SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析
2017年5月16日
本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。
この手順の全体的な目標は、画像処理ソフトウェアSPHIREを使用した電子クライオ顕微鏡データの単粒子解析により、高分子複合体の構造を決定することです。単粒子クライオ電子顕微鏡は、原子に近い分解能で高分子構造を研究するための主流の技術になりつつあります。SPHIREは、クライオ電子顕微鏡データの半自動処理をユーザーフレンドリーな方法で可能にする新しいソフトウェアパッケージです。
SPHIREの主な利点は、自動検証メカニズムです。ほとんどの手順は一度だけ実行する必要があり、結果は客観的で再現性があります。高分解能クライオ電子顕微鏡は、個々の残基の配置に使用でき、複雑な微分子マシンの組織と機能に関する重要な洞察を提供します。
この方法を初めて使用する人は、高分解能構造の取得は、サンプルと入力データの品質に大きく依存することに留意する必要があります。SPHIRE アプリケーションの使用を開始するには、ターミナルから GUI を開きます。UTILITIESを開き、e2displayでクライオ顕微鏡画像を表示します。
組み込みの測定ツールを使用して、ピクセルあたりのオングストローム単位の最長粒子軸を測定します。[Project Settings] を開きます。CTF ウィンドウ サイズを、少なくともパーティクル ボックス サイズに設定します。
パーティクルボックスのサイズを偶数、少なくともパーティクル直径の1 1/2倍に設定します。パーティクルの半径を、測定された長さの少なくとも半分に設定します。点群対称性 (わかっている場合) と近似分子量を入力します。
設定を登録します。次に、MOVIEメニューで、Micrographムービーアライメントを開きます。ぼかし解除と summovie 実行可能ファイルのパスを設定します。
未処理の未整列マイクログラフ ムービーを選択し、ファイル名変数をワイルドカードに置き換えて、入力マイクログラフ パス パターンを設定します。出力ディレクトリに名前を付けます。ムービーフレーム数、マイクロスコープ電圧、およびフレームあたりの露出を入力します。
プロセスを実行して、線量加重および非線量重み付けモーション補正平均顕微鏡写真を生成します。次に、CTER メニューを開き、CTF 推定を選択します。線量非加重顕微鏡写真を入力として設定します。
出力ディレクトリに名前を付け、データ収集パラメータを入力します。最低周波数を 0285 逆オングストロームに設定し、最高周波数を 0.285 逆オングストロームに設定します。CTF パラメーターの一覧を生成するプロセスを実行します。
次に、WINDOWメニューを開き、Particle Pickingを選択します。線量加重顕微鏡写真を入力として設定し、e2boxer ユーティリティを起動します。パーティクルピッキングを手動または自動で実行します。
選択したパーティクルをイメージ スタックに抽出し、スタックを BDB データベース内の 1 つの仮想イメージ スタックに結合します。パーティクルを選択してスタックしたら、[ISAC] メニューを開き、[ISAC 2D クラスタリング] を選択します。BDB データベース内の仮想イメージ・スタックを入力として設定します。
クラスごとのイメージ数を見積もります。残りのパラメーターを入力し、2D クラスの平均を生成します。2D 分類が完了したら、[データの表示] ユーティリティを使用して、検証された再現可能なクラスの平均を表示します。
複数の粒子の向きが表され、クラス平均が満足のいく品質であることを確認します。検証されたクラス平均に属する粒子のみを含む新しい仮想イメージ スタックを生成します。次に、「VIPER」メニューを開き、「データ表示」ユーティリティを使用してクラス平均を表示します。
品質が低いクラス平均、またはパーティクルの同一のビューを示しているクラス平均を削除します。残りのクラス平均を新しいファイルに保存します。次に、[初期 3D モデル RVIPER] を選択し、少数のクラス平均を入力として使用します。
コマンドを実行して、タンパク質の初期再現可能な3Dモデルを生成します。分子グラフィックス プログラム Chimera でモデルを調べます。モデルを、相同タンパク質の既知の構造または目的のタンパク質のドメインと比較します。
SPHIRE の VIPER メニューに戻り、[3D リファレンスを作成] を選択します。正しいピクセル サイズと 3D マスクを使用して、初期 3D 参照モデルを生成します。MERIDIEN メニューを開き、[3D リファインメント] を選択します。
入力画像スタックと初期 3D 参照ファイルのパスを入力します。出力ディレクトリに名前を付け、参照モデルのマスクを 3D マスクとして設定します。「ハード 2D マスクを適用」を選択します。
開始解像度を 20 から 25 オングストロームに設定し、3D リファインメントを実行して、フィルタリングされていないハーフボリュームを生成します。次に、Chimeraでフィルタリングされていない半ボリュームで表示します。すべてのタンパク質密度が接続されているが、ノイズアーティファクトは接続されていない二値化しきい値を決定します。
SPHIREのMERIDIENメニューに戻り、Adaptive 3D Maskを開きます。フィルタリングされていないハーフボリューム入力と二値化のしきい値を入力します。出力マスクに名前を付け、ソフトエッジの 3D マスクを生成するプロセスを実行します。
次に、[Sharpening] を開き、フィルタリングされていない両方のハーフボリュームを選択します。ソフトエッジのハーフボリューム 3D マスクをユーザー指定のマスクとして設定します。ハーフボリュームをマージし、マージされたボリュームをフィルタリングしてシャープにするプロセスを実行します。
