Name: 新しい方法を用いた自由に動く新生児ラットの脳波記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶ新生児ラットの脳波記録法。自由に動くp8～p15の仔ラットから1週間以上安定した高品質なEEG信号を記録し、新生児てんかんや神経病理学の診断に役立つ革新的な電極セットアップ技術です。

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この研究は、中国の自然科学財団（31171355）および広東の自然科学財団（S2011010003403,2014A030313440）によって支持された。

動物のケア、外科手術および記録手順は、南中国師範大学の動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従った。 電極調製（図1A〜C） 注記：コンピュータピンの軌跡は、通信デバイスの信号インタフェースの一部としての単なる接触です。それは、雌コネクタに差し込まれる雄コネクタからなる。 <ol><li>ピンサーの助けを借りて、雄と雌のピンをコンピュータピンの軌跡（ 図1A ）から慎重に分離します。オスとメスのピンを一緒に接続して電極を形成し、シアノアクリレートを塗布して強力な接着結合を作ります（ 図1C ）。 </li><li>電極を蒸留水で満たしたビーカーに入れ、超音波洗浄機に10分間置いてください。 45℃の乾燥オーブンに30分間移動してください。 UV光を用いて30分間電極を滅菌する。 </li></ol>手術手順（図1D〜F） <ol><li>滅菌された外科用器具および定位固定装置を準備する。空気でイソフルラン麻酔（2.5％）を用いて新生児ラットの仔犬を麻酔する。子犬が深く麻酔をかけられたら、イソフルランの用量を1.0％に調整します。適切な麻酔深度を確保するために、手術前に尾またはつまみを締めてください。 </li><li>イヤーバーを外耳道の中に入れ、わずかに締め付けることによって、定位固定装置内の幼児の頭を固定する。 注：新生児の頭蓋骨は非常に柔らかいので、イヤーバーを過度に締めすぎないでください。 </li><li>すべての装置に70％エタノールを噴霧することにより、無菌の手術野を維持する。メスを使用して頭部に15 mmの切開を行います。鉗子を使用して、静かに四隅の正中線から頭皮を引き離します。切開部を広く開いたままにするために、生理食塩水に浸した綿を皮膚の下に置きます（ 図1D ）。 </li><li>頭蓋骨のブレグマとラムダ点を見つけるそれらを鉛筆でマークしてください。シリンジ針（26G）を使用して、前頭前野皮質（PFC）と海馬に2つの穴をあけます。 注：Pregは、ブレグマの後ろ1.8mmおよび正中線の-0.5mmの側に位置するが、海馬はブレグマの前-2.0mmおよび正中線の±0.5mmに位置する（ 図1DおよびE ）。脳の損傷を最小限に抑えるために、電極の深さは皮質表面の2mmを超えてはならない。 </li><li>電極を保持するために鉗子を使用し、PFCおよび海馬に参照電極および記録電極をそれぞれ挿入する。エリスロマイシン軟膏を電極の周囲に塗布して、感染を避ける。シアノアクリレートを用いて電極を固定する。 </li><li>歯科用アクリルセメントを準備して、粘りと粘りのある一貫性があるようにします。電極と頭蓋骨の残りの部分を覆うように歯科用セメントを塗布します。 注：歯科用セメントを塗布する前に、頭蓋骨を完全に乾燥させます。 </li&gt; <li> 5％ピクリン酸を電極に塗布して保護します。 注：滅菌条件を維持するためには、手順全体をバイオセーフティフードで行う必要があります。 </li><li>定位固定フレームから動物を取り出し、300μLの10％グルコースを皮下注射する。加熱した毛布に置き、回復させます。動物が暖かい（37℃）、歩行可能である（ すなわち、完全に回復した）ことを確認する。手術後の痛みに対してブプレノルフィンを腹腔内投与する（0.05mg / kg）。 注意：十分な意識（すなわち、正常な行動や動き）を回復するまで、動物を放置しないでください。 </li><li>意識を取り戻した後、ダムを持ってその家のケージに子犬を戻してください。動物が完全に回復するまで2日間待ちます。 </li></ol> 3.脳波記録<ol><li>完全に回復した後、仔犬の頭蓋骨に埋め込まれた電極を、それ自身のケージ内の増幅器に接続する。アンプをアナログ/デジタル変換器に接続します。コンバータをコンピュータに接続します。接続線は絡み合わないように注意深く取り扱わなければなりません。 </li><li>記録のためにデータ取得ユニットで少なくとも10,000 Hzのサンプリングレートを選択します（トランスミッタの帯域幅は1〜100 Hzです）。データが適切にサンプリングされていることを確認してください。 </li><li>ベースライン記録を得た後、カイニン酸（KA）（2mg / kg）を腹腔内に注射して、てんかん発作を誘発する。 KA注射の15分後に、てんかん発作を観察し、記録する。 KAによる発作は通常肉体的である。 注：発作持続時間は約15.2±0.9秒であり、発作持続時間は約62±5秒である。新生仔ラットでは、抱水クロラール（400 mg / kg）をIP注射することにより発作を予防することができます。 </li><li>デジタル化されたデータを保存し、spike2などの信号処理ソフトウェアパッケージを使用して解析します。 perfによって新生児のEEG信号の異なる周波数成分のパワーレベルを明らかにするパワースペクトル分析を行うこと。 1から100 Hz（EEGバンド）までの二乗平均平方根振幅を求めることによって、1分の時間枠でパワーを計算する。 </li></ol>

