加して反応を停止します。室温で5分間インキュベートします。
各細胞懸濁液に200マイクロリットルの酸洗浄ガラスビーズを加え、ボルテックスミキサーで摂氏4度で20分間激しく振とうすることにより、RNA抽出手順を開始します。20分後、熱い22ゲージの針を使用して各微量遠心チューブの底に穴を開け、15ミリリットルの滅菌円錐形チューブの上部にチューブを置きます。Gの300倍で摂氏4度で1分間遠心分離し、細胞溶解液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
500マイクロリットルのコールドRNA単離試薬と200マイクロリットルのクロロホルムを細胞溶解液に加えます。ボルテックスミキサーで内容物を混合し、Gの16倍である16倍で摂氏4度で20分間遠心分離します。上部水相を新しい微量遠心チューブに移します。
等量の冷たいフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加えます。ボルテックスミキサーで激しく振とうし、次いでGの16倍、168倍で摂氏4度で15分間遠心分離する。RNAを含む上部水相を新しい微量遠心チューブに移します。
等量の冷たいフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加え、ボルテックスして再度遠心分離します。水相を含む最終RNAに、5モルの塩化ナトリウムストックを適量加えて、最終濃度0.3モルを得ます。3倍の量の冷たいエタノールを加えて、RNAを沈殿させます。
摂氏20度で1時間または一晩インキュベートします。RNAの沈殿が完了したら、Gの16倍である16倍で4°Cで20分間遠心分離します。上清を取り除き、RNAパレットを100マイクロリットルのDEPC水に再懸濁します。
RNA単離キットを使用して、取り込まれていないブロモウリジン三リン酸ヌクレオチドからRNAを分離し、100マイクロリットルのRNAseフリー水でカラムからRNAを溶出します。RNAを摂氏65度の水浴中で5分間インキュベートします。そして、少なくとも2分間氷に移します。
この手順は、RNAが沈殿している間に抗ブロモDUビーズを調製することから開始します。各サンプルについて、500マイクロリットルの0.25 X生理食塩水EDTA結合バッファーを25マイクロリットルの沈殿ビーズに加えます。Gの200倍で摂氏4度で30秒間遠心分離し、上清を取り除きます。
ビーズを結合バッファーで3回洗浄します。3回目の洗浄から上清を取り除いた後、ビーズに500マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、プラットフォームシェーカーで摂氏4度で1〜2時間穏やかに振とうします。ビーズを500マイクロリットルの結合緩衝液でさらに2回洗浄します。
2回目の洗浄液から上清を取り除き、ビーズに400マイクロリットルの結合緩衝液を加えます。100マイクロリットルのRNAを直接ビーズに移します。プラットフォームシェーカーで摂氏4度で1〜2時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
Gの200倍で4°Cで30秒間回転させた後、上澄み液を取り除きます。次に、ビーズに500マイクロリットルの結合バッファーを追加します。Gの200倍で4°Cで30秒間回転させ、上澄み液を取り除きます。
このようにして、ビーズを結合バッファー、低塩バッファー、高塩バッファーで順次洗浄し、TETバッファーで2回洗浄します。ビーズから標識されたRNAをブロモウリジン三リン酸溶出するには、150マイクロリットルの溶出バッファーを添加し、水浴中で摂氏42度で4分間インキュベートします。少しスピンダウンして、上清を回収します。
このように、150マイクロリットルで2回、200マイクロリットルの溶出緩衝液で1回、順次溶出します。各サンプルから約500マイクロリットルのアフィニティー精製ブロモウリジン標識三リン酸RNAを取得する必要があります。アフィニティー精製ブロモウリジン標識RNAを沈殿させるには、各サンプルに500マイクロリットルの冷たいフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加えます。
渦を巻き込み、摂氏4度で168倍Gを15分間遠心分離します。上部水相を新しい微量遠心チューブに移します。5モルの塩化ナトリウムストックの適切な容量を追加して、0.3モルの最終濃度を取得します。
次に、3倍の量の冷たいエタノールを追加します。摂氏20度で一晩インキュベートし、RNAを沈殿させます。翌日、沈殿したRNAを16、16倍Gで4°Cで30分間遠心分離して回収します。
