Name: マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性結核菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶマクロファージ凝集体を用いた結核菌薬剤感受性試験法。96ウェルプレート形式でGFP発現Mycobacterium tuberculosisを感染させ、レサズリンアッセイで薬効を評価する。BSL-2対応で低コストかつ高スループットスクリーニングに適した革新的なモデルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cytation 3自動イメージングプレートリーダーへのアクセスについて、Dr. Frank Wolschendorfに感謝します。この研究の一部は、NIH の助成金 R01-AI104499 to OK によって資金提供されました。作業の一部は、UAB CFARの施設と、NIH/NIAID P30 AI027767とNIH 5P30 AR048311によって資金提供されているUAB CFARフローサイトメトリーコア/ジョイントUABフローサイトメトリーコアによって行われました。

注：2 6206は、非病原性株17、18である結核菌の MCとしては、このプロトコルですべての作業は、バイオセーフティレベル2の施設（BSL-2）で行うことができます。 結核菌 MC 2を発現する緑色蛍光タンパク質1.培養条件6206（ マウンテンバイク -GFP） 注： ヒト結核菌H37RvはpMN437がこのプロトコル16全体で使用されるプラスミドを発現するGFPで形質転換された栄養要求株MC 2 6206（ΔpanCD、ΔleuCD）に由来しました。研究者のための歪みを簡単にアクセシビリティを有効にするには、野生型株を発現する非GFPでのMtb -GFP株を代用することが可能です。しかし、GFP発現は、食作用とのMtb /マクロファージの凝集体の形成の視覚的確認を可能にすることが望ましいです。経度のためのGの長期保存、Mtbの -GFPを、20％グリセロールを補充し（ステップ1.1参照）完全7H9培地中で-80℃で凍結しました。 <ol><li> 10％ミドルOADC、0.02％チロキサポール、24μgの/ mLのD-パントテン酸、を50μg/ mLのL-ロイシンおよび50μg/ mLのハイグロマイシンBで7H9培地を補充することによって、完全なマウンテンバイク -GFPメディア（7H9-C）を準備</li><li> マウンテンバイク -GFPの1つのバイアルを解凍し、30 mLの正方形の底PETGフラスコ中の7H9-Cの10 mLに追加します。 </li><li>ロータリーシェーカー（50回転）に37℃でインキュベートします。 OD 600が 1.0に達するまで（約5-8日）数日おきに光学密度測定（OD 600）を取ります。 </li><li> 0.2〜1.0の間のOD 600を維持するために必要に応じて希釈して継代培養。 </li><li>感染のために、対数増殖期（OD 0.6から1の600）内のMtb -GFPの確立された文化を使用します。塊状の文化を避けるために、水浴中のMtb培養フラスコを超音波処理（130 W; 3×5秒パルス）ONCeまたは週二回</li></ol> 2.培養条件 THP-1細胞<ol><li> 10％熱不活性化ウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、および10mM HEPESを含むRPMI 1640培地を補充することによって、完全なTHP-1細胞培地（RPMI-C）を調製します。 </li><li> 5％CO 2の加湿雰囲気中37℃でT-75フラスコ中で細胞をインキュベートします。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数をカウントしたり、一日おきにフローサイトメトリーおよび0.1 mLの100万〜0.6の間の濃度でTHP-1細胞を維持します。 </li></ol> 3.感染プロトコルのMtb /マクロファージ集計構造を生成するために、 <ol><li> THP-1細胞調製物（96ウェルプレートあたり） <ol><li> 5分間250×gで遠心分離し、7×10 6 THP-1細胞。 7 mLのRPMI-Cでの再懸濁。 </li></ol></li><li> MTB -GFP準備 <ol><li>遠心分離2.8×10 8 のMtb -GFPスイングバケット遠心分離機で3200×gで5分間のuOD 600 1.0 = 3×10 8個の細菌/ mLでの変換を歌います。 </li><li>ステップ3.2.1のようにRPMI-Cと遠心機で一回洗浄します。 </li><li> 10秒のための7 mLのRPMI-Cで再懸濁し、ボルテックス。 </li></ol></li><li> 感染 注：テンプレートについては、 図1を参照してください。 <ol><li>培地の蒸発を防ぐために、水のリムの行AとHと、列1および12に滅菌水200μLを加えることにより、96ウェルプレートを準備します。 </li><li>バックグラウンドコントロール（ブランク）用カラム2（G2へのB2）に200μLのRPMI-Cを追加します。 </li><li>感染させるために、THP-1細胞懸濁液（ステップ3.1）へのMtb -GFP懸濁液（ステップ3.2）を追加し、ピペットでよく混ぜます。最終的なTHP-1細胞密度は、mL当たり5×10 5であり、感染の対応する多重度は40です。 </li><li> 25 mLのリザーバにTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液を注ぎます。 </li><li> usin残りのすべての96ウェル（G11を通じてB3）にTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液200μLを追加GAマルチチャンネルピペット。 注：複数の96ウェルプレートで作業する場合は、定期的にさえ混合物を各ウェルに添加されていることを確認するために、リザーバ内の残りのTHP-1 / MTBサスペンションを再懸濁します。 </li><li> 7〜10日間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 </li><li>ゆっくりと100μLを除去することにより、2日おきにメディアを変更し、マルチチャンネルピペットを用いて100μLに予め温めたRPMI-Cを追加するだけでなく、静かにそれぞれの最上部からメディアを過ごしました。