<ol><li>Pereda, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+and+their+functional+interactions+with+chemical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).</li>
<li>Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+behaving+animals--going+beyond+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).</li>
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<li>Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+of+interictal+epileptiform+discharges+in+long-term+EEG+recordings+in+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients.</a> Seizure. 29, 20-25 (2015).</li>
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<li>Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Continuous+EEG+Monitoring+in+Small+Rodent+Models+of+Human+Disease+Using+the+Epoch+Wireless+Transmitter+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System.</a> J Vis Exp. (101), e52554(2015).</li>
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<li>Dzhala, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKCC1+transporter+facilitates+seizures+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain.</a> Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).</li>
<li>Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+amplitude-integrated+electroencephalography+and+interburst+interval+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat.</a> Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).</li>
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<li>Cuaycong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+the+study+of+hypoxia-ischemia-induced+clinical+and+subclinical+seizures+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat.</a> Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).</li>
</ol>

著者らは、利害の対立を宣言していない。

ここでは、自由に動く新生児ラットの仔犬をEEGで取得するための手術と記録の手順を有線方式で報告する（ 図3 ）。 P7-P12ラットの子犬は、満期のヒト新生児に対応する発達年齢であることが示唆されている10,11 。この年齢層のラットの仔犬と一緒に作業する場合、高品質のEEG記録データを得ることは技術的に困難です。さらに特殊な取り扱いと大きな注意が必要です8 。 新生仔ラットにおけるインビボ EEG記録を調べている以前の研究は、P12またはより古い動物の有線記録溶液を用いて実施されてきたが、これらのアプローチは非常に高価である。シンプルな電極に頼ることで、実験のコストを$ 1に抑えながら高密度の脳波を与える電極を作ることができました（ 図1 ）録音。手術の複雑さにもよるが、この方法の外科移植は、わずか10分かかることがある。 このプロトコルの重要な...

正常な脳機能を得るためには、ニューロン間の連続的な通信が必要であることは十分に確立されている。神経細胞間通信は、主にシナプスで行われ、シナプスでは、1つのニューロンからの情報が第2のニューロンに伝達される。このシナプス伝達は、電気的または化学的シナプスの2種類の専用構造配置によって媒介される。電気生理学は、身体全体の機能や行動を制御する、インターナルコミュニケーションの間に生成される電位を捕捉する分野です。 EEGは、多くの電気生理学的手法の中で最も一般的に使用される方法である。 EEGは、内部刺激または外部刺激によって生成された電気信号の変化を検出するために使用される技術である。さらに、それは、てんかん、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの様々な神経学的状態の臨床診断および予後予測のための必須試験であるeならびに薬理学的および毒物学的作用物質の影響3 。一般に、てんかん患者は、過興奮性および脳内の機能的連結性を損なう。これらは、間質性てんかん様放電（IED）として要約され、鋭く過渡的なスパイクの形態でEEGによって記録することができる。鋭い波;スパイク波複合体;またはポリスピーク4 。てんかんの脳の主な特徴は、発作5の原因となる脳領域の位置を特定するために、頭皮または脳実質から記録できる、てんかん発作の自発的発生である5 。さらに、脳波はまた、アルツハイマー病（AD）のような神経変性障害において非常に重要な意味を有する。研究によれば、AD患者の脳波記録の変化および振動ネットワークの障害が一般的であることが示唆されている。しかしながら、神経変性疾患iにおけるネットワーク振動の病態生理学に関する我々の知識驚くほど不完全で、さらに調査する必要がある6 。 このプロトコルでは、正常脳と病理学的脳の両方における電気通信を理解するためにEEGを記録することができる簡単な電極を設計した。この方法における外科移植は、他の利用可能な手順7より安価である7 。さらに、この方法は、より長い時間枠（ すなわち、毎日2〜4時間、1週間）の高品質で安定した脳波信号を記録するために使用することができる。さらに、私たちは動物の自然な行動を可能にする軽い電極（体重約26mg）を使用しました8 。この方法は、電気生理学研究室で一般的に使用されるアンプとデジタイザを必要とする新生児ラットの仔犬の脳波検査に広く適用され、追加のデバイスは必要ありません。