上澄みを取り除き、パレットを10分間風乾させます。RNAパレットを26マイクロリットルのDEPC水に再懸濁します。分光光度計を使用して260ナノメートルの吸光度を測定することにより、最終的なRNA濃度を決定します。
RNAサンプルとアリコートは、cDNA合成に必要になるまで摂氏80度で保存します。アプローチで実行したブロモウリジン三リン酸鎖特異的転写を使用して、出芽酵母におけるASC1遺伝子の転写の終結に対するRNA 14の要件をテストしました。RNA 14-1変異体およびその同遺伝子野生型細胞由来のブロモウリジン三リン酸標識RNAを精製し、プライマーC、D、E、F、およびGで逆転写した。対応するcDNAをプライマーペアBとC、BとD、BとE、BとF、およびBとGを使用してPCR増幅し、アガロースゲル上で分画した。
変異体におけるプライマーペアBとE、BとF、およびBとGからのPCR増幅産物の存在は、終了リードスルー表現型を反映しています。しかし、野生型細胞では、シグナル上での転写の実行はターミネーター要素まで制限されており、ターミネーター領域を超えたシグナルでの転写の実行は検出されませんでした。このグラフは、5つのS RNAをノーマライゼーションコントロールとして使用したゲルの定量を示しています。
プロモーターが開始した新生転写産物の検出は、変異体では終結シグナルを読み取るが、野生型細胞では読み取らないことから、RNA 14が終結因子であることが確認されました。一度習得すれば、このテクニックは3日で完了します。この手順を試みる際には、反応に対する転写の実行が成功した結果を得るために重要であることを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、終了における因子のゲノムワイドな役割などの追加の質問に答えるために、GROシークなどの他の方法を実行できます。この技術の開発後、転写の分野の研究者が酵母や高等真核生物系における他のRNAポリメラーゼによる終結を探求する道を開きました。このビデオを見れば、転写の実行方法、反応の実行方法、および新生標識転写産物の精製方法について十分に理解できるはずです。
RNAは非常に不安定である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋を着用する、摂氏4度前後の温度を保つ、RNAseフリーエージェントを使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、BrUTPとストランド特異的転写継続（TRO）アプローチを用いて出芽酵母でRNAポリメラーゼIIによる転写終結をin vivoで分析する方法について説明します。このプロトコルは、酵母および高次の真核生物の他のRNAポリメラーゼによる転写終結を研究するためにも適応できます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 転写制御
- RNAポリメラーゼ活性
- 酵母分子生物学
背景
- 転写終結は遺伝子発現において重要なプロセスです。
- ストランド特異的転写継続アプローチにより、転写ダイナミクスの分析が可能になります。
- この方法により、様々なタイプのRNAポリメラーゼを区別できます。
- 終結因子を理解することは、酵母における転写サイクルを解明する上で不可欠です。
研究目的
- in vivoでのRNAポリメラーゼIIによる転写終結を調査すること。
- 転写活性のあるポリメラーゼがプロモーター領域から開始されるかどうかを決定すること。
- 異なる生物における他のRNAポリメラーゼにもこの知見を拡張すること。
使用方法
- ストランド特異的転写継続（TRO）アプローチ。
- 新生RNA転写物のラベリングにBrUTPを使用。
- 効果的な転写分析のための細胞透過化技術。
- 新生転写物の精製方法。
主要な結果
- この方法は、mRNAを転写するポリメラーゼと広汎に転写するポリメラーゼを正常に区別します。
- 転写サイクルにおける終結因子の役割に関する洞察が得られました。
- このアプローチは高次の真核生物での使用にも適応可能です。
- 細胞透過化などの実行における課題が新しいユーザーにとって特定されました。
結論
- ストランド特異的TROアプローチは、転写終結を研究するのに効果的です。
- 転写終結を理解することで、遺伝子制御に関する洞察が得られます。
- この方法は異なる種にわたって幅広く適用可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