井戸を再懸濁し、ウェルの底にマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を邪魔しないでください。 </li><li>視覚のMtb /マクロファージの凝集体の大きさに着目し、毎日の蛍光顕微鏡（4-10X目的）によってウェルを調べます。日7-10では、 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体は、薬物の効力試験（第4節）のために進行する（参考のために図2を参照）を十分に大きくなければなりません。 </li><li>所望であれば、自動細胞イメージングシステムを用いて96ウェルのキャプチャー画像が嵌め込ま明視野およびGFPフィルターでマウンテンバイク /マクロファージ凝集体形成を文書化するために設定します。 注：ユーザーが自動化されたイメージングシステムへのアクセスを持っていない場合は、代表ウェルの画像をGFPと明視野能力を有する任意の適切な顕微鏡を用いて撮影することができます。 </li></ol></li></ol> マウンテンバイク /マクロファージ集約由来医薬品に対する効力のMtbを評価する4.成長阻害アッセイ<ol><li> 薬剤の準備（2薬剤のための三重の条件） 注：テンプレートについては、 図1Aを参照してください。 <ol><li>独立した96ウェルプレートでは、G10までB2に7H9-Cメディアの125μLを追加します。 </li><li>ステップ4.2.4での希釈を考慮するために、7H9-Cの1mLに二重最高所望の最終濃度で、二つの薬剤を準備します。 </li><li>それぞれ三連の治療のために、ウェルB11-C11-D11とE11-F11-G11に各薬剤の250μLを追加します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、連続希UTE試験薬物B10-G10にB11-G11から125μLを移動することで2倍。各ステップで5回ピペッティングすることによって混合します。 </li><li>プレートを横切って（右から左）の列に列から125μLを移動させ、カラム4の後に停止し続けます。 </li><li>カラム4を混合した後、廃棄物容器に125μLを捨てます。列2と3は、バックグラウンド（ブランク）とプラス成長コントロールなどの使用を可能にするために、任意の薬を含めることはできません。 注：また、テスト薬剤のライブラリについては、図1（b）のテンプレートに従ってください。各96ウェルプレートは、単一の濃度で58の薬物を収容することができます。また、ステップ4.2.4で半分に希釈されるので、倍の所望の最終濃度を使用して、この薬物プレートを準備します。 </li></ol></li><li> 薬物治療： <ol><li> Mtbを含む96ウェルプレートを取り出し、マクロファージ（ のMtb /マクロファージ凝集体）-infected。 </li><li>慎重にマルチチャンネルピペットを用いて、関連するすべてのウェル（G11を介してB2）をデカント。2段階の方法でこれを実行します。第一プレートを傾けることなく、150μLを削除してから、プレートを傾けるとウェルの底縁にピペットチップを挿入することにより、残りのメディア（〜50μL）を取り外します。 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体がウェルの底に付着しているように、何の材料が失われてはなりません。 </li><li>静かマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を含むプレートに関連するすべてのウェル（G11を通じてB2）に7H9-Cメディアの100μLを追加します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、感染プレートの対応するウェルに96ウェルプレート（ステップ4.1）を含む薬剤から100μLを移します。 </li><li>密封された袋に入れて、37℃で3日間インキュベートします。 </li></ol></li></ol>レサズリンマイクロタイターアッセイを使用して5薬効の定量<ol><li> H 2 O中の0.8mg / mLの最終濃度でレサズリン原液を準備し滅菌のため0.22μmの細孔径のPVDF膜を通して濾過。</li><li> 1：1の比率で2レサズリンストック溶液、H 2 OおよびTween-80（H 2 O中20％溶液）を混合して溶液を作動レサズリン準備します。最終濃度は0.4 mg / mlでのレサズリン及び5％のTween-80です。 </li><li> 37℃で24時間、530 nm励起および590 nmの発光で30分毎に蛍光を読み取るためのプログラムは、プレートリーダーを使用してセットアップ。 37°Cにプリ暖かいプレートリーダー。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて薬剤処理プレート（ステップ4.11）に関連するすべてのウェル（G11を通じてB2）にレサズリン作業溶液20μLを追加します。 </li><li>プレートリーダーでプレートを置き、ステップ5.3で設定プログラムを起動します。 注：アッセイプレートの大量の処理を容易にするために、37℃のインキュベーター中でアッセイを開発し、単一の蛍光は24時間毎に読み出し実行するのに十分です。これはまた、運動やインキュベーション機能を備えたプレートリーダーへのアクセス権を持たないユーザーにも適用可能です。 </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、詳細に薬効試験に適した代替のMtb感染モデルを説明してきました。このモデルは、アカウント初期の結核治療薬の開発プロセスの間に、より配慮を与えられるべき二つの重要な要因を考慮に入れる：薬剤浸透と感染時のMtbの代謝変化に生理学的に関連の障壁の存在。我々は以前に私たちの感染モデルの利点を示し、スループットの互換性16のために感染を拡大する可能性を提案しているが、ここでは、これは、96ウェルプレートフォーマットに直接システムを適応させることによって、実際に達成可能であることを示しています。それがピペットに対して要件が削除され、凝集体のサイズがサイズに達することができるように本質的に困難であり、個々のウェルに大きな培養フラスコから凝集体を分散としてのMtb /マクロファージを生成する能力は、96ウェルプレート中で直接凝集有利です&gt; 500ミクロン。感染したマクロファージの凝集体の大きなサイズは、それがヒントを詰まらせることになるのいずれか、または大規模なピペッティングは、凝集体をばらばらになるようスループットア...