ログ ファイルを開いて、最終的な解像度の見積もりを表示します。3D リファイン中に生成された入力イメージ スタックの粒子角度分布の 3D マップを生成します。シャープ化およびフィルタリングされた3DモデルをChimeraで開きます。
密度マップとその高解像度の特徴を検査します。Chimera で角度分布を開き、オイラー角が等方的に分布していることを確認します。「SORT3D」メニューを開き、「3D Variability Estimation」を選択します。
検証されたクラス平均に属する粒子イメージの仮想スタックから 3D 変動マップを生成します。この変動マップから二値化された 3D マスクを生成し、その後のフォーカスされた 3D クラスタリングを実現します。次に、3D クラスタリング RSORT3Dを開き、前の 3D リファインメントのディレクトリを入力として選択します。
出力ディレクトリに名前を付け、グローバルおよびフォーカスされた 3D マスクを設定します。大規模なデータセットには、グループごとに少なくとも 5, 000 から 10, 000 の画像を使用します。ソーティングプロセスを実行して、各均質な3Dグループのボリュームを生成します。
Chimeraを使用して、見かけの分解能が最も高い構造を特定します。SPHIRE の SORT3D メニューに戻り、Local Subset Refinement を開きます。サブセットのテキストファイルパスを、最高解像度の構造に対応するパーティクルIDクラスタファイルに設定します。
3D リファインメント ディレクトリを、フィルタリングされていないハーフボリュームを含むディレクトリに設定し、リスタート イテレーションを前の 3D リファインメントから最高解像度のイテレーションに設定します。コマンドを実行して、ローカルのフィルタリングされていないハーフボリュームを生成します。次に、ローカルのハーフボリュームの 1 つからソフトエッジの 3D マスクを作成します。
ローカルの半分のボリュームをマージし、マージされたボリュームをローパスフィルターを適用せずにシャープにします。次に、LOCALRESメニューを開き、[Local Resolution]をクリックします。ローカルのハーフボリュームを選択します。
次に、ローカルのソフトエッジマスクを選択します。全体の解像度を、マージされたローカル ボリュームをシャープにするときに推定される絶対解像度に設定します。ボリュームのローカル解像度を計算します。
次に、3Dローカルフィルターを開きます。シャープ化されたフィルタリングされていないローカルボリュームを入力として設定します。ローカル解像度マップとソフトエッジの 3D マスクを選択します。
シャープなボリュームにローカル解像度フィルターを適用して、最終的な3Dモデルを作成します。結果のボリュームとローカル解像度のマップをChimeraで開きます。Surface Colorツールを起動し、メニューからボリュームを選択し、ローカル解像度に従ってサーフェスを色付けするオプションを選択します。
毒素複合体TcdA1をクライオ顕微鏡で画像化しました。すべての画像は、明確に識別可能な単一の粒子とトーンリングを示しており、パワースペクトルで4オングストローム以上の分解能で広がっています。パーティクルはe2boxerを使用して選択され、画像スタックに抽出されました。
2 次元クラス平均は、ISAC (Terative Stable Alignment and Clustering) によって生成されました。これらのクラス平均は、RVIPERで再現可能な3Dモデルを計算するために使用されました。このモデルは、以前に解かれたTcdA1の結晶構造とよく一致しました。
MERIDIENを使用してこのモデルを自動的に3Dリファインすると、原子に近い分解能が得られ、変動性分析map. 3Dヒスチジンタグ付きN末端領域、受容体結合ドメイン、およびTcB結合ドメインの局所的な柔軟性が示されました。ローカル解像度の計算を実行しました。
シャープ化されたモデルは局所的にフィルタリングされ、ローカル解像度に対応するカラースケールが適用され、変動性の高い領域と低解像度の領域との間のトポロジカル一致が示されました。TcdA1の最終的な3.5オングストローム分解能のクライオEM構造は、ほとんどの側鎖で明確な密度を示しました。この詳細レベルを持つ密度マップは、de novo原子モデルの構築にさらに使用できます。
このアプローチを使用すると、先験的な構造情報なしで、数時間または数日で原子分解能に近い構造を取得できます。この手順を試行するときは、高品質のデータのみを使用し、中間結果を確認してください。クライオ電子顕微鏡サンプルの組成的および構造的な不均一性は、原子に近い分解能に到達するための制限要因である可能性があります。
このビデオを見た後、クライオ電子顕微鏡の構造決定にSPHIREを使用する方法について十分に理解しているはずです。これまで見てきたように、SPHIREに含まれるクラスタリングルーチンは、目的のタンパク質の構造を解くだけでなく、コンフォメーションダイナミクスを研究し、複雑な分子メカニズムに関する重要なメカニズムの洞察を提供することを可能にします。
概要
本論文では、ソフトウェアスイートSPHIREを用いたクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像の処理プロトコルを提示します。本手法は、近原子分解能を目的とした単粒子解析EMプロジェクトに適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 構造生物学
- クライオ電子顕微鏡
- 画像処理
背景
- 単粒子クライオ電子顕微鏡法（cryo-EM）は、高分子構造を研究するための重要な技術である。
- SPHIREは、cryo-EMデータ処理に対する半自動的なアプローチを提供する。
- 本プロトコルでは、高解像度の結果を得るためのサンプル品質の重要性を強調している。
- SPHIREには、再現性のための自動検証メカニズムが組み込まれている。
研究の目的
