マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

本手順の全体的な目的は、多様な誘導心筋細胞サブタイプを生成し、定量化することです。この手法は、サルコメアの構築やサブタイプの特定を制御するために必要なシグナルなど、心筋リプログラミングにおけるサブタイプ特異的なリネージ転換に関する基本的かつ重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、メカニズム研究の遂行に不可欠な、心筋サブタイプの特定に対する定量的影響を評価する方法を提供することにあります。

まず、ステージ E 12.5 の胚からマウス胚性線維芽細胞を単離します。付属のテキストプロトコルに従い、これらを液体窒素で保存してください。次に、plat-E 細胞を回収し、24 時間後に細胞密度が 70 〜 80% のコンフルエンシーに達するように、6 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 100 万個の細胞を播種します。

細胞にトランスフェクション培地を加え、標準的な培養条件下でインキュベートします。実験前日に、15 mLのポリスチレン製コニカルチューブを用意し、1反応あたり60 µLの低血清培地と6 µLのトランスフェクション試薬を混合します。この混合物を室温で5分間インキュベートします。

トランスフェクション効率の低下を防ぐため、トランスフェクション試薬は低血清培地に直接添加してください。次に、1反応あたり合計 2 µg の GHMT コクテルを加え、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。室温で 15 分間インキュベートした後、混合液を plat-E 細胞に滴下するように添加します。

トランスフェクションの日時を記録します。トランスフェクションしたplat-E細胞を一晩インキュベートします。マウス胚性線維芽細胞を播種する1時間前に、各ウェルに12 mmのフィブロネクチンコートカバースリップを加えることで、免疫細胞化学用の24ウェルプレートを準備します。

次に、各ウェルに300 µLのウシコラーゲン溶液を加え、プレートを1時間インキュベートします。インキュベーションの終了近くで、凍結保存されたHCN4GFPマウス胚性線維芽細胞のバイアルを融解させます。細胞を急速融解し、あらかじめ加温した線維芽細胞培地で一度洗浄した後、生存細胞数を計測します。

次に、24ウェルプレート内のコーティング溶液を吸引し、コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングしたカバーガラス上に、1ウェルあたり30,000個の細胞を直ちに播種します。トランスフェクションの24時間後、レトロウイルス培地を孔径0.45 micronの界面活性剤フリーセルロースアセテートフィルターでろ過し、15 milliliterのコニカルチューブに移します。その後、ポリブレンを最終濃度8 µg/mLになるように添加します。

2 mLの新鮮なトランスフェクション培地を、注意深くplat-E細胞に補充してください。培地を急激に交換すると、細胞が剥離する可能性があります。適切に維持されたplat-E細胞は、1 mLあたり平均10^7個の感染単位を産生します。

細胞の95%以上で高いGFP発現と強度が見られることは、通常、GHNTを介した誘導心筋様細胞の作製が成功したことと相関します。次に、培養した胚線維芽細胞の培地を吸引し、回収したばかりのレトロウイルス培地を添加します。その後、プレートをインキュベーターに戻し、一晩インキュベートします。

翌日、再びplat-E細胞から胚線維芽細胞へ培地を移します。2回目のウイルス回収後、plat-E細胞を廃棄してください。誘導から48時間後、細胞馴化培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。

次に、24ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ温めておいた心筋様細胞誘導培地を500 µLずつ加えます。その後12日間、2〜3日ごとに培地を交換してください。誘導から14日後に、培地を慎重に吸引し、各ウェルを氷冷したPBS 300 µLで洗浄します。

次に、PBSを除去し、1ウェルあたり250 µLの4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間細胞をインキュベートします。続いて、0.1% Triton X-100含有PBS 300 µLを用いて、5分間の洗浄を3回行い、細胞を透過処理します。最後の洗浄後、過剰な透過処理液を吸引除去し、1ウェルあたり300 µLのユニバーサルブロッキングバッファーを加えます。

室温で10分間ブロッキングを行います。スライド1ペアを、マウス抗alpha actenin抗体、ニワトリ抗GFP抗体、およびウサギ抗NPPA抗体で一晩染色し、誘導心房様心筋細胞における誘導ペースメーカー様心筋細胞を同定します。翌日、ウェルを洗浄し、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、適切な二次抗体を添加します。

さらに洗浄を行った後、ガラス製顕微鏡スライドに封入剤を2.4 µL滴下します。24ウェルプレートからカバーガラスを取り出し、余分な溶液を除去します。その後、封入剤を載せたガラススライド上にカバーガラスを移動させます。

各スライドについて、端から開始し、赤色蛍光チャンネルで上下にスキャンして、alpha-actinin陽性のサルコメア陽性細胞を特定します。サルコメアの横紋は、555 nanometerの波長で最も容易に特定できます。特定後、緑色チャンネルに切り替え、細胞が陽性であるかを確認し記録してください。

次にコンピューターに切り替え、遠赤色の647 nm波長でNPPAまたはMYL2の染色を確認します。α-actinin陽性、サルコメア陽性、Hnc4-GFP陰性かつNppa陽性の細胞は、誘導された心房様心筋細胞です。Nppaの染色は核周縁に点状に認められます。

まず、付属のテキストプロトコルに従い、播種から24時間後に細胞数をカウントします。次に、カバーガラス上の各細胞を視覚的に検査し、α-actininおよびサルコメア（筋節）が適切に染色されているかを確認し、両方のマーカーで陽性に染色された細胞数を記録します。その後、実際に播種した総細胞数で除します。

平均的なリプログラミング実験では、α-actinin陽性かつサルコメア陽性の細胞が約1%得られます。14日目に実験を終了し、サルコメアの構築状態を評価することができます。これは、ここで赤色に示されているα-actinin染色の陽性反応によって確認されます。

サルコメア構造を示す細胞のみが自律的に拍動できるため、これは有効な一次チェックとなります。ここに、Hcn4-GFPリポーターマウスから誘導されたペースメーカー様心筋細胞を示します。この視野内の3つの細胞において、サルコメア構造が認められます。

画像の中心にHcn4-GFP陽性の細胞クラスターが3つ存在しており、これらはペースメーカー細胞型として同定できます。左下にはα-actinin染色で観察される細胞が1つありますが、サルコメア構造や特定可能なサブタイプマーカーは認められません。この誘導心室様心筋細胞の集団において、中央の細胞はサルコメア構造を示しており、また心室心筋細胞のマーカーであるミオシン軽鎖マーカーMYL-2に対しても陽性を示しています。

習得すれば、plat-E細胞の播種とトランスフェクションは1時間で完了できます。マウス胚性線維芽細胞の誘導には1〜2時間、24ウェルプレート全体のmyto定量には約8時間かかります。本手順を実施する際は、健康なマウス胚性線維芽細胞と高タイターのウイルスが、リプログラミング実験を成功させるための鍵となることを忘れないでください。

このビデオを視聴することで、個別の誘導心筋細胞サブタイプを生成し、定量化する方法について十分に理解できるはずです。