Name: マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶマウス胚線維芽細胞のGHMT転写因子媒介リプログラミングによる心筋細胞サブタイプの生成と定量法。この手法は心筋譜系変換とサブタイプ特異化の機構研究に有用です。

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A.F.-P. は、助成金No.2015165336の下で、全米科学財団大学院研究フェローシップによって支援されました。NVMは、NIH(HL094699)、バロウズウェルカム基金(1009838)、およびマーチオブダイムズ(#5-FY14-203)からの助成金によって支援されました。Young-Jae Nam氏、Christina Lubczyk氏、Minoti Bhakta氏には、プロトコール開発とデータ解析への重要な貢献に感謝します。また、貴重な技術的インプットを提供してくださったJohn Shelton氏と、科学的な議論を提供してくださったMunshi研究室のメンバーにも感謝します。

<ol><li>Sissman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+landmarks+in+cardiac+morphogenesis%3A+comparative+chronology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology.</a> Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existing+cardiomyocytes+generate+cardiomyocytes+at+a+low+rate+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).</li>
<li>Writing Group, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2016+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li>
<li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nat Commun. 6, 8243(2015).</li>
<li>Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+steady+progress+on+direct+cardiac+reprogramming+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application.</a> Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).</li>
<li>Atkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+mapping+of+the+left+and+right+ventricular+His-Purkinje+conduction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).</li>
<li>Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+cardiomyocyte+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Atrial cardiomyocyte calcium signalling.</a> Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).</li>
<li>Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+mouse+ventricular+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of the mouse ventricular conduction system.</a> Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).</li>
<li>Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25406392">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConner%2C+DA+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
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<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nat Commun. 5, 5807(2014).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
<li>Bass, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+identifies+signaling+pathways+regulating+distinct+signatures+of+cardiac+myocyte+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究は、心臓転写のレトロウイルス媒介発現を介して、心臓のサブタイプの多様なセットにしたMEFの変換のためのダイレクトリプログラミング戦略を提供することはGATA4、MEF2C、TBX5、およびHand2（GHMT）要因。 PM固有レポーターマウスと組み合わせて多重免疫染色法を用いて、我々は、単一細胞の解像度でIAM、IVMS、およびIPMSを識別することができます。このようなアッセイは、サブタイプの多様性とサルコメアの開発に向けて、個々の転写因子の寄与を分離することのできるインビトロ系の実験を可能にします。並行して、これは新たな転写因子または特定の系統に向かってiCLMsにバイアスをかける小分子への洞察をもたらす可能性があります。それにもかかわらず、このアッセイが正常に完了するためのいくつかの重要なステップがあります。以下では、一般的なiCLM実験におけるウイルス力価の影響、線維芽細胞質、およびイメージング解析に取り組みます。 私たちの研究では、EMP・ローイエコトロピック-レトロウイルスは、E12.5のMEFのを再プログラムします。私たちは、...