<html>結核（TB）は、40年以上にわたって1用の抗結核化学療法レジメンの利用可能性にもかかわらず、世界的に深刻な健康への脅威のまま。これは、非準拠2を患者につながる複数の薬剤の組み合わせを使用して6ヶ月以上の長い治療期間の要件に一部起因します。近年の薬剤耐性結核の出現は、さらに臨床的に承認された医薬品の開発に成功が事実上存在しない3分野で問題を配合しました。確かに、徹底的な抗結核薬の開発にもかかわらず、唯一の単一の薬物は、FDAは、過去40年4臨床使用が承認されました。したがって、抗結核薬の新しい世代が緊急にこの問題に対処するために必要とされます。 結核治療薬の発見において重要な問題は、臨床設定における有効性へのin vitroでの活性を有する化合物からの転送成功の欠如であります= &quot;外部参照&quot;&gt; 5、6、7。最初に、ターゲットベースのアプローチは、細菌細胞全体に変換することができなかった抗Mtbの薬剤 5をスクリーニングするために使用されました。 Mtbの細胞を用いた場合でも、それは多くの場合正確にインビボ 8,9 において薬効を予測していないブロス増殖させた培養物を用いて行われます。これらの問題は認識されているとのMtbを含むマクロファージまたは潜在性のMtbに対する薬物スクリーニングアッセイは、正常8に確立された、10、11、12。しかし、これらのより高度なアッセイは、薬は、非血管新生した肺病変における、および感染部位に壊死巣で遭遇する浸透障壁に十分な配慮を与えることはありません。確かにでも最初の行の結核治療薬のリファンピシンのため、次善の投与は、 生体組織や脳脊髄液（CSF） で不十分なに疑問視されている13、14、15だけでなく、細胞内のMtb 8、9に対して有効性を減少を浸透。このように、初期のリード開発プロセスの間に考慮に入れ、これらのパラメータを取る新モデルおよびアッセイは間違いなく結核治療薬の発見の努力を改善するであろう。 このニーズに応えるために、我々は最近、安価で迅速、かつMtbの薬効試験の16のためのBSL-2互換の代替感染モデルを確立しました。生理学的に関連する細胞透過障壁を再現し大マクロファージの結合構造体、および生成されたマクロファージ継代以内に密集したMtbの生産この感染モデル<e潜在マウンテンバイクに似ている、変化した生理状態を持つメートル&gt;マウンテンバイク。この感染モデルから派生したMtbは、他の細胞内感染モデルと一貫性のある結果を生成した薬効を評価するためにレサズリンマイクロタイターアッセイ（REMA）と合わせ、血清濃度に比べて高いCSF濃度を達成するための一般的な結核治療薬の報告能力とよく相関していました16。 ここでは、 マウンテンバイク /マクロファージの結合構造体の生成は、REMAを使用して、薬剤感受性試験に適したマクロファージ継代のMtbを生成するために、詳細に説明します。特に、我々は、この感染系を候補の抗結核薬のスループットスクリーニングとの互換性のために96ウェル形式に適合させることができる方法を示します。

