Name: SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学ぶSPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像の単一粒子解析手法。高分解能のタンパク質立体構造決定に向けた半自動化データ処理プロトコルと自動検証メカニズムを解説し、複雑なマクロ分子複合体の構造と機能理解に貢献する。

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私たちはTcdA1顕微鏡写真を提供してくれたD. Rodererに感謝します。 EMAN2インフラストラクチャの継続的なサポートに感謝します。この作業は、Max Planck Society（SR）と欧州連合（EU）の第七フレームワークプログラム（FP7 / 2007-2013）（付与番号615984）（SRへ）からの資金と、健康R01 GM60635からPAPへ）。

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

単粒子低温EMは、近年急速な発展を示し、主要な生物学的意義25の高分子複合体の多数の原子分解構造を送達した25 。現在フィールドに入っている多数の初心者ユーザをサポートするために、我々は単粒子画像解析プラットフォームSPHIREを開発し 、ムービーアライメント、パーティクルピッキング、CTF推定、初期モデル計算、2Dおよび3D異質性解析、高解像度3D精緻化および局所分解能推定およびフィルタリングを含む。 本明細書に記載されたプロトコールは、目的のタンパク質の低温EM顕微鏡写真を用いた3D構造決定、およびSPHIREの独立型GUIによって提供される計算ツールの助けを借りて、3D構造決定の短いガイドとして意図されている。 ワークフローの主な特徴は、再現性による検証の概念に依拠しており、パラメータ調整を必要としないため、手順のうちの1回だけを実行する必要があります。この自動検証メカニズムは、他のソフトウェアパッケージと比較してSPHIREの主な利点です。結果は客観的で再現性があり、最も重要なのは受け入れ可能な計算コストで得られる傾向があるからです。パイプラインは、経験豊富なユーザーが独自の方法でさらに独立した検証と評価を行うための豊富な診断情報を提供します。それにもかかわらず、構造生物学および電子顕微鏡法において少なくとも基本的な理論的背景を有する初心者ユーザは、それ自身のデータおよび自動化された検証手順を用いて原子に近い分解能構造を得ることができるはずである。 しかしながら、原子に近い分解能構造を得ることは、必ずしも直接的なものではなく、その結果は、サンプルの品質および入力データに大きく依存するa。ここに提示されている手順では、十分な数の高品質のアライメントされていない生のEMムービーが利用可能であり、それらの平均が明確に識別可能な均質で無作為に配向された単一粒子を示すと仮定する。一般に、分子の対称性、サイズまたは全体的な形状に関する制限はないが、特にタンパク質が特徴のない球状を有する場合、低分子量が制限因子であり得る。通常、高い点群対称性を有する、より大きく、規則正しい粒子の分析は、それほど厳しいものではありません。したがって、初心者ユーザは、まず特性の良い低温EMデータセットで本プロトコルを実行することを強くお勧めします。 SPHIREチュートリアルデータ（http：/sphire.mpg.de）またはEMPIARサブミットデータセット（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）のいずれかをRawムービーと一緒に使用することをお勧めします。 独自のデータを処理する場合、一部のデータセットまたは一部の画像が特定の品質を満たさない可能性が非常に高い基準。この文脈では、ワークフローの主要なステップのためにプログラムによって実行される自動化された安定性および再現性チェックに加えて、ユーザがプロトコルの特定の「チェックポイント」で結果を視覚的に検査することは依然として推奨されており、満足できるものではない。 最初の目視検査は、映画整列（ プロトコルステップ2 ）およびCTF推定（ プロトコルステップ3 ）後の顕微鏡写真レベルで行うことができる。得られたモーション補正された平均値は、はっきりと識別され、よく分離された単一粒子を示すはずであり、そのパワースペクトルははっきりと識別可能な等方性のトーンリングを示すべきである。それらが可視である空間周波数は、ほとんどの場合、構造が原則的に最終的に決定されることができる最高解像度を規定する。