Name: のトランスクリプトーム解析 C。エレガンス RNAシーケンスデータ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぼう、C. elegansのRNAシーケンスデータ解析手法。Galaxyプラットフォームを用いて、バイオインフォマティクス専門知識がなくても遺伝子発現データを効率的に解析し、発現変動遺伝子とGene Ontology情報を抽出する方法を解説します。

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著者は、ギャラクシーとDAVIDを開発し、ひいては科学コミュニティのためのNGSが広くアクセス行っている研究室、グループや個人に感謝の意を表したいと思います。当社のバイオインフォマティクストレーニング中にピッツバーグ大学の同僚によって提供されるヘルプやアドバイスが認められています。この作品には賞（AG-NS-0879から12）と国立衛生研究所AGに（R01AG051659）からの助成金を高齢でエリソン医学財団新奨学生によってサポートされていました。

<ol><li>Venter, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The sequence of the human genome.</a> Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25 (9), 1105-1111 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Roberts, A., Trapnell, C., Donaghey, J., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+RNA-Seq+expression+estimates+by+correcting+for+fragment+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias.</a> Genome Biol. 12 (3), R22(2011).</li>
<li>Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+transcripts+in+annotated+genomes+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2325-2329 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+analysis+of+gene+regulation+at+transcript+resolution+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 46-53 (2013).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Biol+Insights%22%5BJournal%5D)">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (1), 29-46 (2015).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem+%28Palo+Alto+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Yang, I. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Whole+Transcriptome+Sequencing+Data%3A+Workflow+and+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software.</a> Genomics Inform. 13 (4), 119-125 (2015).</li>
<li>Khatri, P., Draghici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontological+analysis+of+gene+expression+data%3A+current+tools%2C+limitations%2C+and+open+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ontological analysis of gene expression data: current tools, limitations, and open problems.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3587-3595 (2005).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList%3A+a+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), e20085(2011).</li>
<li>Consortium, C. eS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC Genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Mortazavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+a+Caenorhabditis+nematode+genome+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Scaffolding a Caenorhabditis nematode genome with RNA-seq.</a> Genome Res. 20 (12), 1740-1747 (2010).</li>
<li>Bohnert, R., Ratsch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rQuant.web%3A+a+tool+for+RNA-Seq-based+transcript+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">rQuant.web: a tool for RNA-Seq-based transcript quantitation.</a> Nucleic Acids Res. 38, Web Server issue W348-W351 (2010).</li>
<li>Lamm, A. T., Stadler, M. R., Zhang, H., Gent, J. I., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+RNA-seq+using+single-strand%2C+double-strand%2C+and+CircLigase-based+capture+yields+a+refined+and+extended+description+of+the+C.+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Multimodal RNA-seq using single-strand, double-strand, and CircLigase-based capture yields a refined and extended description of the C. elegans transcriptome.</a> Genome Res. 21 (2), 265-275 (2011).</li>
<li>Amrit, F. R., Ratnappan, R., Keith, S. A., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+lifespan+assay+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The C. elegans lifespan assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 465-475 (2014).</li>
<li>Hsin, H., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+reproductive+system+regulate+the+lifespan+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signals from the reproductive system regulate the lifespan of C. elegans.</a> Nature. 399 (6734), 362-366 (1999).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+germ+line+regulates+distinct+signaling+pathways+to+control+lifespan+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans germ line regulates distinct signaling pathways to control lifespan and innate immunity.</a> J Biol Chem. 285 (3), 1822-1828 (2010).</li>
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<li>Lapierre, L. R., Gelino, S., Melendez, A., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+lipid+metabolism+coordinately+modulate+life+span+in+germline-less%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less.</a> C. elegans. Curr Biol. 21 (18), 1507-1514 (2011).</li>
<li>Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
<li>Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+networks+that+mediate+signals+from+reproductive+tissues+to+influence+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional networks that mediate signals from reproductive tissues to influence lifespan.</a> Genesis. 51 (1), 1-15 (2013).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5 (9), e1000639(2009).</li>
<li>Amrit, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-16+and+TCER-1+Facilitate+Adaptation+to+Germline+Loss+by+Restoring+Lipid+Homeostasis+and+Repressing+Reproductive+Physiology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">DAF-16 and TCER-1 Facilitate Adaptation to Germline Loss by Restoring Lipid Homeostasis and Repressing Reproductive Physiology in C. elegans.</a> PLoS Genet. 12 (2), e1005788(2016).</li>
<li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li>
<li>McCormick, M., Chen, K., Ramaswamy, P., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+that+extend+Caenorhabditis+elegans%27+lifespan+in+response+to+reproductive+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">New genes that extend Caenorhabditis elegans' lifespan in response to reproductive signals.</a> Aging Cell. 11 (2), 192-202 (2012).</li>
<li>Kartashov, A. V., Barski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioWardrobe%3A+an+integrated+platform+for+analysis+of+epigenomics+and+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data.</a> Genome Biol. 16, 158(2015).</li>
<li>Goncalves, A., Tikhonov, A., Brazma, A., Kapushesky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+RNA-seq+data+processing+and+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment.</a> Bioinformatics. 27 (6), 867-869 (2011).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

