精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

この手法の全体的な目的は、精密切片肺スライス（PCLS）を用いて、肺におけるさまざまな免疫細胞種の局在とトラフィッキングを可視化することです。この手法は、肺における免疫細胞の局在や遊走パターンなど、免疫学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺の三次元構造を維持した生体外（ex vivo）組織において、複数の相互作用を可視化できることです。

この手法は、炎症時の免疫細胞の局在やトラフィッキングに関する知見を得るために有用ですが、気道や平滑筋組織の収縮を可視化するためにも利用可能です。肺組織を採取するには、まず、生後6〜12週のマウスの腹部中央から顎にかけて、皮膚と腹膜をはさみで切開し、腸管を腹腔の側面に移動させます。下大静脈を切断して肺から血液を排出し、はさみの鋭い先端で横隔膜を穿刺して胸郭を拡張させます。

次に、ピンセットを使用して唾液腺およびその他の組織を気管から手で引き離し、細いピンセットを用いて、最も厚い軟骨帯の前側に、20ゲージの針が刺入できる程度の大きさの切開を気管に入れます。ここで、1.5インチの20ゲージ針をポリエチレンチューブの断面に差し込み、チューブを約45度の角度で切断します。針を1mLシリンジに取り付け、40°Cの2%低融点アガロース0.8mLをシリンジに吸引します。

アガロースをすべて充填したら、チューブの斜端を切開部に挿入し、ゆっくりとアガロースを肺に注入します。針やシリンジを動かさぬまま、シリンジをポリスチレンベースにテープで固定して針を気管内に保持し、動物を 4 °C で少なくとも 10 分間保存します。アガロースが凝固したら、はさみを用いて慎重に肺を切り出し、氷冷した PBS を入れた 3 cm ディッシュに配置します。

次に、組織切片作成のため、気管に接続する肺の内側部分が下を向くように葉を回転させます。肺組織を切断するには、まず金属製のシリンジプランジャーの上にAll Purpose No Run gel superglueを少量滴下し、円を描くように広げます。接着剤をすべて塗布したら、ピンセットを用いて切り出した葉の気管側を下にして迅速かつ穏やかに掴み、ティッシュで葉を軽く押さえて余分な液体を取り除きます。

乾燥させた肺葉をプランジャーの上に慎重に配置し、プランジャーの端からはみ出している余分な組織を切り取ります。プランジャーを押し下げ、金属製シリンジの側面が組織を覆うように移動させ、シリンジシャフトの底に肺が位置し、深さが数cm以下のウェルを作成します。プランジャーを固定するため、シリンジの底部をテープで留めます。

次に、40 °Cに温めた2%低融点アガロースを、葉の頂端がちょうど浸るまでシリンジに慎重に注ぎ、金属製シリンジを氷冷チリングブロックで囲みます。1〜2分後、検体が入ったシリンジを自動スライサーにセットし、新品のブレードを合わせます。次に、バッファタンクに氷冷PBSを満たします。

ステップモーター駆動装置を試料シリンジに合わせて配置し、テープを取り除きます。スイッチを早送り位置に回し、ステップモーター駆動装置がプランジャーの背面にちょうど接触するまで動かします。スライサーで、組織の厚さ、連続単一切片、振動、および速度の設定を行います。

次にスタートボタンを押し、薄いスパチュラを用いて、バッファータンクに落下するPCLSをそれぞれ回収し、氷冷PBSを入れた24ウェルプレートの各ウェルにスライスを配置します。静止状態でのPCLSイメージングを行う場合は、関心のある解剖学的領域を含む肺サンプルを、適切な抗体カクテル1 mLを入れた直径3 cmのディッシュにそれぞれ移します。氷上でロッキングしながら、遮光条件下で30～60分間静置した後、氷冷PBS 1 mLでスライスを2回洗浄します。

次に、サンプルごとに3 cmの丸型ガラスボトムディッシュにPBSを50 µL加え、スライスを各液滴の中に素早く移し、組織片が平らに広がるように優しく調整します。その後、ピペットでPBSを吸引し、スライド上に室温の封入剤を1滴垂らしてから、ガラスカバーグラスを被せます。組織をイメージングするには、ディッシュを共焦点顕微鏡のステージに設置して20x対物レンズで観察し、タイルツールを使用して組織の端を特定してマークします。この際、タイルスキャンの時間を短縮するために凸包（convex hull）設定を使用してください。

次に、z-stackの範囲を設定します。この際、切片の複数の領域、特に端の部分においても、設定した範囲が適切であるように注意してください。生細胞イメージングの場合、目的の抗体カクテルで30分間インキュベートした後、冷えたLeibovitz 10を1 mL用いて切片を2回すすぎます。次に、サンプルごとにチェンバードカバーグラスの1つのスロットに新鮮なLeibovitz 10を50 µL加え、直ちに各PCLSを培地に移し、組織が平らに広がるまで静かに操作します。

次に、ピペットを使用して各チャンバーから培地を吸引し、各PCLSを白金ウェイトで固定します。調製直後の氷冷した細胞外マトリックスを各PCLS上に慎重にピペッティングし、ゲルが肺スライスの上に配置され、スライスがゲルの上に浮いていないように注意してください。37°Cで5分間静置した後、スライドを、20倍対物レンズ下で37°Cに設定し、あらかじめ加温しておいた共焦点顕微鏡用チャンバーに移します。

次に、フレーム間の希望の間隔に基づいてzスタックとタイルの範囲を設定します。その際、タイルツールを用いて組織内の関心領域を指定し、センターグリッド設定を用いて視野の中央にサンプルを配置します。CD11b高発現の通常樹状細胞は肺実質に局在し、一方でCD103陽性の通常樹状細胞は主に気道周囲および胸膜下領域に存在します。CD88とCD172aで共染色することで、CD172a陰性・CD88陽性の肺胞マクロファージと、CD172a陽性・CD88陽性の間質マクロファージを区別することが可能です。後者の間質マクロファージは、上皮下領域ではなく、優先的に実質内に位置しています。

よく知られたT細胞マーカーであるCD90.2と、リンパ管新生に必要なマスター転写因子の転写制御下にある導入遺伝子であるTdTomato蛍光タンパク質を共染色することで、肺におけるリンパ構造の同定が容易になります。CD103陽性の従来型樹状細胞は、CD324を発現する気道上皮、リンパ管、および胸膜下領域を含むいくつかの解剖学的領域に見られます。先ほど実演したように、ライブセルイメージングを用いて、細胞の移動や細胞間相互作用を記録することが可能です。

例えば、代表的な実験において、ova-LPSを経口投与してから16時間後、CD103陽性樹状細胞が、養子移殖されたova特異的T細胞と4時間にわたって相互作用している様子を明確に観察できます。習熟すれば、組織調製とスライス技術を適切に行うことで、2時間半で完了させることが可能です。本手順を行う際は、アガロースによる肺の拡張を十分にさせ、その後のイメージングのために、繊細な肺スライスをできるだけ平坦に保持することが重要です。

この手順に続いて、アセチルコリンやメタコリンを用いてPCLSを処理するなどの他の手法を行うことで、さまざまな疾患条件下におけるカルシウムシグナリングや気道収縮性に関するさらなる疑問を解明することができます。このビデオを視聴することで、肺における免疫細胞の局在、トラフィッキング、および相互作用を可視化するための精密切片肺スライスの作製方法について、十分な理解が得られるはずです。