マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性結核菌

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。

この手順の全体的な目標は、生存率色素を用いた薬剤感受性試験のために、結核菌に感染したマクロファージ凝集体構造を96ウェルプレート形式で再現性よく生成することです。この方法は、候補化合物の臨床現場への非生産的な翻訳によって妨げられる抗結核化合物の早期の医薬品開発プロセスを改善できます。このシンプルで安価なBSL 2互換感染モデルの主な利点は、結核肉芽腫を彷彿とさせる生理学的に関連する細胞浸透障壁を再現することです。

これにより、in vivo の有効性をより予測する薬剤感受性の結果が得られます。この手順は、感染のためにM.tuberculosis MC squared 6206(以下、MTBGFPと呼ぶ)を発現する緑色蛍光タンパク質を調製することから始める。これは病原性株であるため、ここで説明するプロトコルのすべての作業は、バイオセーフティレベル2の施設で実行できることに注意してください。

96ウェルプレートごとに10倍8倍から第8MTBGFPの3倍で遠心分離機をセットし、スイングバケット遠心分離機でGを200倍5分間行う。スピン後、上清を吸引し、5ミリリットルのRPMICを加えてバクテリアを洗います。ピペットで上下に動かして、セルを再懸濁します。

その後、再び遠心分離します。2回目のスピン後、上清を注ぎ出し、細菌細胞を7ミリリットルのRPMICに再懸濁し、次に10秒間ボルテックスします。次に、設置する96ウェルプレートごとに、第6のTHP1ヒト単球細胞に10倍7倍Gを250倍Gで5分間遠心分離する。

遠心分離後、上清を注ぎ出し、THP1細胞を7ミリリットルのRPMICに再懸濁します。次に、行AとH、および列1と12の井戸に200マイクロリットルの滅菌水を追加して、感染用の96ウェルプレートを準備します。このウォーターリムは、培地の蒸発を防ぎます。

2列目に200マイクロリットルのRPMICを、Bの2列からGの2列に、バックグラウンドコントロールまたはブランク用に追加します。THP1単球に感染するには、ピペットを使用して、調製したMTBGFP細菌懸濁液全体をTHP1細胞懸濁液に移し、ピペッティングで上下させて混合します。最終的なTHP1細胞密度は、1ミリリットルあたり10の5倍から5倍であり、対応する感染の重複度は40です。

次に、THP1 MTBGFP懸濁液を25ミリリットルのリザーバーに注ぎ、次にマルチチャンネルピペットを使用して、残りの96ウェル(E 3からG 11)のすべてに200マイクロリットルのTHP1 MTBGFP懸濁液を追加します。プレートを摂氏37度で5%CO2で7〜10日間インキュベートします。インキュベーション中は2日ごとに、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの上部から100マイクロリットルの使用済み培地をゆっくりと取り出し、100マイクロリットルの予熱済みRPMICを静かに追加して培地を交換します。

培地を交換するときは、ウェルの底にあるMTBマクロファージ凝集体を乱さないように注意することが重要です。毎日、4倍から10倍の対物レンズを備えた明視野およびGFPフィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を使用して、ウェルを目視検査します。MTBマクロファージ凝集体のサイズに注意し、必要に応じて画像をキャプチャします。

7日目から10日目までに、MTBマクロファージの凝集体は、ビデオの後半で説明するように、薬効試験に進むのに十分な大きさになっているはずです。薬物検査では、次のように新しい96ウェルプレートに2つの抗結核薬を三重に調製します。まず、125マイクロリットルの7H9C培地を井戸Bに2つからG10まで加えます。

次に、7H9Cの1ミリリットル中の最高所望最終濃度の2倍で2つの薬物を調製する。ピペットを使用して、各薬剤をウェルB、C、およびD 11に追加し、次にE、F、およびG 11をそれぞれ3回治療します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、B11からG11までの125マイクロリットルをB10からG10に移動させることにより、被験薬を2倍に連続希釈する。

各ステップで5回ピペッティングして混合します。プレートを横切って125マイクロリットルを列から列へ右から左に移動し続け、列4で停止します。カラム4を混合した後、125マイクロリットルを廃棄物容器に廃棄します。