現代生物学の銀河シーケンシング・プラットフォームの意義ギャラクシープロジェクトは、高速かつ効率的な方法で、高スループット配列決定データを処理し、分析するためのバイオインフォマティクストレーニングなし生物学者を助けることに尽力となっています。一度、この一般的に利用可能なプラットフォームは、単純で信頼性が高く、簡単なプロセスNGSデータを分析するために、複雑なバイオインフォマティクスのアルゴリズムを実行してきた、超人的課題を検討しました。別にバイオインフォマティクスツールの広い範囲をホスティングしているから、ギャラクシーのための成功の鍵はまた、直感的かつシームレスに複雑な配列解析のさまざまな側面を一緒にひもそのユーザーインターフェースのシンプルさです。これらの機能により、銀河のパイプラインは、 線虫の研究者を含め、生物学者の間で幅広い用途を取得しています。 RNA-配列の解析パイプラインをユーザーに習熟することに加えて、ギャラクシーも把握することが基本的な生物学者のための基礎を築くことができますデータ解析の概念とは関係のツールを理解しています。この知見は、おそらくさらに、「...

ヒトゲノムの最初のシーケンシング、フレッド・サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法を用いて行っ、10年かかった、と推定米国$ 3 10億、2を要しました 。しかし、創業以来十年余りで、次世代シーケンシング（NGS）技術は、それが可能2週間以内とUS $ 1,000ヒトゲノム全体を配列決定することになりました。ゲノム配列決定プロジェクトが急速に当たり前になりつつあり、コストの大幅な削減に伴い、信じられないほど効率的にシーケンシング・データ収集の増え続ける速度を許可する新しいNGS機器は、想像を絶する方法で、現代生物学に革命を起こしています。また、これらの開発は、このようなRNA配列決定（RNA-SEQ）、ゲノムワイドなエピジェネティック修飾の研究、DNA-タンパク質相互作用を介して遺伝子発現解析などの多くの他の分野における進歩を亜鉛めっきしており、ヒト宿主における微生物多様性をスクリーニングします。 RNA-SeのNGSベース特に、qはそれが可能精度と感度との包括的トランスクリプトームを識別し、マッピングするために作られており、および発現プロファイリングのための選択の方法として、マイクロアレイ技術を交換しました。マイクロアレイ技術が広く用いられているが、そのようなクロスハイブリダイゼーションを確実に測定することができる発現変化の制限された範囲として、既存の既知のゲノム情報とアレイ、および他の欠点への依存によって制限されます。 RNA-配列は、他方で、、その明確なDNAマッピング性質に低いバックグラウンドノイズを生成しながら、既知および未知の両方の転写物を検出するために使用され得ます。一緒に、このような酵母、ハエ、虫、魚やマウスなどのモデル生物が提供する数多くの遺伝的ツールとRNA-配列は、多くの重要な最近の生物医学の発見のための基盤を務めています。しかし、ストレージの制限、処理、およびすべてのほとんどは、メートルなど、より広い科学コミュニティにアクセスできなくNGSを作る重要な課題のまま、<html>配列決定データの大量のeaningfulバイオインフォマティクス解析。 シーケンシング技術と指数データ蓄積の急速な進歩は、研究者は、アクセス分析し、この情報を理解することができます計算プラットフォームのための大きい必要性を作成しました。初期のシステムは、コンピュータプログラミングの知識に大きく依存していたのに対し、非プログラマがアクセスし、洗練された分析を許可しなかったデータを視覚化することができ、このようなNCBIなどのゲノムブラウザ。 Webベースのオープンアクセスプラットフォーム、ギャラクシー（ <a href="https://galaxyproject.org/" target="_blank">https://galaxyproject.org/</a> ）は、この間隙を充填しNGSデータを処理して、簡単に複雑なのスペクトルを実行するために、研究者を可能に貴重なパイプラインであることが証明されましたバイオインフォマティクス分析します。ギャラクシーはアントンNekrutenko（ペンシルベニア州立大学）、ジェームズ・テイラーの研究室で、最初に設立され、維持されている（ジョンズホプキンス大学）F &quot;&gt; 3。ギャラクシーは。それRNA-配列研究に関わるすべてのステップを含む無数のバイオインフォマティクスのニーズ、のための『ワンストップショップ』を作る計算タスクの広い範囲を提供していますそのサーバー上のどちらかのデータ処理を実行するためにユーザーをItallowsローカルに自分のマシン上で。データとワークフローを再現し、共有することができます。オンラインチュートリアル、ヘルプセクション、およびウィキページ （ <a href="https://wiki.galaxyproject.org/Support" target="_blank">https://wiki.galaxyproject.org/Support</a>ギャラクシープロジェクト専用）は、一貫したサポートを提供しています。しかし、初めてのユーザーのために、特になしバイオインフォマティクストレーニングを持つものは、パイプラインが困難な表示されることと自己学習や習熟の過程は時間がかかることがあります。また、生物学的システムを検討し、実験や方法の詳細は、インパクトを使用しますいくつかのステップでは、分析の決定、およびこれらの命令なしにナビゲートすることは困難。 全体的にRN<html> -配列ギャラクシーワークフローは、データのアップロード及びRNA-配列データ解析10の異なる段階のために必要な様々なツールの集合であり、Tuxedoのスイート4、5、6、7、8、9を用いて分析を行っ品質チェックから成り11、12、13、14。典型的なRNA-配列実験は、実験の部（試料調製、mRNA単離およびcDNAライブラリーの調製）、NGSおよびバイオインフォマティクスデータ解析から成ります。これらのセクション、ギャラクシー・パイプラインに含まれるステップの概要を、 図1に示されています。 3fig1.jpg」/&gt; 図1：RNA-配列のワークフローの概要。 2つのウォーム株（AとB、オレンジと緑の線、矢印、それぞれ）の遺伝子発現プロファイルを比較するために、RNA配列の実験に関わる実験及び計算ステップの実例。ギャラクシー利用の様々なモジュールは、赤色で示さ我々のプロトコルに対応するステップとボックスで示されています。