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>メーカーの推奨に従う</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>H2O; フィルター滅菌</td></tr><tr><td>D-パントテン酸ヘミカルシウム塩</td><td>ΣP5710</td><td></td><td>H2</サブ>O;フィルター滅菌</td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>194694</td><td>H2O に 50 mg/mL 原液を調製します。ハイ</td></tr><tr><td>グロマイシン B</td><td>EMD ミリポア</td><td>400051</td> H<td>2O に 200 mg/mL 原液を調製</td></tr>します <tr><td>Nalgene Square PETG 培地ボトル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>コーニング</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ハイクロン</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 プレートリーダー</td><td>Biotek</td><td></td><td>任意の蛍光プレートリーダーおよび顕微鏡と交換可能</td></tr><tr><td>Gen5 ソフトウェア</td><td>Biotek</td><td></td><td>の記録と分析rezasurin coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2679250</td><td>H2Oに10 mg / mLの原液を調製</td></tr> 塩<tr><td>酸</td><td>アクロスオーガニクス</td><td>457960010</td><td>H2Oに10 mg / mLの原液を調製</td></tr><tr><td>レサズリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>R7017</td><td>800 &mu;H2O中のg/mLストック溶液;フィルター滅菌</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T164500</td><td>H2Oに20%のストック溶液を調製し、フィルター滅菌</td></tr></tbody></table>

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

初期の抗結核薬の医薬品開発プロセスは、in vitro活性を持つ化合物が臨床現場での有効性に非効率的に変換されることによって妨げられています。これは、感染した宿主に存在する生理学的に関連する細胞浸透障壁に対する考慮が不足しているためである可能性があります。私たちは最近、結核菌(Mtb)を核として高密度に充填された大きなマクロファージ凝集体を生成する代替感染モデルを確立しました。これは、薬剤感受性試験に適したものでした。この感染モデルは、安価で迅速であり、最も重要なのはBSL-2と互換性があることです。ここでは、薬剤感受性試験のためのマクロファージ継代Mtbを生成するMtb/マクロファージ凝集体を生成するための実験的手順について説明します。特に、この感染システムを96ウェルプレートフォーマットに直接適応させる方法を示し、Mtbに対する化合物ライブラリのスクリーニングのためのスループット能力を示します。全体として、このアッセイは、そのシンプルさ、費用対効果、およびスケーラビリティにより、現在利用可能なMtb創薬ツールボックスへの貴重な追加です。

96ウェルプレートフォーマットにこの感染モデルを適合させるの頑健性を確認するために、ここでは、図に示したテンプレートに従ってリファンピシン（RIF）及びモキシフロキサシン（MOXI）に当社の96ウェル適応感染モデル由来のMtbの薬剤感受性を調べました1A。我々は、このアッセイの鍵のMtb /マクロファージ集合構造の発生を確実にスループットの互換性（ 図1B）を可能にする、96ウェルプレートフォーマット（ 図2）で生成することができることを実証します。マクロファージのMtb直接十分に特徴付けレサズリンマイクロタイターアッセイ（ 図3）を使用して、薬効試験のために使用することができ、このようにして製造継代。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

