Name: 心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ 人間iPS細胞由来心筋細胞を用いた三次元エンジニア心臓組織の作製と自動収縮解析法。薬剤安全性スクリーニングや疾患モデリングのための収縮力測定プラットフォームとして活用可能です。

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著者は、材料の彼らの現物出資のためのアレッサンドラ・モレッティとデニス・シャーデに感謝しています。私たちは、実験薬理学およびUKEの毒性の部門でのiPSとEHTワーキンググループの素晴らしいサポートを認めます。著者の作品はDZHK（循環器病研究のためのドイツ語センター）と教育のドイツの研究省（BMBF）、ドイツの研究財団（DFGエス88 / 12-1、HA 3423 / 5-1からの助成金によってサポートされています）、研究中の動物の交換洗練＆リダクション（NC3Rsクラック-ITの助成金35911から259146）のために英国のナショナルセンター、英国心臓財団RM / 30157分の13、欧州研究評議会（アドバンスト・グラントIndivuHeart）、ドイツ心臓財団そしてFreieウントHansestadtハンブルク。

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<li>EHT Technologies GmbH. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
</ol>

IM、TEとAHはEHT Technologies GmbH社、ドイツの共同設立者です。

エンジニア心臓組織は、心血管研究のツールボックスに貴重なオプションを提供しています。 24ウェルフォーマットにおけるEHTsは、疾患のモデリング8、14、薬剤の安全性スクリーニング7、8、10、11、15、または基本的な心臓血管研究16、17のために価値のあることが証明されています。 基本EHTプロトコルの潜在的な変更は、心筋細胞と非心筋細胞18および後負荷増強<sup class...

例えば、薬物誘発性QT延長症候群のような心臓の副作用は、過去数年間にわたり、市場の撤退につながっています。統計は、すべての引き出しの約45％が心血管系1上の不要な影響によるものであることを示しています。高価な発達過程および承認した後に、この薬の失敗は、製薬会社にとって最悪のシナリオです。研究開発部門は、したがって、早期に不要な心血管系への影響の検出に焦点を当てています。経済的、倫理的な問題、動物実験を削減し、新しいin vitroスクリーニングアッセイでそれらを置き換えるための努力のために進行中です。 確立されたアッセイのセットは、米国食品医薬品局（FDA）と欧州医薬品庁（EMA）催不整脈薬の効果2の前臨床評価のためのガイドラインに含まれています。の分化に続いて体細胞を再プログラミングする技術人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）は、この研究分野3を押し上げました。現在では、 インビトロでヒト心筋細胞の新薬候補をスクリーニングする可能性を提供し、種間の違いの問題を回避できます。最近の心臓分化プロトコル4、 図5は、倫理的な懸念せずに心筋細胞の無制限の供給を提供します。しかし、収縮力の測定は、心筋細胞の生体パラメータの中で最も重要かつ最も特徴付けられ、十分に確立されていません。これは、成人心筋細胞と比較して、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CM）の相対的な未熟6に関連しています。可能な進歩は、単一のセル7（操作心臓組織、EHT）から3次元心臓組織を操作することです。 EHTプロトコルは単一のマウスまたはヒト心筋8を埋め込むことに基づいています</SUP&gt;、2つの可撓性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト24ウェル形式で11の間にフィブリンヒドロゲル9、10。数日以内に心筋細胞を単一細胞として自発的に収縮し始めると、セルラーネットワークを形成し始めます。 7-10日後、組織全体の巨視的収縮が表示されます。このプロセスの間に細胞外マトリックスは、直径と長さの減少につながる、改造されています。 PDMSの曲げEHT結果の短縮は、連続負荷に開発EHTで心筋細胞を施す、残りの間にも投稿してください。 EHTsは数週間にわたってauxotonic筋肉の収縮を実行し続けます。ヒトEHTsは、薬物スクリーニングおよび疾患モデリング7のためのそれらの適合性を示す生理学的および薬理学的刺激に対する応答を示します。 本稿では、我々はgeneratiための堅牢かつ簡単なプロトコルを提示します人間EHT、およびhERGチャネル阻害剤の存在下での収縮パターンの濃度依存性の変化を自動的に収縮分析の上。