各種操作の出力は、青色で示されたファイルフォーマットに灰色で書かれています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55473/55473fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> タキシードSuiteの最初のツールは、「 トップハット 」と呼ばれるアライメントプログラムです。これは、NGS入力は小さな断片に読み取り、参照ゲノムにマップし破壊します。この2段階プロセスはそれがそのアライメントさもなければジすることができるイントロン領域にまたがる読み出し保証しますsruptedまたはを占め、マッピングされている逃しました。これは、カバレッジを増加させ、新規なスプライス部位の同定を容易にします。 トップハット出力は2つのファイル（ゲノム位置を含むスプライス部位に関する情報を）BEDファイルと（各読み取りのマッピングの詳細を）BAMファイルとして報告されます。次に、BAMファイルは「 カフス」と呼ばタキシードスイートで、その後のツールを使用して、各サンプル内の個々の転写物の豊かさを推定するために、参照ゲノムに対して整列されます。 カフス機能の完全長転写物の断片または全ての遺伝子のための入力データで可能なすべてのスプライスバリアントにまたがる「transfrags」を報告してアライメントをスキャンすることもできます。これに基づいて、それは、配列決定される各サンプルの（すべての遺伝子について遺伝子当たり生成されたすべての転写物のアセンブリ）「トランスクリプトーム」を生成します。これらのカフスアセンブリは、その後崩壊し、再と一緒にマージされていますフェレンスゲノムは次のツール、「Cuffmerge」を使用して、下流の差分分析のための単一の注釈ファイルを生成します。最終Cuffmerge出力ファイルに各試料のトップハット出力を比較することにより、 サンプル間の最後に、「Cuffdiff」ツール測定示差遺伝子発現（ 図1）。 カフリンクスは FPKM / RPKM使用する転写物の存在量を報告した値を（フラグメントを/マッピングされた百万分の転写物のパーキロベースは読み取り読み込み）。遺伝子の長さ（カウントがレベルを比較するために、遺伝子の長さについて正規化されなければならないので、遺伝子は、異なる長さを有する（参照ゲノムに整列サンプルからの読み取りの平均数）これらの値は、深さの生NGSデータの正規化を反映して遺伝子間）。 FPKMとRPKMはFPKMをするために使用され、一方、すべての読み取りが、単一のフラグメントに対応するシングルエンドのRNA配列のために使用されてRPKMと本質的に同じですそれは、2つの同一の断片に対応することができる読み出すという事実を占めるように、ペアエンドRNA-配列。最終的に、これらの分析の結果は、差動的条件および/または試験された株の間に発現された遺伝子のリストです。 成功したギャラクシーの実行が完了すると「遺伝子リスト」が生成されると、次の論理的なステップは、データセットから意味のある知識を推定するために分析するより多くのバイオインフォマティクスが必要です。多くのソフトウェアパッケージは、DAVID（注釈、可視化と統合発見のためのデータベース）15として一般的に利用可能なウェブベースの計算パッケージを含む、このニーズに応えるために登場しました。 DAVIDは、その統合された生物学的な知識ベースにアップロードされた遺伝子のリストを比較し、遺伝子リストに関連する生物学的注釈を明らかにすることで、高スループットの研究から大きな遺伝子リストに生物学的な意味を割り当てることが容易。これは、IDEにすなわち 、テストは、濃縮分析が続いています任意の生物学的プロセスまたは遺伝子クラスが統計的に有意な様式で遺伝子リスト（S）に過剰出現した場合ntify。それは広いため、統合された知識ベースと「遺伝子リスト10」を 、16由来のゲノムの中に豊かな生物学的なテーマを検出するために、研究者を可能にする強力な分析アルゴリズムの組み合わせの一般的な選択肢となっています。さらなる利点は、任意のシーケンシングプラットフォームと非常にユーザーフレンドリーなインターフェースで作成された遺伝子リストを処理する能力が含まれます。 線虫線虫（Caenorhabditis elegans）もこのような小さなサイズ、透明体、シンプルなボディープラン、遺伝的および分子解剖の文化や偉大な従順の容易さなどの多くの利点のために知られている遺伝モデルシステムです。ワームは、既知のヒト相同体17で40％保存された遺伝子まで含む、小さな単純でよく注釈付きのゲノムを有します。実際、C.エレガンス最初のゲノム完全18を配列決定した後生動物、およびRNA-配列は、生物のトランスクリプトーム19、20をマッピングするために使用された第一の種の一つでした。初期のワームの研究では、技術21、22の発展に貢献したハイスループットRNAキャプチャ、ライブラリ準備およびシーケンシングだけでなく、バイオインフォマティクスパイプラインのためのさまざまな方法で実験を関与します。近年では、ワームでRNA-配列ベースの実験が当たり前になってきました。しかし、伝統的なワームの生物学者のためのRNA-配列データのコンピュータ分析によってもたらされる課題は、技術のより大きな、より良い利用のための主な障害のまま。 本稿では、 線虫から生成されたハイスループットRNA-配列データを分析するギャラクシー・プラットフォームを使用するためのプロトコルを記載しています。多くの初めて小SCAのためのルユーザー、RNA-配列実験を実施するための最もコスト効率と簡単な方法は、実験室でRNAを分離し、シーケンシングcDNAライブラリーとNGS自体の製造のために、市販の（または社内）NGS施設を利用することです。したがって、まず、RNA配列のためのC.エレガンス RNA試料の単離、定量および品質評価に必要な手順を詳述しています。次に、位置合わせ、アセンブリ、および遺伝子発現の示差定量続くポストシークエンス品質管理チェックのテストから始まる、NGSデータの分析のためにギャラクシー・インターフェースを使用するための手順を提供します。加えて、我々はDAVIDを用いて、生物学的濃縮の研究のための銀河から生じた遺伝子リストを精査する方向が含まれています。ワークフローの最後のステップとして、私たちは、このようなNCBIのシーケンス読むアーカイブ（SRA）（などの公開サーバへの上にRNA-配列データをアップロードするための手順を説明し<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra" target="_blank">ます。http：//ワット</a>ww.ncbi.nlm.nih.gov/sra）科学界にそれが自由にアクセスできるようにします。全体的に、我々はこの記事では、ワーム初めてRNA-配列実験を行っ生物学者だけでなく、少数のサンプルを実行している頻繁にユーザーに包括的かつ十分な情報を提供することを期待しています。