十分な品質とそのパワースペクトルの動き補正された平均の例は、セクション＃最終的な結果に悪影響を与える可能性のある異常画像は、SPHIREのDriftおよびCTFアセスメントGUIツール（http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php）の助けを借りて除去することができます。 パーティクルスクリーニングに関して、SPHIREパイプラインの重要なステップは、ISAC（ プロトコルステップ5.2）を使用した2D分類です。ここで、ユーザは、プログラムによって自動的に識別された再現可能な2Dクラス平均が、角度空間を準平準にカバーするのに十分な方向の範囲を採用するように制御すべきである。クラス平均の品質が満足できるものではない場合（ノイズの多い画像やぼやけた画像）、再現可能なクラス平均の数が非常に少ない場合は、自動ピッキング品質の改善、データセットのイメージングまたはサンプルの作成の最適化を検討してください。ほとんどの場合、良好な2Dクラス平均が得られないデータセットから信頼性の高い再構成を計算することはできません。高品質2Dクラスの例怒りは「代表的な結果」のセクションに示されています。 自動化された方法でRVIPERを使用して信頼性の高い初期3Dモデルを得るには、少なくとも100のクラス平均が必要です（ プロトコルステップ6.1 ）。このステップでは、ユーザは、最高品質の平均を選択し、可能な限り多くの異なる方向の粒子を含むべきである。初期モデルの品質は、その後の高解像度3D精緻化の成功のために重要である。 他のソフトウェアパッケージでは、「悪い」粒子8,9を除去するために3D分類が行われることがあります。しかし、SPHIREでは、ISACを使用して2次元分類を行う際に、これらの粒子のほとんどが自動的に削除されます。したがって、再構成および3D変動分析がデータセットの異質性を示す場合にのみ、3Dソーティングの計算集約的なステップを実行することが推奨されます。 最も重要なことは、ユーザーは常に、得られた3Dボリュームを注意深く注意深く検査し（ プロトコルステップ9.3 ）、それぞれの密度の特徴が公称解像度とよく一致することを確認する必要があります。 &lt;9Åの分解能では、α-ヘリックスに対応する棒状の密度が見えるようになる。 4.5Å未満の分解能では、βシート中の鎖に対応する密度は、通常、十分に分離され、かさばったアミノ酸が見えるようになる。高分解能マップ（&lt;3Å）では、明確な識別可能な側鎖が示され、正確な原子モデルの構築が可能になります。 今日までに得られた結果は、SPHIREの自動再現性試験および最小限の視覚検査の助けを借りて、現在のプロトコールが一般にあらゆるタイプの単一粒子クライオEMプロジェクトに適用可能であることを実証している。各処理工程の代表的な結果は、TcdA1毒素の再構築のために示されているPhotorhabdus luminescens 21であり 、これはほぼ原子分解能に解決されている。同様の品質の密度マップを使用して、デボリューションバックボーントレースと逆数または実空間のリファインメントによる信頼性の高い原子モデルを構築することができ、複雑な分子メカニズムを理解するための強固な構造フレームワークを提供します。 ACCESION CODES： EM構造および未処理の映画のための座標は、それぞれ、受託番号EMD-3645およびEMPIAR-10089で、電子顕微鏡データバンクおよび電子顕微鏡画像ファイルアーカイブに寄託されている。

直接電子検出器技術の開発後、単粒子低温EMの顕著な進歩は現在、構造生物学を改造している1 。 X線結晶学と比較して、この技術は結晶化を必要とせずに少量のタンパク質材料しか必要とせず、同時に試料の純度に関する制約が少なく、しかも原子分解能近くの構造の決定を可能にする。重要なことに、異なる組成物または状態をコンピュータで分離することができ、異なる立体配座の構造決定を前例のない詳細レベルで行うことができる。最近、デノボモデルの構築を可能にする解像度で、挑戦する分子の密度マップを生成することができ、従って、それらの作用様式の深い理解2,3,4,5。 3DEM（3D Electron Microscopy）コミュニティ（https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy）で幅広い種類の画像処理ソフトウェアパッケージが利用可能であり、そのほとんどは継続的に開発されています。 EMAN2 6 、IMAGIC 7 、FREALIGN 8 、RELION 9 、SPIDER 10 、およびSPARX 11を含むいくつかの異なるソフトウェアパッケージを用いて、様々な分子量および対称性を示すタンパク質について、ほぼ原子分解能が達成されている。各パッケージは、異なるレベルのユーザー専門知識を必要とし、異なるレベルのユーザーガイダンス、自動化および拡張性を提供します。