この手順の全般的な目的は、生存染色の染料を用いた薬剤感受性試験のために、96ウェルプレート形式で結核菌（mycobacterium tuberculosis）に感染したマクロファージ凝集構造を再現性良く作製することです。この手法は、候補化合物の臨床への移行が不調であるために停滞している抗結核化合物の初期創薬プロセスを改善することができます。この簡便で低コストであり、BSL-2（バイオセーフティレベル2）に対応した感染モデルの主な利点は、結核肉芽腫を彷彿とさせ、生理学的に関連のある細胞浸透障壁を再現している点にあります。これにより、in vivoでの有効性をより正確に予測できる薬剤感受性結果が得られます。まず、感染に用いる緑色蛍光タンパク質発現M.tuberculosis MC squared 6206（以下、MTBGFPと表記）を調製し、本手順を開始してください。本株は無毒株であるため、ここに記載するプロトコルのすべての操作はバイオセーフティレベル2の施設で実施可能です。セットアップする96ウェルプレート1枚につき、2.8 × 10⁸ 個の MTBGFP をスイングバケット式遠心機を用いて 3,200 ×g で5分間遠心分離します。遠心後、上清を吸引除去し、5 mL の RPMIC を加えて細菌を洗浄します。ピペッティングにより細胞を再懸濁してください。その後、再度遠心分離を行います。2回目の遠心後、上清を捨て、細菌細胞を7 mLのRPMICに再懸濁し、10秒間ボルテックスします。次に、準備する96ウェルプレート1枚につき、7 × 10⁶個のTHP1ヒト単球細胞を250 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、THP1細胞を7 mLのRPMICに再懸濁します。次に、A行とH行、および1列目と12列目のウェルに200 µLの滅菌水を加えることで、感染用の96ウェルプレートを準備します。このウォーターリム（水層）により、培地の蒸発を防ぎます。バックグラウンドコントロールまたはブランクとして、2列目のB2からG2のウェルにRPMICを200 µLずつ加えます。THP1単球に感染させるため、ピペットを用いて調製したMTBGFP細菌懸濁液の全量をTHP1細胞懸濁液に移し、ピペッティングにより十分に混合します。最終的なTHP1細胞密度は5×10⁵/mLとなり、対応するウェルの感染多重度は40となります。次に、THP1 MTBGFP懸濁液を25 mLのリザーバーに移します。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、残りの96ウェル（E3からG11まで）すべてにTHP1 MTBGFP懸濁液を200 µLずつ加えます。プレートを37 °C、5% CO2条件下で7〜10日間インキュベートします。インキュベーション期間中、2日ごとにマルチチャンネルピペットを用いて培地交換を行い、各ウェルの上層から使用済み培地を100 µLずつゆっくりと除去し、あらかじめ温めておいたRPMIを100 µLずつ静かに加えます。培地を交換する際は、ウェルの底にあるMTBマクロファージ凝集体を乱さないよう注意することが重要です。毎日、明視野およびGFPフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用い、4倍から10倍の対物レンズでウェルを視覚的に観察してください。MTBマクロファージ凝集体の大きさを確認し、必要に応じて画像を撮影してください。7日から10日目までに、MTBマクロファージ凝集塊は、ビデオの後半で説明する薬剤有効性試験に進むのに十分な大きさに成長しているはずです。薬剤試験のために、新しい96ウェルプレートを用いて、2種類の抗結核薬を以下のように3連（triplicate）で調製します。まず、ウェルB2からG10に7H9C培地を125 µLずつ加えます。次に、2種類の薬剤を、最高最終濃度の2倍の濃度になるように7H9C 1 mLで調製します。ピペットを使用して、各薬剤250 µLを、3連での処理となるように、それぞれウェルB、C、D 11およびE、F、G 11に分注します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、B 11からG 11までの125 µLをB 10からG 10へ移し、試験薬剤を2倍段階希釈します。各ステップでピペッティングを5回行い、混合します。プレート上の列を右から左へ、125 µLずつ順に移動させ、4列目で停止します。4列目を混合した後、125 µLを廃棄容器に捨てます。2列目と3列目には薬剤を添加しないでください。これにより、これらの列をバックグラウンドおよび陽性増殖コントロールとして使用できます。次に、MTB感染マクロファージを含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。プレートを傾けずに、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルB2からG11までから培地150 µLを除去します。次に、ここで示すようにプレートを傾け、ピペットチップをウェルの底端まで挿入し、残りの培地（約50 µL）を除去します。MTBマクロファージ凝集塊はウェルの底に付着しているため、試料が失われることはありません。ただし、培地の除去は可能な限り穏やかに行い、この過程で再懸濁が起こらないよう注意する必要があります。MTBマクロファージ凝集塊を含むプレートのウェルB2からG11に、7H9C培地100 microlitersを静かに加えます。マルチチャンネルピペットを用いて、薬剤含有96ウェルプレートから感染プレートの対応するウェルへ100 microlitersを移します。