<table><tbody><tr><td>RNaseスプレー&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール&nbsp;</td><td>アンビオン</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ソニックスビブラセル&nbsp;</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A416P-4</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコンラボ</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー水&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Mac/PC</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

のトランスクリプトーム解析<em&gt; c</em&gt;。<em&gt;エレガンス</emギャラクシープロジェクトのタキシードスイートを通じて&gt; rnaシーケンスデータ

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

次世代シーケンシング（NGS）技術は、生物学的な調査の性質に革命をもたらしてきました。これらのうち、RNAシークエンシング（RNA-配列）は、遺伝子発現分析およびトランスクリプトームマッピングのための強力なツールとして浮上しています。しかし、RNA-配列データセットを処理することは、高度な計算の専門知識を必要とし、生物学の研究者のための固有の課題を提起します。このボトルネックは、バイオインフォマティクスのスキルを持たないユーザは、RNA-配列データを分析することを可能にするオープンアクセスギャラクシープロジェクト、および注釈用のデータベース、可視化、および統合されたディスカバリー（DAVID）、助け遺伝子オントロジー（GO）用語分析スイートによって軽減されました大規模なデータセットからの生物学的意味を導き出します。しかし、初めてのユーザーとバイオインフォマティクスアマチュア、これらのプラットフォームでの自己学習や習熟のための時間がかかり、困難なことができます。私たちは、 線虫の研究者は、ワームのRNAを単離するのに役立ちます簡単なワークフローを記述し、RNA-配列実験を行いますそして、ギャラクシーとDAVIDのプラットフォームを使用してデータを分析します。このプロトコルは、濃縮のためにスクリーニングすることができる遺伝子のリストを生成するために、各ステップでのパラメータをユーザに案内する、生NGSデータ、品質管理チェック、位置合わせ、及び示差遺伝子発現分析にアクセスするための様々なギャラクシーモジュールを使用するための段階的な指示を提供しますDAVIDを用いた遺伝子クラスまたは生物学的プロセス。全体的に、我々はこの記事が初めてRNA-配列の実験と同様に少数のサンプルを実行している頻繁にユーザーを行っC.エレガンスの研究者に情報を提供することを期待しています。