心臓は胚1、2に開発した最初の機能的器官です。循環器系に関連して、開発中に、酸素、栄養素、および廃棄物処理機構に供給する。三週間受精後、人間の心は初めて打つとその適切な規制は、心筋細胞（のCM）によって維持されています。これらの特殊化した細胞の不可逆的損失は、したがって、進行性の心不全の根底にある基本的な問題です。このようなゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのようないくつかの生物は、心臓の再生の可能性を有しているが、大人の哺乳類の心臓は3、5、6、より限定されています。このように、心の重要な機能を考えると、心臓病は米国だけで60万人が死亡7を占め、世界における死亡の主な原因であることは驚くべきではありません。ザrefore、効率的に負傷した心筋を修理または交換するために、細胞ベースの治療は臨床上非常に興味深いものです。 山中ら8の精液の研究は、4つの転写因子の強制発現は、多能性幹細胞に完全に分化した線維芽細胞に変換するのに十分であることを示しました。しかし、すべての多能性幹細胞戦略の腫瘍形成能力は、治療目的のためのそれらの使用における重大な関心事となっています。これは、多能性段階を回避しながら細胞を分化転換するための代替方法を検索するための科学的なフィールドをやる気。最近、いくつかのグループは、転写の異所性発現は、GATA4、MEF2C、TBX5、および後に、Hand2（GMTとGHMT因子を用いて誘導心筋細胞様細胞（iCLMs）にマウス線維芽細胞の直接変換を表示することにより、この戦略の実現可能性を示していますそれぞれ）9,10。 Furthermore、同じ戦略は、 インビボおよびヒト由来の組織9、11、12で行うことができます。最近の研究では、追加の因子またはさらなる心臓再プログラミング効率13、14、15を改善するために調節することができるシグナル伝達経路を強調しています。まとめると、これらの研究は、再生治療のために向かう分化転換の可能性を示します。しかし、方法論的差異16にCMの再プログラミング、未知の分子機構、一貫性のない再現性の低効率、およびiCLMsの不均一な性質は、アドレス指定されないままです。 直接iCLM不均一性を評価するために、我々は、サルコメアの開発および心臓系統specificatioの同定のために離散的で堅牢な単一細胞アッセイを設計しましたn-2の機能的心筋細胞の必要な特性。それらの場所でユニークな電気的特性によって定義されたCMの少なくとも三つの主要なタイプは、心臓である：心房（AM）は、心室（VM）及びペースメーカー（PM）17、18、19、20。オーケストレーションの組み合わせで、それらは、血液の適切なポンピングを可能にします。心臓損傷の間、一つまたはすべてのサブタイプが影響を受ける可能性があり、および細胞治療のタイプは、ケースバイケースで対処する必要があります。少し作業は、サブタイプの仕様を調節する分子メカニズムを研究するために行われている間、現在、ほとんどの戦略は、心筋細胞の全体的な世代に焦点を当てています。 以下の研究は、適切によく組織サルコメアを定量化し、心筋細胞のサブタイプの多様なセットを識別する方法について詳しく説明します。ペースメーカー（PM）特異的レポーターマウスを用いて、Iを適用することができます誘導された心房のような筋細胞（IAM）、誘導された心室のような筋細胞（IVM）、および誘導されたPM-様筋細胞（IPMS）21を区別するためにmmunocytochemicalアプローチ。我々の観察に基づいて、サルコメア組織を示す細胞のみが自発的な拍動することが可能です。このユニークな再プログラミングプラットフォームは役割を評価することができます サルコメア組織、サブタイプの仕様、および単一セルの解像度でCMの再プログラミングの効率の特定のパラメータの。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>iCLM 培地、Plat-E 培地、線維芽細胞、トランスフェクション培地の成分</td></tr><tr><td>199</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11150059</td><td>iCLM 培地の成分</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>iCLM 培地、Plat-E 培地、線維芽細胞、トランスフェクション培地の成分</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン G</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41400-045</td><td>iCLM培地</td></tr><tr><td>MEMビタミン溶液</td>の成分 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11120-052</td><td>iCLM培地</td></tr><tr><td>の成分 MEMアミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1601149</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11140-050</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15240062</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>B-27サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>熱不活化馬血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26050-088</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>ナピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360-70</td><td>iCLM培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック1514022</td><td>プラットE培地および線維芽細胞培地</td></tr><tr><td>ピュロマイシンの成分&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11139-03</td><td>プラットE培地</td></tr>ブラスト<tr><td>シジンの成分&nbsp;&nbsp;</td><td>ジェミニ・バイオプロダクツ</td><td>400-128P</td><td>プラットE培地の成分</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050-061</td><td>線維芽細胞培地の成分</td></tr><tr><td>共焦点レーザースキャン LSM700</td><td>ツァイス</td><td></td><td>共焦点解析用</td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬</td><td>プロメガ</td><td>E2692</td><td>トランスフェクション試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>トランスフェクション試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア</td><td>TR-1003-G</td><td>誘導試薬。最終濃度8&muで使用してください。M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>レトロウイルスパカッキング細胞株</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>For MEFs and Plat-E dissociation</td></tr><tr><td>Mouse anti &-Actinin (Clone EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Antibody for confocal analysis.共焦点解析には、1:200</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP IgY Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10262</td>抗体で使用します<td>。1:200で使用</td></tr><tr><td>ウサギのパブ 反NPPA&nbsp;</td><td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>共焦点解析用抗体。1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgGで使用&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>共焦点解析用抗体。1:200</td></tr><tr><td>Vectashield溶液とDAPI(4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>で使用 Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>共焦点分析用色素</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat フィブロネクチン 12 mm カバースリップ</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>共焦点分析用カバースリップ</td></tr><tr><td>100 &mu;mセルストレーナー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;m シリンジ フィルター SFCA 25MM</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>09-740-106</td><td>ウイルスろ過用</td></tr><tr><td>6 mL シリンジ</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>ウイルスろ過用</td></tr><tr><td>ヤギ アンチチキン IgY (H&L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>共焦点解析用二次抗体。1:400で使用</td></tr><tr><td>ロバ対ウサギA647 IgG(H + L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>共焦点解析用二次抗体。共焦点解析には、1:400</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td>二次抗体で使用します<td>。1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100mL</td>で使用 <td>細胞透過化用&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2 および MgCl2 (D-PBS)</td><td>シグマ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>パワーブロック 10x ユニバーサルブロッキング試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9495720</td><td>H2O</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド水溶液 (PFA)</td> で 1x に希釈します<td>。</td><td>15710</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>6 cm&nbsp; プレート</td><td>オリンパス</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル プレート</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養皿</td><td>コーニング</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp;組織培養皿</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0.4% トリパンブルー溶液</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td>生存率</td></tr><tr><td>エチルアルコール 200プルーフ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