さらに、いくつかのプログラムは、画像解析のすべてのステップを容易にするための完全な環境を提供する一方、他のプログラムは、既知のrから始まるアラインメントパラメータの改良など、特定のタスクを最適化するように設計されている推論構造。より最近では、APPION 12およびSCIPION 13を含むいくつかのプラットフォームが開発されており、上で列挙した様々なソフトウェアパッケージからのアプローチおよびプロトコルを統合する単一処理パイプラインを提供している。 低温EMの現在の発展に貢献するために、SPARXはSPHIRE（高分解能電子顕微鏡用SPARX）と呼ばれる単粒子分析のための新しいスタンドアロンで完全なプラットフォームに再開発されました。現場の新しい研究者のための技術のアクセシビリティを高め、現代の全自動ハイエンド電子顕微鏡によって生成された大量のデータに対処するために、処理パイプラインは使い易いグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）を使用して、ワークフローの主要なステップを自動化します。さらに、crからの迅速かつ再現可能かつ自動化された構造決定を可能にするための新しいアルゴリズムが追加されましたyo-EM画像。さらに、再現性による検証は、洗練および異質性分析中に生成される共通のアーチファクトを回避するために導入された。 このプログラムは大幅に変更されていますが、簡単なオープンソースコード、最新のオブジェクト指向設計、すべての基本機能のためのPythonインターフェイスなど、その重要な機能が維持されています。したがって、ブラックボックスプログラムに変更されていないため、ユーザーはPythonコードを学習して簡単に修正したり、追加のアプリケーションを作成したり、全体的なワークフローを変更したりすることができます。これは、非標準Cryo-EMプロジェクトに特に便利です。 ここでは、SPHIREのGUIを使用して低温EM画像から原子に近い解像度の密度マップを得るためのプロトコルを示します。生の低温EM直接検出器の映画から密度マップを生成するために必要とされるすべてのステップを詳細に記述しており、特定の巨大分子タイプに限定されるものではない。このプロトコルは、主にnewc現場でワークフローを説明し、処理の重要なステップと可能性のある落とし穴や障害に関する重要な情報を提供します。より高度な機能と、SPHIREの背後にある理論的背景については、他の箇所で説明します。

<table><tbody><tr><td>SPHIRE</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&nbsp; and Houston Medical School, Houston, Texas&nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF キメラ</td><td>カリフォルニア大学サンフランシスコ</td><td></td>校 <td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Unblur</td><td>Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology,&nbsp;ケンブリッジ</td><td></td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>EMAN2</td><td>ベイラー医科大学、ヒューストン</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>コンピューティング クラスター 1824 コア</td><td>マックス プランク分子生理学</td><td></td>研究所 <td>Linux クラスター 76&nbsp; ノード、それぞれ 2 プロセッサ Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz および 128 Gb RAM</td></tr><tr><td>TITAN KRIOS 電子顕微鏡&nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV、Cs補正、XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II直接電子検出器</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU(自動データ収集ソフトウェア)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