C.エレガンスでは、生殖細胞系列幹細胞（GSCs）の除去は、寿命を延長する、ストレスの回復力を高め、体脂肪24、28が上昇します 。レーザアブレーションによって、又はそのようなGLP-1などの変異によってもたらさGSCsの損失、のいずれかが、転写のネットワーク29を因子の活性化を介して寿命延長を引き起こします。一つのそのような因子、TCER-1は、ヒト転写伸長およびスプライシング因子、TCERG1 30のワームのホモログをコードします。以下の代表的な結果は、RNA配列は、その発現が我々の最近発表された研究31における生殖系列損失以下TCER-1 / TCERG1によって調節される遺伝子を同定するために使用された方...

ギャラクシーとDAVIDバイオインフォマティクストレーニングなしの研究者が分析し、RNA-配列データを解釈できるようにする一般的なツールとして浮上しています。私たちは、 線虫の研究者は、アクセスをRNA-配列実験を行い、銀河を使用してデータセットを処理し、DAVIDを用いた遺伝子リストから意味のある生体情報を取得するためのプロトコルを記述します。

のトランスクリプトーム解析<em&gt; C</em&gt;。<em&gt;エレガンス</emギャラクシープロジェクトのタキシードスイートを通じて&gt; RNAシーケンスデータ

