細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。

この蛍光イメージング法の全体的な目標は、膜タンパク質の輸送と細胞内分布の変化をモニターすることです。この手法は、遺伝子変異や薬理学的薬剤が細胞表面での小胞送達速度やタンパク質発現に及ぼす影響など、タンパク質輸送の変化に関する洞察を提供します。この手法の主な利点は、サンプルを破壊することなく、高速で、高解像度で、リアルタイムで測定できることです。

イメージングの48時間前に、マウス神経芽腫2A細胞に、目的のタンパク質の細胞外領域に組み込まれたpH感受性蛍光体であるSEPを含むプラスミドコンストラクトをトランスフェクションします。トランスフェクションした細胞をイメージングする準備ができたら、全反射蛍光またはTIRF顕微鏡法を用いて、2ミリリットルのpH 7.4細胞外溶液またはECSを細胞に加えます。セルの皿を翻訳ステージに置き、ステージマウントを使用して皿を所定の位置に固定します。

落射蛍光モードで、顕微鏡の焦点を合わせ、蛍光トランスフェクションされた細胞を見つけます。セルは、いくつかのフォーカスプレーンにわたってフォーカスされたままになります。TIRFを進めるために、単一の単離された細胞を見つけます。

イメージングプログラムでは、露光時間を200ミリ秒に設定し、EMゲインを設定して蛍光強度を最適化します。ステッピングモーターを使用してレーザービームをTIRFに移行し、ビームを対物レンズ全体に段階的に平行移動します。臨界角が近づくと、ビームは皿の端を横切って目に見えるように平行移動し、サンプル平面上の全反射点に収束し、その時点でビームは皿のエッジに沿って見えなくなります。

フォーカスノブを調整して、セルがTIRFモードになっていることを確認します。TIRFでは、1つの細胞面のみに焦点を合わせることができるため、原形質膜の高解像度で高精細な画像が得られます。この手順を開始するには、イメージング平面内でトランスフェクションされた健康な単一細胞を見つけます。

pH 7.4の細胞の焦点を合わせた画像を取得します。原形質膜と小胞体上のSEP標識受容体が見えるはずです。レーザービームがサンプルに到達するのをすばやくブロックして、光の漂白を防ぎます。

複数のXY位置を記録できる顕微鏡イメージングソフトウェアを使用して、各細胞に対応するステージ位置を記録します。このように、各セルの位置を記録するためにソフトウェアを使用しながら、皿ごとに20〜30個のセルの画像をキャプチャします。pH 7.4のすべての細胞画像が収集されたら、皿に触れずにピペッティングしてpH 7.4 ECSを手動で除去します。

2ミリリットルのpH 5.4 ECSを皿に慎重に加え、10分間待ちます。この間に、以前に取得した画像を保存します。pH 7.4 で画像を収集するために使用したのと同じ条件で、ステージを保存した各位置に移動し、pH 5.4 で同じ細胞の画像を取得します。

検出されたすべての蛍光は小胞体に閉じ込められたSEP標識受容体に由来するため、細胞はあまり明確ではないように見えます。pH 5.4の細胞画像を保存します。単一の小胞挿入をイメージングするには、まずトランスフェクションした細胞の増殖培地を2ミリリットルのpH 7.4 ECSに交換します。

次に、トランスフェクションした細胞のディッシュを顕微鏡のステージに置き、ステージマウントを使用してディッシュを所定の位置に固定します。前に示したように、TIRF で 1 つのセルをフォーカスします。装備されている場合は、撮影期間中にピントがずれないようにオートフォーカスを設定してください。

一連の 1, 000 フレームを記録し、200 ミリ秒のフレームレートで画像を連続的にキャプチャします。この間、低pHの輸送小胞が原形質膜と融合し、SEPが細胞外pH 7.4にさらされるのに対応して、蛍光のバーストが見えます。SEP蛍光の解析を開始して細胞内局在を決定するには、ImageJなどの画像解析ソフトウェアを使用して細胞画像を開きます。

ローリングボール設定を使用して、pH 5.4 と pH 7.4 の両方の画像から背景を差し引きます。強度ベースの閾値を使用して、pH 7.4の単一細胞からの蛍光を定量し、最初に画像を選択し、調整し、閾値を調整します。次に、セルの周囲の関心領域を手動で選択します。

[解析] タブに組み込まれた計測機能を使用して、セル面積、平均強度、および積分密度を計測します。pH 5.4の同じ細胞について、これらの測定を繰り返します。pH 7.4 と 5.4 の両方の細胞画像の積分密度が得られたら、pH 7.4 の値から pH 5.4 の値を差し引いて、原形質膜の積分密度を計算します。

この差は、TIRF励起領域内の原形質膜上の受容体の相対数に対応します。トラフィックの尺度として、原形質膜の積分密度をpH 7.4の総積分密度で割って100を掛けることにより、TIRF励起ボリュームで見える残りの受容体と比較した原形質膜上に位置するSEP標識受容体の相対的な割合を計算します。単一の小胞挿入イベントを分析するには、画像解析ソフトウェアを使用して一連の 1, 000 TIFF 画像を開きます。

ローリングボール設定を使用して、すべてのフレームから背景を差し引きます。記録のカラーバランスを調整して、小胞挿入イベントに対応する強い領域を最大化します。3フレームまたは600ミリ秒以上続く蛍光のバーストを手動でカウントします。

この pH 7.4 の細胞画像の例は、原形質膜と小胞体上に位置する受容体を示しています。pH 5.4では、原形質膜上の受容体は蛍光を発しないため、小胞体常在受容体のみが見えます。pH 7.4 と pH 5.4 での蛍光の積分密度の差は、原形質膜に局在する受容体に対応します。

単一の小胞挿入イベントは、pH 7.4で、少なくとも600ミリ秒持続する原形質膜での蛍光のバーストとして視覚化されます。挿入の直前には、識別可能なバーストは存在しません。蛍光強度の増加は、SEPを運ぶ輸送小胞が到着すると見られます。

その後、SEP標識された受容体は、以前に挿入された受容体と区別がつかなくなるまで、原形質膜を横切って拡散します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、一皿あたり45分で行うことができます。このビデオを見れば、末梢ERと原形質膜との間のタンパク質分布の変化をモニターする方法を十分に理解できるはずです。