sphireを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE（高分解能電子顕微鏡用スパークス）は、単粒子電子冷凍顕微鏡（クライオEM）データの半自動処理のための、オープンソースで使いやすいソフトウェアスイートです。ここに提示されたプロトコルは、単一粒子構造決定パイプラインの全ステップを通してユーザを導くことにより、低温EM顕微鏡写真映画から始まる原子に近い解像度の構造を得る方法を詳細に説明している。これらの手順は、新しいSPHIREグラフィカルユーザーインターフェイスから制御され、ユーザーの操作を最小限に抑える必要があります。このプロトコールを使用して、Photorhabdus luminescensからのTc毒素複合体であるTcdA1の3.5Å構造は、9500個の単一粒子からのみ得られた。この合理化されたアプローチは、自然な状態で精製された巨大分子複合体のノイズのない、偏っていない原子モデルを得るために、広範な処理経験と先験的な構造情報なしで初心者ユーザを助けるでしょう。

<html>上記のプロトコルは、 Photorhabdus luminescens Tc複合体（TcdA1） 20,21,22の A成分の112個の直接検出器映画から開始して実行した。このデータセットは、300kVの加速電圧で動作する高輝度電界放出ガン（XFEG）を備えたCs補正電子凍結顕微鏡で記録した。画像は、標本スケールで1.14Åの画素サイズで60e - /Å -2の総線量で自動的に取得された。ムービーフレームのアライメント後（ プロトコルステップ2 ）、結果として得られたモーション補正された平均値は、等方性のトーンリングが高解像度に拡張されていました（ 図2a ）。個々の粒子は容易に目に見え、よく分離していた（ 図2b ）。次に、e2boxerの群ツールを使用してパーティクルを選んだlass = &quot;xref&quot;&gt; 18（ プロトコルステップ4.1 ）。この場合、より選択的なオプションを使用して適切な閾値を設定した（ 図2c ）。 112のデジタル顕微鏡写真は9,652個の粒子を生じた。抽出された画像の大部分（ プロトコルステップ4.2 ）は、明確に定義された粒子を含み、そのボックスサイズは、推奨されるように、粒子サイズの約1.5倍であった（ 図2d ）。次に、ISACを用いて、2D異種性分析を実施した（ プロトコールステップ5 ）。それは98のクラス平均をもたらした（ 図3a ）。これらの2Dクラス平均を用いて、中間分解能でVIPER（ プロトコルステップ6 ）を用いてab initioモデルを計算した（ 図3b ）。このモデルは、以前に3.9Åの分解能22で解決されたTcdA1の結晶構造との優れた一致を示す（ 図3c ）。このab initioモデルは、初期状態として使用された<html> （MERIDIEN）を用いて、約40,000個の非対称単位のみから3.5Å（0.143基準）再構成（ プロトコルステップ7 ）を得た（ 図4 ）。この原子に近い分解能のマップは、複数のコアの恩恵を受けるワークフローのステップで最大96個のCPUを使用して24時間以内に取得されました。 3次元変動分析（プロトコルステップ8）では、ステップ8.3.3でグループあたり2,000個の粒子画像のみが使用された（ すなわち 、プロセスは5個の初期3Dグループから開始する）。ステップ8.3.4で最小グループサイズ少数の粒子（〜10,000）。この分析は、主に、精製に使用されるHisタグを含む複合体のN末端領域で局所的な柔軟性を明らかにした（ 図5a ）。実際、TcdA1の以前に公開された結晶構造では、12個のN末端残基およびHisタグは分解されなかった受容体結合ドメインおよびBC結合​​ドメインでさらなる変動性が検出された（ 図5a ）。全体的にみて（ 図5a ）、この変動は、現在の低温EM密度において未解決のままであった。この構造の不均一性は許容可能であると判断され、したがって焦点を当てた3D分類23は行われなかった。最後に、最終濃度マップの局所分解能が計算された（ プロトコルステップ9.1、図この品質のボリュームは、Coot 24やその他のリファインメントツール（ 図6 ）を使用した新モデル構築に使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;図1：SPHIREを使用した画像処理。 （ a ）SPHIREソフトウェアパッケージのGUI。ワークフローの特定のステップは、GUIの左側（「ワークフローステップ」）のそれぞれの絵文字を選択することによってアクティブにすることができます。