<table><tbody><tr><td>EHT分析装置</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>ソフトウェア付属</td></tr><tr><td>EHT PDMSラック</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFEスペーサー</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT電極</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHTペーシングアダプタ/ケーブル</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ、目盛り付き&nbsp;</td><td>ザルスタット</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>サルスタット</td><td>831,830</td><td></td></tr><tr><td>スピナーフラスコ</td><td>インテグラ</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>スターラー バリオマグ/シマレック バイオシステムダイレクト&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>ローター速度を 40 rpm に調整</td></tr><tr><td>T175 細胞培養フラスコ&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>831,812,002</td><td></td></tr><tr><td>V字型沈殿棚&nbsp;</td><td>UKEハンブルクでカスタムメイド</td><td>na10</td><td></td></tr><tr><td>&times;DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ338-AC</td><td></td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS インスリン&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ314-BP</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII&nbsp;</td><td>ワージントン</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>バイオクロム</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II, type V (ウシ脾臓由来)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン (ウシ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>コーティング用: 1:200 希釈</td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン&nbsp;</td><td>生物産業</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>インスリン、ヒト</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>リピッドミックス&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354234</td><td>EHTレコンシチュエーションミックス用。</td></tr><tr><td>N-ベンジル-p-トルエンスルホンアミド</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーリン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Custom made at UKE ハンブルク</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell 心筋細胞キット</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte 心筋細胞キット</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC 心筋細胞キット</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis cardiomyocytes</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>10075</td><td></td>円</tr></tbody></table>

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

心臓組織工学は、三次元力発生工学的組織を構成する技術が記載されています。基礎研究および前臨床医薬品開発におけるこれらの手順の実装のために、標準化された条件下での自動生成および解析のためのプロトコルを開発することが重要です。ここでは、異なる種（ラット、マウス、ヒト）の心筋細胞からエンジニア心臓組織（EHT）を生成する手法を提示します。技術は、24ウェルフォーマットで弾性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト間解離、心筋細胞を含むフィブリンゲルのアセンブリに依存しています。三次元の、力発生EHTsは、鋳造後2週間以内に構成します。この手順では、週に数百EHTsの生成を可能にし、技術的に心筋細胞の利用可能性によってのみ制限される（0.4〜1.0×10 6 / EHT）。 auxotonic筋収縮の評価はmechanで変性インキュベーションチャンバーで行われますiCalの24ウェルプレートのためのインターロックと、このチャンバの上に配置カメラ。ソフトウェアは、カメラが各EHTにXYZ軸システムに移動制御します。 EHT収縮は、自動図形認識アルゴリズムによって検出され、そして力がEHTの短縮及びPDMSポストの弾性性質および形状に基づいて算出されます。この手順は、標準化された無菌条件下でEHTの高い番号の自動分析が可能になります。心筋細胞の収縮に対する薬物効果の確実な検出は、心臓薬の開発や安全性薬理のために重要です。私たちは、それが心臓の薬の安全性スクリーニングのための有望なツールであることを示す、人間EHTシステムは、人間の心臓の収縮速度で薬物応答を複製することを、hERGチャネル阻害剤E-4031の例を、示しています。

EHTの心臓分化と準備 HiPSCは、成長因子低減基底膜マトリックス上に展開EDTA、一晩スピナーフラスコに形成された胚様体（EB）を用いて解離させました。 3日間、中胚葉誘導後、心臓分化はのWnt阻害剤で開始しました。分化プロトコルの〜17日後、拍動EBをコラゲナーゼタイプII（ 図1）を用いて単一細胞に分離しました。 EHTsを直ちにEB解離（ 図2）の後、100μLの組織あたり1.0×10 6細胞を新たに単離した心筋細胞から調製しました。凍結した細胞（ 例えば 、商業的供給業者）からの調製のために、細胞を培地に滴下再懸濁により解凍し、遠心分離した後、ECMに再懸濁しました。 48時間以内に、単一細胞の自発的な拍動は、EHTに顕微鏡観察されました。次の日に、心筋細胞は、組織の力線に沿って縦方向に広がって結合され、コヒーレントに暴行EHTを形成しま...

