心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

この技術の全体的な目標は、薬物スクリーニングや疾患モデリングのためのin vitro収縮解析プラットフォームとして使用できる3次元の人工心臓組織を生成することです。この方法は、疾患モデリング、安全性薬理学、遺伝子変異体、または薬物が収縮力に及ぼす影響に関する心臓分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる種の人工心臓組織を無菌条件下で長期間にわたって測定できることです。

この方法に不慣れな科学者は、細胞の質の欠如に苦労する可能性があります。または、媒体にaが欠けています。これは、自己準備を最適化し、この手順を実証するのサイクルを避けることが重要ですアニカベンジンとアンバーサリームになります。

手順を開始する前に、1.6ウェルプレートの応急処置ウェルに1.6ミリリットルの温かい2パーセントアガロースを追加します。そしてすぐにポリテトラフルオロエチレンをスペーサーに入れてアガロースに入れます。室温で約10分後、アガロースは不透明になり、固化を示します。

スペーサーを取り外し、PDMSラックを鋳物に配置して、ラックポストのペアが各アガロース型に届くようにします。全てのラックを配置したら、心筋細胞を10ミリリットルあたり7細胞の1.5倍以上の濃度で培地に懸濁し、新たに調製した再構成液を血清ピペットでフィブリノーゲンと10〜15回混合し、フィブリノーゲン塊が溶解するまで混合します。ピペット内の再構成ミックスの均質性を確認します。

次に、人工心臓組織(EHT)ごとに、100マイクロリットルの再構成ミックスと3マイクロリットルのトロンビンを200マイクロリットルのチューブに混合します。そしてすぐにこのEHTトロンビン混合物の100マイクロリットルをアガローススロットに分注します。EHTごとに新しいフィルターチップを使用します。

すべてのスロットが再構成ミックスで満たされたら、細胞培養皿の蓋を閉め、調製物を摂氏37度と二酸化炭素7%で2時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートを滅菌フードに入れ、各ウェルを200〜500マイクロリットルの培地で覆います。プレートを静かに振って、EHTをインキュベーターに戻します。

10分後、ラックをウェルあたり1.5ミリリットルのEHT培地を含む新しい24ウェルプレートに慎重に移し、適切な培養条件下でプレートを細胞培養インキュベーターに置きます。毎週月曜日、水曜日、金曜日にEHTに供給するには、PDMSラックを新しい培地の2番目のプレートに移します。鋳造後7〜10日で、EHTはPDMSラックのポストを偏向させる自発的な収縮を示すはずです。

EHTの収縮を解析するには、実験当日、測定の2時間前にEHT分析装置の加熱装置の電源を入れてください。解析の直前に、軸システムのガスと電子供給をオンにします。ベースライン記録を行うには、EHTプレートをEHT分析装置にセットし、製造元の指示に従って収縮解析ソフトウェアを起動します。

ソフトウェアのマニュアルの指示に従って新しい試験を開始し、プロトコルタブをクリックして関連する試験情報を入力します。[セットアップ]タブを開き、分析用のウェルを選択します。時間の制約があるため、このビデオでは 2 つの EHT についてのみデモンストレーションを行っています。

次に、カメラビュータブをクリックし、自動フィギュア検出モードでカメラのライブモードを開始します。24ウェルディッシュで選択した各ウェルのxyz座標でカメラの位置を調整し、各EHTがウィンドウの中央にピントが合っていることを確認します。青い十字がEHTの上端と下端にあり、EHTの短縮形と一致するように移動していることを確認します。

そして、位置OKボタンを押して、各ウェルのセットアップ位置を保存します。次に、パラメータタブをクリックして、ソフトウェアが収縮ピークを識別する基準を定義し、ピークを緑色の四角でマークします。入力したすべての設定を保存するには、すべてのウェルのパラメーターを使用します。

次に、自動タブと開始ボタンをクリックして、ベースラインEHT収縮を記録し、各EHTの自発ベースライン収縮性を計算します。ライブ収縮解析はリアルタイムタブに表示されます。青い十字がEHTの収縮に合わせて垂直にのみ動いていることを確認してください。

特定の対象薬物が収縮に及ぼす影響を分析するには、まず、タンパク質を含まない甲状腺溶液で満たされた24ウェルプレートを滅菌フードの下に移し、カーボン電極をウェルに配置します。EHTを電極上部のPDMSラックに移し、EHTをインキュベーターに戻します。約30分後、EHTをEHT分析装置のインターロックにセットし、EHTごとに20秒間の自発的なベースライン収縮性を記録します。

次に、カーボン電極をペーシングケーブルに接続し、EHTを電気的に刺激し始めます。EHT ごとに 10 秒間のペースベースラインを記録し、すべての EHT が適切なペースで進んでいることを確認します。ペーシング信号は、すべてのピークの前の収縮グラフトに含まれる青い垂直線でマークされるようになりました。

ベースライン記録後、電極とPDMSラックを最初の薬物濃度を含む新しい24ウェルプレートに移し、すぐにEHTをEHT分析装置のインターロックに戻して20分間インキュベーションします。ペーシングケーブルを再接続し、フィギュア認識を調整し、最初の薬物濃度に応じたEHT収縮を記録します。すべての薬物濃度をテストした後、結果として得られたすべてのPDF記録を保存し、各記録の図の認識と、収縮ピークの正方形とアーティファクトの正しい位置を確認します。

オフライン解析の場合は、runsデータベースからそれぞれのrunのselect runをクリックし、パラメータタブで収縮解析のパラメータを変更します。次に、[オフライン]タブで、[オフライン分析]を選択してビデオを再分析します。フィギュアの認識を調整し、新しいビデオファイルを録画します。

リアルタイムタブでフィギュア認識を調整し、サンプルレビューを選択します。EHTは、新しいポジションに従って分析されます。各EHTの分析は、組織の上端と下端の図の認識に基づいています。

撮影されたEHTの収縮は、EHT分析装置のソフトウェアアルゴリズムによって自動的に分析され、ピークは関連する事前定義された基準に従って決定されます。EHT収縮解析の長期測定では、収縮力、鼓動周波数、T1収縮、またはT2緩和時間の最大20時間で、時間依存的な明らかな変化がないことが示されています。コンストラクトの安定性が高いことを示しています。

実際、各信号EHTの結果は、ばらつきが少なく再現可能です。しかし、hERGチャネル遮断薬への曝露は、濃度から始まるT2緩和時間の大幅な延長をもたらします。そして、高濃度での不規則な鼓動パターン。

一度習得すると、準備が適切に行われれば、30分以内に24のEHTを生成できます。開発後、この技術は、疾患モデリングの分野の研究者がin vitroで遺伝子変異の影響を調査する道を開きました。このモデルの汎用性により、ヒトが誘導した幹細胞やゲノム編集技術と組み合わせることができます。

この手順に続いて、組織学やRNAおよびタンパク質分析などの追加の方法を使用して、遺伝子の転写と発現に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、EHTのキャストと分析の方法について理解できるはずです。この手順についてご不明な点がございましたら、お気軽に直接お問い合わせください。