ワークフローのこのステップに関連するコマンドとユーティリティは、GUIの中央領域に表示されます。コマンドの1つを選択すると、それぞれのパラメータがGUIの右側の領域に表示されます。高度なパラメータは通常、プリセットされたデフォルト値の変更を必要としません。 （ b ）SPHIRE GUIを用いた単一粒子画像処理のワークフローにおける段階。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> 図2：動きの補正と部分le抽出。 （ a 、 b ）1.7μmのデフォーカスで記録された典型的な高品質、低線量、ドリフト補正されたデジタル顕微鏡写真。パワースペクトル（a）において2.7オングストロームの分解能で伸びる等方性のトーンリングと、2D画像（ b ）における十分に識別可能な粒子に注目されたい。 （ c ）e2boxerを用いた粒子の選択。緑色の円は選択された粒子を示します。 （ d ）用量加重顕微鏡写真から抽出した典型的な生の粒子。スケールバー= 20nm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> 図3：2Dクラスタリングと初期モデル生成。 （ a ）2階級クラスの平均のギャラリー、多数の側面図を表すo<html>粒子。スケールバー= 20nm。 （ b ）参照フリークラスの平均からRVIPERを用​​いて得られたTcdA1のAb initio 3Dマップ。 （ c ）TcdA1結晶構造（リボン）（pdb-id 1VW1）の最初の低温EM密度（透明灰色）への剛体適合。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> 図4：TcdA1のクライオEM 3D構造。 （ a 、 b ）約9,500個の粒子画像を用いて計算されたTcdA1の最終3.5Å密度マップ：（ a ）側面および（ b ）上面図。 （ c ）αヘリックスおよびβシートの低温EM密度の代表的な領域。arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> 図5：変動分析とローカル解決。 （ a ）鋭利なTcdA1低温EMマップの表面（灰色）および可変性マップ（緑色）。より明確にするために、可変性マップを30Åまでローパスフィルタリングした。 （ b ）TcdA1鮮鋭化低温EMマップの表面レンダリングは、局所分解能（Å）に従って着色した。高いばらつきのある領域と低い局所分解能の間のトポロジカルな一致に注意してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> 図6：3DモードCootを用いたTcdA1の構築。低温EM密度および原子モデルの代表的な領域がα-ヘリックスについて示されている。原子モデルは、Cootを使用して新しく構築されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

この手順の目的は、画像処理ソフトウェアSPHIREを用いて、電子クライオ顕微鏡データの単粒子解析により高分子複合体の構造を決定することです。単粒子クライオ電子顕微鏡法は、近原子分解能で高分子構造を研究するための主流な技術となりつつあります。SPHIREは、ユーザーフレンドリーな方法でクライオ電子顕微鏡データの半自動処理を可能にする新しいソフトウェアパッケージです。SPHIREの主な利点は、自動検証メカニズムを備えていることです。ほとんどの手順は一度だけ実行すればよく、その結果は客観的で再現性があります。高分解能クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を用いることで、個々の残基を配置することができ、これにより複雑な微小分子マシンの構造と機能に関する重要な知見が得られます。この手法を初めて行う方は、高分解能構造の取得がサンプルの品質と入力データに大きく依存することに留意してください。SPHIREアプリケーションの使用を開始するには、ターミナルからGUIを開きます。UTILITIESを開き、e2displayでクライオ電子顕微鏡画像を表示させます。組み込みの計測ツールを使用して、粒子の最長軸をÅ/pixelで測定します。プロジェクト設定を開き、CTFウィンドウサイズを、少なくとも粒子ボックスサイズ以上に設定します。粒子ボックスのサイズは、粒子径の少なくとも1.5倍の偶数に設定してください。粒子半径は、測定された長さの少なくとも半分に設定してください。点群対称性が判明している場合はそれを入力し、おおよその分子量を入力してください。設定を登録します。次に、「MOVIE」メニューから「Micrograph movie alignment」を開きます。