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

このプロトコルの全体的な目標は、バイオインフォマティクスの専門知識を持たないC.elegansの研究者が、オープンアクセスプラットフォームであるGalaxyを使用してRNAシーケンシング実験を行い、データを分析できるようにすることです。この方法は、複雑なハイスループットシーケンシングデータを解析し、C.elegansの表現型の背後にあるトランスクリプトームシグネチャーに関する洞察を提供するのに役立ちます。この手法の主な利点は、バイオインフォマティクスのトレーニングを受けていない科学者が生のシーケンシングデータを分析し、差次的に発現する遺伝子のリストとそれに関連する遺伝子オントロジー用語を作成できることです。この方法は、特にC.elegansシーケンシングデータのニュアンスを対象としていますが、ゲノムの主要な転写変化を調べる必要がある他の生物や生物学的状況にも適用できます。このビデオでは、Galaxy パイプラインの Web ベースの使用法を扱っています。可能であれば、ワークフローをローカルで実行します。Wikiページの指示に従ってGalaxyをダウンロードしてインストールします。Galaxyのホームページにあるstart hereチュートリアルを利用した後、このビデオに従ってください。ユーザーは、Galaxyユーザーインターフェイスとワークフローで使用されるツールに慣れ、向きを整えることが重要です。まず、ヘッダーパネルの「データの分析」をクリックして、分析ホームビューにアクセスします。右上のプログレスバーは、ディスクスペースの使用量を監視します。次に、左パネルのツールメニューにアクセスし、NGS RNA解析をクリックします。これにより、RNA配列データの解析に必要なすべてのツールを使用するオプションが提供されます。次に、新しい分析履歴を開始します。右側の履歴パネルに移動します。歯車のアイコンをクリックし、ポップアップメニューから[新規作成]オプションを選択します。次に、分析を識別するために履歴の下に名前を指定します。続行するには、ツールメニューに移動し、[データの取得]で[ファイルのアップロード]機能をクリックして、生の高速キューファイルをアップロードします。解析インターフェースでタスクが開いたら、[ローカルファイルの選択]をクリックするか、[FTPファイル]をクリックして適切なシーケンスデータに移動し、選択します。デフォルトでは、Galaxyはファイルタイプを自動的に検出します。次に、プルダウンメニューから生物(この場合はC.elegans)を選択します。次に、[開始]をクリックしてデータのアップロードを開始します。ファイルがアップロードされると、アクションは履歴パネルに保存され、そこからデータを選択してアクセスできます。次に、NGS QCおよび操作メニューにアクセスし、ファストキューグルーマーを選択し、グルーミングするファイルの下のファイルを選択して、ファイルを一度に1つずつ高速キュー形式から高速キューサンガー形式に変換します。適切な入力の高速等価スコア タイプを選択し、デフォルトのパラメーターを使用してツールを実行します。これで、データファイルを分析できます。プロトコル全体で使用されるファイル形式とテストパラメータには特に注意してください。この知識は、失敗したテストやその他の問題のトラブルシューティングに役立ちます。先に進む前に、品質管理テストを使用することができます。それらの実行の詳細については、テキストプロトコルで提供されています。ファイルを解析する準備ができたら、まずNGS RNA解析セクションを開き、次にトップハットツールをクリックして、シーケンシングデータをマッピングします。ドロップダウンメニューから、「このシングルエンドデータかペアエンドデータか」という質問に対する回答を入力します。次に、適切な高速キュー ファイルを選択します。次のドロップダウンメニューで[組み込みゲノムを使用]を選択し、参照C.elegansゲノムデータを選択します。他のすべてのパラメータオプションに対して「デフォルト」を選択し、「実行」をクリックします。データセット内の転写産物の相対的な存在量を推定するには、NGS RNA解析セクションのカフリンクスツールを選択し、最初のドロップダウンメニューから、トップハット解析から取得したマッピングされた受け入れられたhits bam形式のファイルを選択します。2 番目のドロップダウンメニューから、現在のゲノムデータを含む GTF ファイルに参照アノテーションを設定します。[バイアス補正の実行] オプションが表示されたら、[はい] を選択し、既定の設定を使用してタスクを実行します。次に、NGS RNA解析メニューからカフマージツールを開き、すべてのRNA配列サンプルで生成されたアセンブルされた転写産物をマージします。