最近、再生医療、疾患モデリング、および系統指定のための強力なパラダイムとして、ある細胞タイプへの直接的なリプログラミングが浮上しています。特に、Gata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5(GHMT)による線維芽細胞の誘導心筋細胞様筋細胞(iCLM)への変換は、in vitroおよびin vivoでde novo心筋細胞を生成するための重要な手段を表しています。最近の証拠は、GHMTが以前に認識されていたよりも多様な心臓サブタイプを生成することを示唆しており、したがって、追加の研究を実施するための体系的なアプローチの必要性を強調しています。しかし、ダイレクト・リプログラミングを治療戦略として利用する前に、特定の心臓サブタイプを生成するために、系統転換のメカニズム的基盤を詳細に理解する必要があります。ここでは、GHMTを介したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のリプログラミングによりiCLMを生成するための詳細なプロトコルを紹介します。
私たちは、効率的なリプログラミングを達成するためのMEFの分離、レトロウイルス産生、およびMEF感染の方法を概説します。再プログラムされた細胞のサブタイプの同一性を決定するために、定義された適合抗体のセットを使用してiCLMで免疫細胞化学を実施するための段階的なアプローチについて詳しく説明します。共焦点顕微鏡法、iCLMおよび個々の心房(iAM)、心室(iVM)、ペースメーカー(iPM)のサブタイプの同定および定量化の方法も紹介します。最後に、プロトタイプの直接リプログラミング実験の代表的な結果について説明し、効率的な系統変換を確実にするためのプロトコルの重要な技術的側面を強調します。まとめると、私たちの最適化されたプロトコルは、研究者が個々のCMサブタイプの特定を必要とする有意義な心臓リプログラミング実験を実施するための段階的なアプローチを提供するはずです。

PM固有のレポーターマウスを利用して、我々は、 図1に示されるように、多様な内因性の筋細胞を同定するための多重免疫戦略を開発しました。 図2に示す書き換え手順に続いて、サブタイプ特異的のCMの誘導は、低レートではあるが、早ければ4日目21として検出することができます。 14日目では、実験は、サルコメア組織（ 図3）およびサブタイプ仕様（ 図4）を停止し、評価することができます。 図5は、スライドICCのための準備（ 図5パネルA）、およびiCLMサブタイプ特異的細胞の定量化（ 図5パネルB / C）のワークフローをまとめたものです。 <img alt="図1" src=...