2列目と3列目には薬物を入れないでください。これにより、それらを背景として使用したり、積極的な成長制御に使用したりできます。次に、MTBに感染したマクロファージを含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。

プレートを傾けずに、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルB 2からG 11から150マイクロリットルの培地を取り出します。次に、ここに示すようにプレートを傾け、ピペットの先端をウェルの下端に挿入し、残りの培地(約50マイクロリットル)を取り除きます。MTBマクロファージ凝集体は井戸の底に付着するため、材料が失われることはありません。

ただし、培地の除去はできるだけ穏やかに行う必要があり、このプロセス中に再懸濁しないように注意する必要があります。100マイクロリットルの7H9C培地を、MTBマクロファージ凝集体を含むプレートのウェルB2からG11に穏やかに加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートを含む薬物の100マイクロリットルを感染プレートの対応するウェルに移します。

次に、プレートを密封された袋に入れ、摂氏37度で3日間インキュベートします。レサズリンアッセイは、代謝活性MTBによって産生される酸化種に依存して、青色のレサズリンを蛍光ピンクのレゾルフィンに変換します。色と蛍光の変化は、細菌の増殖量を決定するための代理マーカーとして使用できます。

水中で1ミリリットルあたり8ミリグラムの最終濃度でレサズリンの原液を調製します。22マイクロメートルの細孔サイズのPVDFメンブレンでろ過し、滅菌します。レサズリンで、ストック溶液、水、Tween-80を2対1対1の比率で混合することにより、作業溶液を調製します。

最終濃度は、4ミリグラム/ミリリットルのレサズリン、および5%Tween-80です。プレートリーダーを使用して、摂氏37度で30分ごとに530ナノメートルの励起と590ナノメートルの発光で24時間蛍光を読み取るプログラムを設定します。プレートリーダーを摂氏37度に事前に温めます。

マルチチャンネルピペットを使用して、薬物処理プレートのウェルB 2からG 11に20マイクロリットルのレサズリン作業溶液を追加します。プレートをリーダーに置き、プログラムを開始します。この感染モデルを96ウェルプレートフォーマットに適合させることの堅牢性を確認するために、このビデオで説明されているように、モキシフロキサシンモキシ中のMTBリファンピシンRIFの感受性を評価しました。

ここに示すように、MTBマクロファージ凝集体構造は96ウェルプレート形式で正常に生成され、それによりスループット互換性が可能になりました。細菌増殖の指標としてのレサズリンの変換を定量的に測定するために、個々のウェルの蛍光を24時間動態的にモニターした。生存可能なMTB細胞の存在は、青色のレサズリン色素をそのピンク色の還元型に変換することによって決定され、飽和点における相対的な蛍光zネットによって定量的に反映されます。

これらの代表的なミニグラフは、結果として得られる蛍光単位をY軸に示し、X軸に示した時間に対して示しています。薬物感受性殺傷曲線を生成するために、リファンピシンとモキシフロキサシンで処理されたウェルは、薬物制御なしの最大MTB成長を100%生存率として正規化されました。バックグラウンドコントロールブランク信号は、すべてのサンプルウェルから減算されました。

生存率は、薬物治療の個々の濃度ごとにプロットされ、殺傷曲線が生成されました。これらのデータは、最小阻害濃度が、90%の成長阻害が観察される抗生物質の最低濃度が、感染モデルに由来するMTBに対するリファンピシンとモキシフロキサシンの両方について、1ミリリットルあたり2マイクログラムを超えることを定義することを示しています。そのため、私たちの感染モデルとアッセイを使用したこれら2つの薬物のMTBに対する最小の阻害濃度は、in vivoでのこれらの薬物の活性をより反映しています。

このビデオを見れば、レサズリンアッセイを使用した薬剤感受性試験のために、MTBに感染したマクロファージ凝集体構造を確実かつ再現性よく生成する方法を十分に理解できるはずです。この手順に続いて、示されているように2つの薬物から薬物テンプレートを58薬物ライブラリーパネルに変更することが容易に実行され、ハイスループット薬物スクリーニングが可能になります。