unblurおよびsummovieの実行ファイルのパスを設定してください。未整列の生顕微鏡写真ムービーを選択し、ファイル名の変数にワイルドカードを入力して、入力顕微鏡写真のパスパターンを設定します。出力ディレクトリの名前を指定してください。ムービーのフレーム数、顕微鏡の加速電圧、および1フレームあたりの露光時間を入力します。処理を実行し、線量重み付けおよび線量非重み付けのモーション補正済み平均マイクログラフを生成します。次に、CTERメニューを開き、CTF Estimationを選択します。入力として線量非重み付けマイクログラフを設定します。出力ディレクトリの名前を指定し、データ収集パラメータを入力します。最低周波数を0285 inverse angstromsに、最高周波数を0.285 inverse angstromsに設定します。プロセスを実行して、CTFパラメータのリストを生成します。次に、WINDOWメニューを開き、Particle Pickingを選択します。線量重み付け（dose-weighted）されたマイクログラフを入力として設定し、e2boxerユーティリティを開始します。手動または自動で粒子ピッキングを行ってください。選択した粒子を画像スタックとして抽出し、それらのスタックをBDBデータベース内の単一の仮想画像スタックにまとめます。粒子の選択とスタック作成が完了したら、ISACメニューを開き、「ISAC 2D Clustering」を選択します。BDBデータベース内の仮想画像スタックを入力として設定してください。クラスあたりの画像数を推定します。残りのパラメータを入力し、2Dクラス平均を生成します。2D分類が完了したら、Display Dataユーティリティを使用して、検証済みの再現可能なクラス平均を確認してください。複数の粒子配向が表現されており、クラス平均の品質が十分であることを確認します。検証済みのクラス平均に属する粒子のみを含む、新しい仮想イメージスタックを作成します。次に、VIPERメニューを開き、「Display Data」ユーティリティを使用してクラス平均を表示します。品質が低いクラス平均または粒子の同一視点を示すクラス平均を削除します。残りのクラス平均を新しいファイルに保存してください。その後、Initial 3D Model RVIPERを選択し、少数のクラス平均の選択セットを入力として使用します。コマンドを実行し、タンパク質の初期の再現可能な3Dモデルを生成します。分子グラフィックスプログラムChimeraでモデルを確認してください。このモデルを、目的のタンパク質から得られた相同タンパク質またはドメインの既知の構造と比較します。SPHIREのVIPERメニューに戻り、「Create 3D Reference」を選択します。適切なピクセルサイズと3Dマスクを用いて、初期3Dリファレンスモデルを生成します。次にMERIDIENメニューを開き、「3D Refinement」を選択します。入力画像スタックと初期3Dリファレンスファイルのパスを入力します。出力ディレクトリに名前を付け、リファレンスモデルのマスクを3Dマスクとして設定します。「Apply hard 2D mask」を選択してください。開始解像度を20から25 angstromsの間に設定し、3Dリファインメントを実行して、フィルタリング前のハーフボリュームを作成します。次に、Chimeraでフィルタリング前のハーフボリュームを確認します。すべてのタンパク質密度が連結し、かつノイズアーティファクトが連結しないバイナリ化しきい値を決定します。SPHIREのMERIDIENメニューに戻り、Adaptive 3D Maskを開きます。フィルタリング前のハーフボリューム入力と二値化しきい値を入力してください。出力マスクに名前を付け、プロセスを実行してソフトエッジの3Dマスクを生成します。次に、「Sharpening」を開き、フィルタリングされていない両方のハーフボリュームを選択します。ソフトエッジのハーフボリューム3Dマスクを、ユーザー提供マスクとして設定します。ハーフボリュームを統合し、その後、統合されたボリュームをフィルタリングおよびシャープニング処理するプロセスを実行します。ログファイルを開き、最終的な分解能の推定値を確認します。3Dリファインメント中に作成された入力画像スタックを用いて、粒子の角度分布の3Dマップを作成します。シャープニングおよびフィルタリング処理を施した3DモデルをChimeraで開きます。密度マップとその高解像度特徴を確認します。Chimeraで角度分布を開き、オイラー角が等方的に分布していることを検証します。SORT3Dメニューを開き、3D Variability Estimationを選択します。検証済みのクラス平均に属する粒子画像の仮想スタックから、3D変動マップを生成します。