人工多能性幹細胞（hiPSC）が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

この技術の全体的な目標は、薬物スクリーニングや疾患モデリングのためのin vitro収縮解析プラットフォームとして使用できる3次元の人工心臓組織を生成することです。この方法は、疾患モデリング、安全性薬理学、遺伝子変異体、または薬物が収縮力に及ぼす影響に関する心臓分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる種の人工心臓組織を無菌条件下で長期間にわたって測定できることです。この方法に不慣れな科学者は、細胞の質の欠如に苦労する可能性があります。または、媒体にaが欠けています。これは、自己準備を最適化し、この手順を実証するのサイクルを避けることが重要ですアニカベンジンとアンバーサリームになります。手順を開始する前に、1.6ウェルプレートの応急処置ウェルに1.6ミリリットルの温かい2パーセントアガロースを追加します。そしてすぐにポリテトラフルオロエチレンをスペーサーに入れてアガロースに入れます。室温で約10分後、アガロースは不透明になり、固化を示します。スペーサーを取り外し、PDMSラックを鋳物に配置して、ラックポストのペアが各アガロース型に届くようにします。全てのラックを配置したら、心筋細胞を10ミリリットルあたり7細胞の1.5倍以上の濃度で培地に懸濁し、新たに調製した再構成液を血清ピペットでフィブリノーゲンと10〜15回混合し、フィブリノーゲン塊が溶解するまで混合します。ピペット内の再構成ミックスの均質性を確認します。次に、人工心臓組織(EHT)ごとに、100マイクロリットルの再構成ミックスと3マイクロリットルのトロンビンを200マイクロリットルのチューブに混合します。そしてすぐにこのEHTトロンビン混合物の100マイクロリットルをアガローススロットに分注します。EHTごとに新しいフィルターチップを使用します。すべてのスロットが再構成ミックスで満たされたら、細胞培養皿の蓋を閉め、調製物を摂氏37度と二酸化炭素7%で2時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートを滅菌フードに入れ、各ウェルを200〜500マイクロリットルの培地で覆います。プレートを静かに振って、EHTをインキュベーターに戻します。10分後、ラックをウェルあたり1.5ミリリットルのEHT培地を含む新しい24ウェルプレートに慎重に移し、適切な培養条件下でプレートを細胞培養インキュベーターに置きます。毎週月曜日、水曜日、金曜日にEHTに供給するには、PDMSラックを新しい培地の2番目のプレートに移します。鋳造後7〜10日で、EHTはPDMSラックのポストを偏向させる自発的な収縮を示すはずです。EHTの収縮を解析するには、実験当日、測定の2時間前にEHT分析装置の加熱装置の電源を入れてください。解析の直前に、軸システムのガスと電子供給をオンにします。ベースライン記

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

幹細胞は、人間の心臓の生理学および薬理学の有用なモデル人間誘導された多能性から派生した心筋細胞の分離を自発的に契約です。周波数を破って、Ca 感受性蛍光色素と温度制御のイメージング ウェル プレート リーダーを使用してに外因性の化合物の効果を定量化するハイスループットス クリーニング...

人間-iPSC 由来心筋細胞分離の収縮測定 384 ウェル プレートの温度制御の Ca 感受性蛍光色素

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

ヒトiPS細胞由来心筋細胞の収縮機能や細胞完全性の変化の解析は、非臨床医薬品開発にとって非常に重要です。ハイブリッド96ウェル細胞解析システムは、両方のパラメータをリアルタイムかつ生理学的な方法で処理し、臨床段階への安全な移行に必要な信頼性の高いヒト関連の結果を実現します。...

前臨床心臓リスク評価のためのヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro...

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

このプロトコルはMyoBLAZERシステム、前臨床開発の間にcontractilityの薬物誘発性の変更を評価するための信頼できるプラットホームのドナーの中心からの大人の人間の原発性心筋細胞のcontractilityを測定する方法を記述する。...

単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro...

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぶ 人間iPS細胞由来心筋細胞を用いた三次元エンジニア心臓組織の作製と自動収縮解析法。薬剤安全性スクリーニングや疾患モデリングのための収縮力測定プラットフォームとして活用可能です。

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

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