遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

このイメージングアプローチの全体的な目標は、遺伝的にコードされた新しいクラスの蛍光一酸化窒素プローブであるgeNOpsを使用して、個々の細胞レベルで一酸化窒素シグナルをリアルタイムでモニタリングすることです。生物学および生理学における一酸化窒素の重要性を考慮すると、この分子が発見されて以来、細胞レベルまたは細胞内レベルでの視覚化が望まれてきました。私たちは、新しい、かなり単純な構造の蛍光タンパク質ベースのプローブであるgeNOpsを使用して、一酸化窒素シグナルを視覚化します。

geNOpsは、蛍光クエンチにより一酸化窒素に直接かつ即座に反応します。これは、単一細胞における一酸化窒素の生成、拡散、および分解のリアルタイムな動態をモニターできることを意味します。geNOpsの主な利点は、従来の蛍光顕微鏡を使用して、実際に高い空間的および時間的分解能で一酸化窒素シグナルを見ることができることです。

この手順は、内皮細胞株またはHEK293細胞の保存バッファーを、室温で鉄(II)ブースター溶液のウェルあたり1ミリリットルに置き換えることから始めます。細胞を暗闇で正確に20分間インキュベートします。鉄のローディング手順は、プローブの完全な応答性を得るために不可欠であり、さまざまな細胞タイプやアプリケーションに適応できる可能性があります。

その後、細胞を保存緩衝液で一度洗浄し、各ウェルを2ミリリットルの保存緩衝液と室温で少なくとも2時間インキュベートして、細胞を平衡化させます。次に、1ミリリットルの貯蔵バッファーで貯蔵バッファーを3.3マイクロモルのFura-2AMに交換します。細胞を光から保護し、45分間インキュベートします。

45分後、細胞を保存緩衝液で2回洗浄し、再度少なくとも30分間インキュベートして細胞を平衡化させます。手順を開始するには、まず、内皮細胞株またはHEK293細胞でコーティングされた30ミリメートルのカバーガラスを金属灌流チャンバーに固定します。イメージングシステムのスイッチを入れ、金属灌流チャンバーを顕微鏡上に置きます。

流入チューブをバッファーリザーバーに接続し、灌流システムの電源を入れます。次に、エフラックスを真空ポンプに接続し、一貫した流れを確保し、カバースリップの排出を回避します。半自動灌流システムを使用して、生理的カルシウムバッファーによる重力駆動灌流を開始します。

次に、それぞれのソフトウェアを使用してイメージング設定を定義します。Fura-2イメージングには340ナノメートルと380ナノメートル、G-geNOpの励起には480ナノメートルの励起波長を選択します。次に、顕微鏡のxyzテーブルを動かして、いくつかの蛍光細胞に焦点が合うまでイメージング領域を選択します。

次に、関心領域を定義します。各イメージングフィールドについて、いくつかの単一蛍光細胞全体をカバーする領域を描画します。その後、同様のサイズの背景領域を定義します。

電動サンプルステージと単色光源を備えた倒立型蛍光顕微鏡でデータ収集を開始します。あるいは、Fura-2AMでは340ナノメートル、G-geNOpでは480ナノメートルで細胞を励起します。すべてのチャンネルで明確な蛍光シグナルが経時的に検出できるように、それぞれの露光時間を設定します。

Fura-2AMは510ナノメートル、G-geNOpは520ナノメートルで、500ナノメートルの励起器、495ナノメートルのダイクロイック、510-520ナノメートルのエミッターからなる適切なフィルターセットを備えたCCDカメラを使用して、放出された光を収集します。次に、3秒ごとに合計1フレームを記録します。最初の3分間を生理的カルシウムバッファーに記録し、それぞれの蛍光シグナルのベースラインを取得します。

安定したベースライン蛍光が観察されたら、100マイクロモルのヒスタミンまたは生理的カルシウム緩衝液を含むATPに切り替えて、細胞を3分間刺激します。その後、ヒスタミンまたはATPおよびL-NNAを含まない生理的カルシウム緩衝液に5分間切り替えて、細胞から化合物を除去します。その後、灌流システムを使用して、生理的カルシウム緩衝液に10マイクロモルのNOC-7を2分間投与します。

一酸化窒素供与体はG-geNOp蛍光に強く影響し、通常、10マイクロモルのNOC-7に応答して細胞を20%以上減少させます。EA.hy926細胞では、NOC-7効果はアゴニスト誘導性G-geNOp蛍光クエンチと比較して強くなります。その後、一酸化窒素放出化合物を生理的カルシウム緩衝液で約10分間洗い流し、基礎蛍光が回復したら記録を停止します。

ここには、Fura-2AMをロードしたG-geNOpを発現するEA.hy926細胞の代表的な広視野蛍光画像を示します。そして、ここには、100マイクロモルのヒスタミンに応答したFura-2信号とG-geNOp信号の同時記録の代表的な時間経過です。示されているように、ヒスタミンは灌流システムを使用して3分後に除去されました。

これらの曲線は、G-geNOpを一過性に発現する単一のFura-2AM負荷内皮細胞の細胞質カルシウムシグナルと一酸化窒素シグナルの同時記録を表しています。細胞をカルシウム含有緩衝液中で100マイクロモルのヒスタミンで3分間刺激した。そして、ここに示されているのは、測定前に500マイクロモルのL-NNAで前処理されたEA.hy926細胞の経時的に同時に記録された代表的なカルシウムと一酸化窒素のシグナルです。

細胞は、2ミリモルカルシウムの存在下で100マイクロモルのヒスタミンで処理されました。この図は、1マイクロモルのATPとそれに続く100マイクロモルのATPによる2番目の細胞刺激に応答した細胞質一酸化窒素シグナルを表す平均曲線を示しています。この手法を習得すると、最小限の労力で一酸化窒素信号をリアルタイムで視覚化できます。

この技術は、研究者がさまざまな細胞モデルにおける一酸化窒素シグナルを探求し、再研究するための道を開くと信じています。このビデオを見れば、geNOpsテクノロジーを使用してモデルシステム内の一酸化窒素をリアルタイムでイメージングする方法を十分に理解できるはずです。