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

本手順の全体的な目的は、多様な誘導心筋細胞サブタイプを生成し、定量化することです。この手法は、サルコメアの構築やサブタイプの特定を制御するために必要なシグナルなど、心筋リプログラミングにおけるサブタイプ特異的なリネージ転換に関する基本的かつ重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、メカニズム研究の遂行に不可欠な、心筋サブタイプの特定に対する定量的影響を評価する方法を提供することにあります。まず、ステージ E 12.5 の胚からマウス胚性線維芽細胞を単離します。付属のテキストプロトコルに従い、これらを液体窒素で保存してください。次に、plat-E 細胞を回収し、24 時間後に細胞密度が 70 〜 80% のコンフルエンシーに達するように、6 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 100 万個の細胞を播種します。細胞にトランスフェクション培地を加え、標準的な培養条件下でインキュベートします。実験前日に、15 mLのポリスチレン製コニカルチューブを用意し、1反応あたり60 µLの低血清培地と6 µLのトランスフェクション試薬を混合します。この混合物を室温で5分間インキュベートします。トランスフェクション効率の低下を防ぐため、トランスフェクション試薬は低血清培地に直接添加してください。次に、1反応あたり合計 2 µg の GHMT コクテルを加え、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。室温で 15 分間インキュベートした後、混合液を plat-E 細胞に滴下するように添加します。トランスフェクションの日時を記録します。トランスフェクションしたplat-E細胞を一晩インキュベートします。マウス胚性線維芽細胞を播種する1時間前に、各ウェルに12 mmのフィブロネクチンコートカバースリップを加えることで、免疫細胞化学用の24ウェルプレートを準備します。次に、各ウェルに300 µLのウシコラーゲン溶液を加え、プレートを1時間インキュベートします。インキュベーションの終了近くで、凍結保存されたHCN4GFPマウス胚性線維芽細胞のバイアルを融解させます。細胞を急速融解し、あらかじめ加温した線維芽細胞培地で一度洗浄した後、生存細胞数を計測します。次に、24ウェルプレート内のコーティング溶液を吸引し、コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングしたカバーガラス上に、1ウェルあたり30,000個の細胞を直ちに播種します。トランスフェクションの24時間後、レトロウイルス培地を孔径0.45 micronの界面活性剤フリーセルロースアセテートフィルターでろ過し、15 milliliterのコニカルチューブに移します。その後、ポリブレンを最終濃度8 µg/mLになるように添加します。2 mLの新鮮なトランスフェクション培地を、注意深くplat-E細胞に補充してください。培地を急激に交換すると、細胞が剥離する可能性があります。適切に維持されたplat-E細胞は、1 mLあたり平均10^7個の感染単位を産生します。細胞の95%以上で高いGFP発現と強度が見られることは、通常、GHNTを介した誘導心筋様細胞の作製が成功したことと相関します。次に、培養した胚線維芽細胞の培地を吸引し、回収したばかりのレトロウイルス培地を添加します。その後、プレートをインキュベーターに戻し、一晩インキュベートします。翌日、再びplat-E細胞から胚線維芽細胞へ培地を移します。2回目のウイルス回収後、plat-E細胞を廃棄してください。誘導から48時間後、細胞馴化培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、24ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ温めておいた心筋様細胞誘導培地を500 µLずつ加えます。その後12日間、2〜3日ごとに培地を交換してください。誘導から14日後に、培地を慎重に吸引し、各ウェルを氷冷したPBS 300 µLで洗浄します。次に、PBSを除去し、1ウェルあたり250 µLの4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間細胞をインキュベートします。続いて、0.1% Triton X-100含有PBS 300 µLを用いて、5分間の洗浄を3回行い、細胞を透過処理します。最後の洗浄後、過剰な透過処理液を吸引除去し、1ウェルあたり300 µLのユニバーサルブロッキングバッファーを加えます。