この変動マップから、その後のフォーカス3Dクラスタリングに使用する二値化3Dマスクを作成します。次に、3D Clustering RSORT3Dを開き、前段階の3Dリファインメントのディレクトリを入力として選択します。出力ディレクトリ名を指定し、グローバルおよびフォーカスの3Dマスクを設定します。大規模なデータセットの場合、1グループあたり少なくとも5,000～10,000枚の画像を使用してください。ソートプロセスを実行して、各均質3Dグループのボリュームを生成します。Chimeraを使用して、見かけ上の解像度が最も高い構造を特定します。SPHIREのSORT3Dメニューに戻り、「Local Subset Refinement」を開きます。サブセットテキストファイルのパスに、最高解像度の構造に対応するパーティクルIDクラスターファイルを設定します。3Dリファインメントディレクトリに、フィルタリング前のハーフボリュームが含まれているディレクトリを指定し、リスタートイテレーションに、前回の3Dリファインメントにおける最高解像度のイテレーションを指定します。コマンドを実行して、ローカルなフィルタリング前のハーフボリュームを生成します。次に、ローカルハーフボリュームのいずれか一方から、ソフトエッジの3Dマスクを作成します。ローカルハーフボリュームをマージし、ローパスフィルターを適用せずにマージされたボリュームをシャープニングします。次に、LOCALRESメニューを開き、「Local Resolution」をクリックします。ローカルハーフボリュームを選択してください。次に、局所的なソフトエッジマスクを選択します。全体の分解能を、マージされた局所ボリュームのシャープニング時に推定した絶対分解能に設定します。ボリュームの局所分解能を算出します。次に、3D Local Filterを開きます。シャープ化されたフィルタリング前のローカルボリュームを入力として設定します。ローカル解像度マップとソフトエッジの3Dマスクを選択します。シャープニング後のボリュームに局所解像度フィルターを適用し、最終的な3Dモデルを作成します。得られたボリュームと局所解像度マップをChimeraで開きます。Surface Colorツールを起動し、メニューからボリュームを選択して、局所解像度に従って表面を色付けするオプションを選択します。トキシン複合体TcdA1をクライオ電子顕微鏡により観察した。すべての画像において、単一粒子が明確に識別でき、パワースペクトルのソンリングは4 Å以上の分解能まで伸びていた。粒子はe2boxerを用いて選択し、その後イメージスタックとして抽出した。反復的安定アライメントおよびクラスタリング（ISAC）を用いて、2次元クラス平均を生成しました。これらのクラス平均を用いて、RVIPERで再現可能な3Dモデルを算出したところ、このモデルは以前に解明されたTcdA1の結晶構造とよく一致しました。MERIDIENを用いたこのモデルの自動3Dリファインメントにより、準原子分解能のマップが得られました。3D変動解析の結果、ヒスチジンタグ付きN末端領域、受容体結合ドメイン、およびTcB結合ドメインに局所的な柔軟性が認められました。また、局所分解能の算出を行いました。シャープニング後のモデルにローカルフィルタリングを行い、局所解像度に対応するカラースケールを適用したところ、変動性の高い領域と低解像度の領域との間でトポロジー的な一致が認められた。最終的な3.5 Å解像度のTcdA1クライオ電子顕微鏡構造では、ほとんどの側鎖に明確な密度が確認された。このレベルの詳細度を持つ密度マップは、de novo原子モデル構築にさらに活用することが可能である。このアプローチを用いることで、事前の構造情報がなくても、数時間から数日のうちに原子レベルに近い分解能の構造を得ることができます。この手順を試みる際は、高品質なデータのみを使用し、中間結果を確認してください。クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）サンプルの組成および構造の不均一性が、原子レベルに近い分解能を達成するための制限要因となる可能性があります。このビデオを視聴したことで、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）による構造決定にSPHIREを利用する方法について十分に理解できたはずです。ビデオで見たように、SPHIREに含まれるクラスタリングルーチンを使用すれば、目的のタンパク質の構造を解明できるだけでなく、構造ダイナミクスを研究し、複雑な分子メカニズムに関する重要な機序的知見を得ることが可能になります。

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