次に、プレートを密封袋に入れ、37°Cで3日間インキュベートします。レサズリンアッセイは、代謝活性を持つMTBによって生成される酸化種が、青色のレサズリンを蛍光性のピンク色のレゾルフィンに変換することを利用しています。この色の変化と蛍光を、細菌の増殖量を決定するための代替マーカーとして利用できます。水を用いて、最終濃度 8 mg/mL のレサズリンストック溶液を調製します。滅菌のため、孔径 22 µm の PVDF メンブレンでろ過します。ストック溶液、水、Tween-80 を 2:1:1 の比率で混合し、レサズリン作業溶液を調製します。最終濃度は、resazurinが4 mg/mL、Tween-80が5%となります。プレートリーダーを用いて、37 °Cで30分ごとに24時間、励起波長530 nm、蛍光波長590 nmで測定するプログラムを設定します。プレートリーダーをあらかじめ37 °Cに予熱しておきます。マルチチャンネルピペットを使用して、薬剤処理したプレートのウェルB2からG11に、レサズリン作業溶液を20 µLずつ加えます。プレートをリーダーにセットし、プログラムを開始します。この感染モデルを96ウェルプレート形式に適応させることの堅牢性を確認するため、本ビデオで説明した通り、MTBのリファンピシン（RIF）およびモキシフロキサシン（moxy）に対する感受性を評価しました。ここに示すように、MTBマクロファージ凝集構造を96ウェルプレート形式で構築することに成功し、これによりハイスループットへの対応が可能となりました。細菌増殖の指標としてレサズリンの変換を定量的に測定するため、個々のウェルの蛍光を24時間にわたって速度論的にモニタリングしました。生存しているMTB細胞の存在は、青色のレサズリン染料がピンク色の還元型に変換されることで判定され、これは飽和時点における相対的な蛍光強度の正味値によって定量的に反映されます。これらの代表的なミニグラフは、Y軸に示される蛍光ユニットとX軸に示される時間の関係を示しています。薬剤感受性の殺菌曲線を作成するために、リファンピシンおよびモキシフロキサシンで処理したウェルを、薬剤未添加コントロールのMTB最大増殖量を100%生存率として正規化しました。また、すべてのサンプルウェルから背景コントロールのブランク信号を差し引きました。薬剤投与の各濃度における生存率をプロットし、殺菌曲線を作成した。これらのデータは、我々の感染モデルから得られたMTBに対するリファンピシンおよびモキシフロキサシンの両剤において、90%の増殖抑制が観察される最小濃度の定義である最小発育阻止濃度が2 µg/mLよりも高いことを示している。したがって、本感染モデルおよびアッセイを用いたこれら2剤のMTBに対する最小発育阻止濃度は、in vivoにおけるこれらの薬剤の活性をより正確に反映している。このビデオを視聴することで、レサズリンアッセイを用いた薬剤感受性試験のために、MTB感染マクロファージ凝集構造を確実かつ再現性高く作製する方法を十分に理解できるはずです。この手順に従い、例として示されている2種類の薬剤から58種類の薬剤ライブラリーパネルへと薬剤テンプレートを変更することで、ハイスループットな薬剤スクリーニングを容易に実施できます。

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in...

結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。...

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

結核菌の細胞内増殖を迅速かつ効率的に定量することは 、結核(...

結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌...

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス...

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

結核菌と免疫受容体SLAMF1との相互作用の研究のための蛍光アッセイ

特定の条件下で培養すると結核菌は、薬剤耐性バイオフィルムを形成します。ここでは、培養M.ための方法を説明結核のバイオフィルムと薬剤耐性の永続化の頻度を決定する。これらのプロトコルは、M.の薬剤耐性のメカニズムにさらなる研究のために有用であろう結核...

の成長結核バイオフィルム

結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。...

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

増幅マイクロアレイは大幅にエンドユーザーのために、マイクロアレイのワークフローを合理化し、単一の室内に非対称PCR増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを兼ね備えています。マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるマイクロアレイに基づく診断を作成するために必要な最初のステップである。...

多剤耐性を実証<em&gt;結核菌</em&gt;増幅マイクロアレイ

学ぶマクロファージ凝集体を用いた結核菌薬剤感受性試験法。96ウェルプレート形式でGFP発現Mycobacterium tuberculosisを感染させ、レサズリンアッセイで薬効を評価する。BSL-2対応で低コストかつ高スループットスクリーニングに適した革新的なモデルです。

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

さらに動画を探す