ツールの最初のボックスには、前のステップでカフスボタンを使用して生成されたすべてのGTFファイルがロードされます。次に、同じ菌株条件の生物学的複製を含む、試験した各菌株または条件について、アセンブルされた転写産物ファイルを選択します。ユーザー参照アノテーションには「はい」を選択し、参照ゲノムデータファイルを選択します。次に、シーケンスデータの使用オプションで はい を選択します。これにより、適切な参照ゲノムが自動的に検出され、選択されます。他のすべてのパラメータはデフォルト設定のままにして、[実行]をクリックします。1 つの GTF ファイルが生成されます。複数の菌株または条件を比較するには、NGS RNA解析セクションに戻り、cuff divツールを選択します。次に、cuff div ツールのトランスクリプト メニューから、cuff merge からマージされた出力ファイルを選択します。次に、2 つの条件のラベルを入力します。各条件について、replicate に移動し、その条件の異なる生物学的反復に対応する top hat からの個々の受け入れられたヒット出力ファイルを選択します。複数のファイルを同時に選択するには、コマンドキーまたはコントロールキーを押したままにします。ファイルを選択したら、デフォルトのパラメータ設定を使用し、[実行]をクリックしてタスクを実行します。ヒストリーパネルに生成された遺伝子鑑別検査ボックスの保存アイコンをクリックして、差次発現データをダウンロードします。まず、WebサイトからDavidにアクセスします。Web ページのヘッダーから [分析の開始] を選択します。Galaxyから取得した遺伝子のリストをボックスAにコピーし、この例では遺伝子識別子をworm base gene IDとして選択し、質問3のリストタイプでgene listを選択し、リストの送信アイコンをクリックします。これで、分析ウィザードのホームページが開き、そこからDavidタスクを選択できます。このビデオ セグメントでは、これらのオプションの一部について説明します。まず、機能アノテーションクラスタリングを選択して、サマリーページに移動します。アノテーションカテゴリはデフォルト設定のままにして、機能アノテーションクラスタリングをクリックします。このオプションは、エンリッチメント スコアによってランク付けされた類似の注釈用語のクラスターを生成します。ここで、解析ウィザードに戻り、機能アノテーションチャートオプションを選択して、遺伝子リストに関連付けられた大幅に過大評価された生物学的用語を特定します。Davidの貴重な機能は、機能的な注釈テーブルを作成するオプションです。これは、統計計算を表示せずに、遺伝子に関連付けられているすべてのアノテーションをリストします。これは、遺伝子ごとの解析や、目的の特定の遺伝子を見つけるのに役立ちます。レビューに便利な別のDavidツールは、遺伝子の機能分類です。このオプションは、遺伝子を機能的に関連するグループのリストに分離し、その濃縮スコアによってランク付けします。記載されたプロトコールを使用して、生殖細胞系の喪失後にtcer-1によって発現が調節される遺伝子を同定した。長命の生殖細胞系リストglp-1変異体のトランスクリプトームを、生殖細胞系リストに掲載されているが寿命延長を示さないtcer-1 glp-1二重変異体と比較しました。配列の品質チェックでは、低品質の読み取りはなく、GC含有量は48〜49%で、配列の読み取り長は51塩基対が一定でした。サンプルのゲノムカバレッジは、7倍から11倍の間と推定されました。Galaxyは、各系統の2つの反復からのNGSデータの組み合わせを可能にし、示差解析を実行して、ゲノムワイドな発現プロファイルを強調する遺伝子リストを生成しました。全体として、835個の遺伝子が2つの系統間で差次的に発現し、P値が0.05にカットオフされました。アップレギュレーションされた遺伝子の機能的アノテーション解析により、エンリッチメントスコアの高い4つのアノテーションクラスターが明らかになりました。最も高かったのは、シトクロムP450と生体異物応答遺伝子を含み、次いで脂質修飾に関与する遺伝子でした。ダウンレギュレーションされたターゲットの機能的アノテーションクラスタリングも、さまざまなアノテーションクラスターを特定しました。これらには、細胞骨格機能、成長の正の調節、生殖、および老化に富んだクラスターが含まれていました。Galaxyパイプラインは、幅広い生物学分野の研究者が大規模な遺伝子発現変化を迅速かつ効率的に解析するための道を開きました。このビデオを見た後、RNAシーク実験を行い、Galaxyパイプラインを使用して生のハイスループットシーケンシングデータを分析できるようになるはずです。また、Davidプラットフォームを使用して、Galaxyデータから生物学的に関連性のある情報を抽出できる必要があります。