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像の処理に関する詳細なプロトコルを提供すること。
- 高分子複合体構造の決定を容易にすること。
- 研究者がクライオ電子顕微鏡技術を利用しやすくすること。
使用方法
- 画像処理のためのSPHIREソフトウェアの活用。
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像からの手動および自動粒子ピッキング。
- 2D分類および3Dモデルの作成。
- 解像度向上のための3Dリファインメントおよびばらつき推定。
主な結果
- 高解像度のタンパク質3Dモデルの構築に成功したこと。
- クラス平均およびパーティクル配向の検証。
- 再現性のあるクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）データ処理プロトコルの確立。
- 高い見かけ上の解像度を持つ構造の特定。
結論
- SPHIREプロトコルは、cryo-EMの画像処理を大幅に効率化します。
- 信頼性の高い結果を得るためには、高品質な入力データが不可欠です。
- この手法により、複雑な高分子構造の理解が深まります。
よくある質問
産業界における重要性
クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）は、高分子複合体の近原子分解能での構造決定を可能にし、初期創薬におけるターゲットバリデーションやメカニズム的なリスク低減のための重要な知見を提供します。SPHIREは、半自動化されたワークフローと客観的なバリデーションを通じてこのプロセスを効率化し、初心者ユーザーにとっての障壁を低減させ、チーム間での再現性を向上させます。これにより、リード化合物の特定および前臨床モデル開発に向けた、構造生物学的なインプットに対する予測信頼性がサポートされます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 近原子分解能で高分子構造を解明することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： わずか9,500個の粒子から再現性のある3Dモデルを提供し、迅速なターゲット検証サイクルをサポートする。
- 予測的価値： 毒素複合体における側鎖密度とコンホメーションダイナミクスを可視化することで、メカニズム面でのリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 構造ベースのアッセイ設計に適した、検証済みのノイズのない原子モデルを生成します。
- 運用上の価値： GUI制御の半自動パイプラインを通じて、粒子のピッキングと分類を標準化します。
- 再現性： 自動検証により、ユーザーや施設を問わず客観的な結果が保証され、アッセイの標準化が可能になります。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：ドッキングおよび変異導入研究に向けた高解像度モデルを提供することで、創薬探索から前臨床段階への移行を支援します。
- メカニズムの洞察：受容体結合領域などのドメインにおける局所的な柔軟性を明らかにし、機能解析に有用な情報を提供します。
- リスクを調整した進展：開発可能性に影響を及ぼす可能性のある構造的な不均一性の評価を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
SPHIREは、化合物の設計や作用機序研究に不可欠な高解像度の構造データを提供することで、ターゲットのバリデーションからリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 探索的生物学： 3D変動解析と局所解像度マッピングにより、コンフォメーション状態を評価し、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 標準化され、用量加重されたマイクログラフとクラス平均を提供し、信頼性の高い粒子調製を実現します。
- アナリティクス： 解像度推定、角度分布、変動マップなどの定量的アウトプットを提供し、データに基づいた意思決定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 原子モデル構築に適した、シャープニングおよび局所フィルタリング済みの3Dモデルを生成することで、前臨床段階での継続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用： GUI駆動のワークフローにより、最小限の再トレーニングでプロジェクトをまたいだ再利用が可能となり、プラットフォームの標準化を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 原子レベルに近い分解能のモデルにより、標的結合研究におけるメカニズムの曖昧さが軽減されます。
- 運用上の価値： 半自動処理により、ユーザーの介入が最小限に抑えられ、スループットが向上します。
- 戦略的価値： 客観的な検証により、構造的な不確実性が低減し、GO/NO-GO判断が改善されます。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの構造モデルを持つ標的の、リスクに基づいた優先順位付けが可能になります。
実施上の考慮事項
- 構造生物学およびクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）の試料調製に関する専門知識が必要です。
- 3Dリファインメントおよび変動解析には、GPU加速ワークステーションが必要です。
- チーム間でのデータ収集パラメータ（電圧、露光量、デフォーカス）の標準化が不可欠です。
- 試料の不均一性および優先的配向によってパフォーマンスが制限されます。
- 可視化および検証には、Chimeraなどの外部ツールを利用します。