<table><tbody><tr><td>コンピュータピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンサー</td><td>DELI Group Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>502 瞬間接着剤</td><td>DELI Group Co., Ltd.</td><td>7144</td><td></td></tr><tr><td>乾燥炉</td><td>Boxun</td><td>GZX-9140MBE</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>902-0000-522</td><td></td></tr><tr><td>固定装置</td><td>装置 RWD ライフサイエンス</td><td>900-0068-507</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>902-0000-510</td><td></td></tr><tr><td>ホメオサーミック加熱装置</td><td>ハーバード装置</td><td>K 024509</td><td></td></tr><tr><td>アンプ Model 3000&nbsp;</td><td>AMシステム</td><td>ズ61558</td><td></td></tr><tr><td>Micro1401アナログデジタルコンバータケン</td><td>ブリッジエレクトロニックデザイン株式会社</td><td>4383</td><td>データ収集ユニット</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新しい方法を用いた自由に動く新生児ラットの脳波記録

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

脳波は脳内の電気的活動を検出するのに有用な方法です。さらに、それは、てんかんおよび神経変性疾患などの様々な神経学的状態のための広く使用される診断ツールである。しかし、特殊な取り扱いと大きな注意が必要なため、新生児の脳波記録を取得することは技術的に困難です。ここでは、新生児ラットの仔（P8〜P15）にEEGを記録するための新しい方法を紹介します。我々はコンピュータのピン軌跡を用いて簡単で信頼性の高い電極を設計した。ラットの頭蓋骨に簡単に移植することができ、高品質の脳波信号を正常およびてんかんの脳に記録することができます。仔は、癲癇発作を誘発するために神経毒カイニン酸（KA）の腹腔内（ip）注射を与えられた。この手技で実施される外科移植は、新生児の他のEEG処置よりも安価である。この方法により、高品質で安定した脳波信号を1週間以上記録することができます。さらに、この手順は成人RAにも適用できるてんかんまたは他の神経学的障害を研究するために使用される。

<html>上記の外科的処置が適切に行われれば、1チャンネルのラットの新生児の脳波記録が首尾よく行われる。 KA注射の10分後に、規則的な行動徴候のパターンが、不規則な動きおよび掻痒、振戦、およびバランスの喪失の形態で現れた。図2は、代表的な生EEGトレースおよび発作間欠性、発作性痙攣性および発作性発作性拡張性痕跡を示す。 KA注入後、15〜60分（30±5.2分;平均±SEM）の再発性発作および発作性EEG放出パターンが開始した（ 図2Aおよび2B ）。 図2Dおよび2Eは、最も一般的なタイプである強直間代発作を表す。発作持続時間は15.2±0.9秒であった（ 図2D ）。代表的な結果は、緊張放電がクローンバーストに続いていることを示した（ 図2B、2Dおよび2E ）。 <html> e_content &quot;fo：kee...

ここでは、自由に動く新生児のてんかんの仔に脳波記録（EEG）を記録し、その手順、特徴、および用途を記載するように設計された新規技術を紹介する。この方法は、1週間以上のEEGを記録することを可能にする。