transcriptomic-analysis-c-elegans-rna-sequencing-data-through-tuxedo

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

RNA-Seq解析は、非モデル生物の適応形質の分子基盤を特定するためにますます重要になってきています。ここでは、蚊の飼育からRNAシーケンシング、RNA-Seqデータのバイオインフォマティクス解析まで、休眠時と非休眠型のAedes...

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

このプロトコルを記述する一般的なプロセスと品質管理チェック液滴ベース、高スループット単一細胞 RNA シーケンス準備のため健康な成体哺乳類単一細胞を準備するために必要です。パラメーターのシーケンス、読み取りの配置、およびダウン...

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

本質的に障害が発生したドメインは、発癌性融合転写因子機能にとって重要である。これらのタンパク質を治療的に標的にするためには、これらのドメインで採用される調節機構のより詳細な理解が必要である。ここでは、Ewing肉腫における本質的に無秩序なEWSドメインの重要な構造的特徴をマッピングするために、トランスクリプトミクスを使用する。...

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

このプロトコルの目的は、RNAシーケンシングデータを用いて候補遺伝子の進化と発現を調べるものです。...

RNA-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン

ここで示すプロトコルは、高度な統計分析アプローチへの品質管理と前処理のステップを含む、生の読み取りから機能分析までのRNAシーケンシングトランスクリプトームデータを分析するための完全なパイプラインを説明しています。...

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぼう、C. elegansのRNAシーケンスデータ解析手法。Galaxyプラットフォームを用いて、バイオインフォマティクス専門知識がなくても遺伝子発現データを効率的に解析し、発現変動遺伝子とGene Ontology情報を抽出する方法を解説します。

のトランスクリプトーム解析

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