室温で10分間ブロッキングを行います。スライド1ペアを、マウス抗alpha actenin抗体、ニワトリ抗GFP抗体、およびウサギ抗NPPA抗体で一晩染色し、誘導心房様心筋細胞における誘導ペースメーカー様心筋細胞を同定します。翌日、ウェルを洗浄し、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、適切な二次抗体を添加します。さらに洗浄を行った後、ガラス製顕微鏡スライドに封入剤を2.4 µL滴下します。24ウェルプレートからカバーガラスを取り出し、余分な溶液を除去します。その後、封入剤を載せたガラススライド上にカバーガラスを移動させます。各スライドについて、端から開始し、赤色蛍光チャンネルで上下にスキャンして、alpha-actinin陽性のサルコメア陽性細胞を特定します。サルコメアの横紋は、555 nanometerの波長で最も容易に特定できます。特定後、緑色チャンネルに切り替え、細胞が陽性であるかを確認し記録してください。次にコンピューターに切り替え、遠赤色の647 nm波長でNPPAまたはMYL2の染色を確認します。α-actinin陽性、サルコメア陽性、Hnc4-GFP陰性かつNppa陽性の細胞は、誘導された心房様心筋細胞です。Nppaの染色は核周縁に点状に認められます。まず、付属のテキストプロトコルに従い、播種から24時間後に細胞数をカウントします。次に、カバーガラス上の各細胞を視覚的に検査し、α-actininおよびサルコメア（筋節）が適切に染色されているかを確認し、両方のマーカーで陽性に染色された細胞数を記録します。その後、実際に播種した総細胞数で除します。平均的なリプログラミング実験では、α-actinin陽性かつサルコメア陽性の細胞が約1%得られます。14日目に実験を終了し、サルコメアの構築状態を評価することができます。これは、ここで赤色に示されているα-actinin染色の陽性反応によって確認されます。サルコメア構造を示す細胞のみが自律的に拍動できるため、これは有効な一次チェックとなります。ここに、Hcn4-GFPリポーターマウスから誘導されたペースメーカー様心筋細胞を示します。この視野内の3つの細胞において、サルコメア構造が認められます。画像の中心にHcn4-GFP陽性の細胞クラスターが3つ存在しており、これらはペースメーカー細胞型として同定できます。左下にはα-actinin染色で観察される細胞が1つありますが、サルコメア構造や特定可能なサブタイプマーカーは認められません。この誘導心室様心筋細胞の集団において、中央の細胞はサルコメア構造を示しており、また心室心筋細胞のマーカーであるミオシン軽鎖マーカーMYL-2に対しても陽性を示しています。習得すれば、plat-E細胞の播種とトランスフェクションは1時間で完了できます。マウス胚性線維芽細胞の誘導には1〜2時間、24ウェルプレート全体のmyto定量には約8時間かかります。本手順を実施する際は、健康なマウス胚性線維芽細胞と高タイターのウイルスが、リプログラミング実験を成功させるための鍵となることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、個別の誘導心筋細胞サブタイプを生成し、定量化する方法について十分に理解できるはずです。

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

ここでは、レトロウイルスを媒介としたGata4、Tbx5、Mef2cのポリシストロニックコンストラクトによる送達を使用したiCMの生成のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、効率と品質が向上した比較的均質な再プログラムされた細胞集団をもたらし、iCMリプログラミングの将来の研究に価値があります。...

GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。...

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7...

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価

学ぶマウス胚線維芽細胞のGHMT転写因子媒介リプログラミングによる心筋細胞サブタイプの生成と定量法。この手法は心筋譜系変換とサブタイプ特異化の機構研究に有用です。

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

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