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

本手法の全体的な目的は、1週間以上の安定性を有する新しい電極セットアップを用いて、自由に動き回る新生率幼若個体からEEG（脳波）を記録することです。この手法は、神経科学分野における重要な疑問への回答となり、新生児てんかんの研究に有益なものとなるでしょう。この技術を用いることで、より長い期間にわたって高品質で安定したEEG信号を記録することが可能になります。これは、さまざまな神経病理学的疾患の診断に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、P8からP15の新生仔ラットのハンドリングが非常に困難であり、細心の注意を要するため、苦労することになります。電極が通信デバイスとの信号インターフェースとして機能するためには、pronged contact（爪状の接触端子）が必要です。コンピューターのピン接点（pin lo sai）がこの役割を果たします。プライヤーを使用して、コンピューターのピン接点からオスピンとメスピンを慎重に分離します。次に、オスピンとメスピンを接続して電極を作成し、接続部をシアノアクリレートで固定します。同様の電極を数本作成します。接着剤が硬化した後、電極を蒸留水を満たしたビーカーに10分間浸します。その後、超音波洗浄機に入れ、電極を洗浄します。次に、ビーカーを45 °Cに設定したオーブンに入れ、30分間加熱します。最後に、電極を30分間のUV照射で滅菌します。バイオセーフティキャビネット内で、まず滅菌済みの手術器具と、手術用の滅菌済み脳定位固定装置を準備します。次に、2.5%のイソフルランを用いて新生率仔を麻酔します。仔が深く麻酔されたら、イソフルランを1%に下げます。手順を進める前に、足指をつねって、マウスが十分に麻酔されているかを確認してください。次に、ステレオタキシス装置で幼若動物の頭部を固定します。イヤーバーを外耳道に配置し、ゆっくりと締め付けます。新生児の頭蓋骨は非常に柔らかいため、注意してください。次に、頭蓋骨に15 mmの正中切開を加えます。その後、ピンセットを用いて、切開部を広げるように頭皮をそっと的に引っぱります。切開口を開いたままにするため、生理食塩水に浸した綿を使用します。次に、ブレグマとラムダの位置を確認し、鉛筆で印を付けます。以下の電極植込手順は極めて重要であり、正確に実行する必要があります。まず、26ゲージの針を用いて、ブレグマから前方に2 mm、正中線から0.5 mm以内に、前頭前皮質へのバーホールを作成します。次に、ブレグマから後方に1.8 mm、正中線から外側に0.5 mmの地点に、海馬へ向けてバーホールを作成します。脳損傷を最小限に抑えるため、針が皮質表面から2 mm以上の深さに達しないようにしてください。次に、ピンセットを使用して、皮質の穴に参照電極を挿入し、海馬の穴に記録電極を挿入します。次に、電極の周囲にエリスロマイシン軟膏を塗布し、シアノアクリレートで電極を固定します。接着剤が硬化する間に、粘着性のある粘稠な状態になるよう歯科用セメントを準備します。歯科用セメントの粘度は極めて重要です。歯科用セメントが薄すぎると、電極の下に不要な絶縁層が形成される可能性があります。逆にセメントが厚すぎると、過剰な質量により電極が脱落しやすくなります。セメントを塗布する前に、頭蓋骨と電極を十分に乾燥させてください。次に、歯科用セメントを用いて電極を頭蓋骨に固定します。その後、電極にピクリン酸を塗布し、さらに保護層を加えます。これで動物を脳定位固定装置から取り出し、10%グルコース溶液300 µLを皮下に注入します。その後、動物を電気毛布に移し、歩行可能になるまで37°Cに保ちます。歩行可能になったら、術後の痛みを緩和するためにブプレノルフィンを投与し、仔マウスを母親と共にホームケージに戻します。インプラントを使用する前に、仔マウスが回復するまで少なくとも2日間待ちます。回復期間の後、仔ラットを1匹で飼育し、環境に慣れさせるために約10分間記録を行います。電極をアンプに接続し、アンプをコンピュータに接続されたADコンバータに接続します。これらの接続が絡まないように注意してください。次に、データ収集ユニットで、記録用のサンプリングレートを少なくとも 10, 000 hertz に設定し、データが正しく送信されているかを確認します。ベースライン記録を収集します。ベースライン記録の後、幼若個体の腹腔内にカイニン酸を注入し、てんかん発作を誘発させます。注射から15分後に、てんかん性放電を観察し記録します。デジタル化したデータを保存し、信号処理ソフトウェアを用いて解析します。パワースペクトル解析を用いて、新生児EEGにおける異なる周波数成分のパワーレベルを明らかにします。EEG帯域である1から100Hzの二乗平均平方根（RMS）振幅を求めることで、1分間の時間枠から電力を算出します。カイニン酸注入の10分後、反復的な発作間欠期および発作期のEEG放電パターンが記録されました。記録された中で最も一般的だった発作は強直間代型でした。発作性強直持続時間は約15秒でした。また、強直性放電に続いてクローヌスバーストが観察されました。このビデオを視聴することで、生後8日から15日の新生ラットにおいて、電極を植え込み高品質なEEG記録を得る方法について十分に理解できるはずです。準備が整えば、頸部へのインプラント埋設は、手術の複雑さに応じて10分以内で完了できます。

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