Name: 細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ網膜前駆細胞のin vivoイメージングによる細胞非自律影響の解析。キメラ胚作成と遺伝子ノックダウンを用いて、神経発生における細胞運命決定の時期制御メカニズムを解明する手法です。

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この作品は、PRJ（DE120101311）へとLP（PO 1440 / 1-1）にドイツ学術協会（DFG）研究助成金によってARC DECRAによってサポートされていました。オーストラリアの再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア連邦政府からの資金によってサポートされています。私たちは、圭らに公開され、ここで説明した実験を行った博士ジェレミー呉チー圭を、認めます。 、2016年には、我々は教授東島からトランスジェニック魚の規定に感謝していとPROFSに感謝します。 H2B-RFPとH2A-GFP構築物を生成するためのPCS2 +プラスミドと博士ウィルキンソンの提供のためにターナーとラップ。私たちは、動物の世話をするためのFishCore施設のスタッフ（モナッシュ大学）に感謝します。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

効率的に特定の有糸分裂後の細胞型、あるいはパターン化された組織に分化する胚性または誘導された多能性幹細胞を指示することを目指したときにエクステントがどの隣接セルが重要な細胞の運命決定因子の発現のタイミングに影響を与えるように理解することが不可欠です。また、生きている動物の開発細胞におけるこれらの分子事象を調べることに加えて、関連する動的な生体内でこれらのイベントに関連付けられた特定の細胞の文脈上の（時間的および空間的）情報を提供しています。このような研究を容易にすべての脊椎動物モデルで達成することができません。 提示されたプロトコルでは、影響を受けやすいゼブラフィッシュの胚は、脊椎動物の網膜のさらに高度に組織化され、比較的単純な3次元パターン化された組織において、in vivoでこれらの問題に対処するための脊椎動物のモデルとして利用されています。これは、特定の網膜細胞を枯渇させるという仮説をテストすることによって例示されます型は、遺伝子発現のタイミングおよび網膜前駆細胞の発生運命に影響を与えます。我々はさらに、導入遺伝子の発現は...

<html> in vivoでの脊椎動物における重要な発達過程を視覚化する能力は、ゼブラフィッシュ（1、2に概説されている）正常および疾患状態を研究するための重要なモデル作りに貢献してきました。特に、神経網膜は、中枢神経系のアクセス部分です。網膜は、その高度に組織化された、まだ比較的単純な構造、および脊椎動物種3渡ってその高度に保存された神経細胞の種類に簡単に神経新生の研究を行うために自分自身を貸します。 3次元postfertilizationによってゼブラフィッシュの網膜中心に完成され、増殖、細胞周期の出口、非対称細胞分裂、運命の仕様、分化、および神経回路の形成などの細胞の挙動のダイナミクスretinogenesisのプロセス全体を通して追跡することができます、（ DPF）4、5、REF &quot;&gt; 6、7。 また、上記の各段階における異なる遺伝子の機能要件は、同時にのみ死後検査時に評価することが可能な遺伝子ノックアウト技術の適用に起因する表現型を他の脊椎動物モデルに勝る利点を提供する、ゼブラフィッシュ網膜に評価することができます固定組織の。特に、我々は、網膜におけるレポーター導入遺伝子として蛍光タンパク質の発現を可視化し、監視することができるトランスジェニック株の使用は、我々は、特定の神経細胞型の発生の根底にある遺伝子発現の時間分解能を得ることができます。ゼブラフィッシュの急速な発展に、これらのイベントは、それによって神経細胞のアイデンティティの獲得と細胞挙動に関連する遺伝子発現の時間的な重要性をより深く洞察を提供し、全体の発達期間中に可視化することができます。 最後に、これらのアプローチは、遺伝子機能の二つの重要な側面への洞察が得られ、移植を介してキメラを生成するとゼブラフィッシュで効率的に組み合わせることができます。まず、彼らは非標識野生型環境で開発しながら、特定の遺伝子をノックダウンされたドナー胚から移植された細胞を、調べる、私たちは細胞自律的な方法で、遺伝子機能に関する関連情報を得ることができます。これは、それらが通常で表現された前駆細胞内の網膜の運命決定因子因子の機能に関する重要な洞察につながる。これはもはやこれらの遺伝子4、6から機能性タンパク質を生成することができる前駆細胞の発生運命の結果を検査することによって例示され、 8,9。このアプローチを利用して、我々は多くの運命決定因子の因子（ 例えば、Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）は、細胞を作用することが示されています-autonomously特定の網膜神経運命を駆動します。遺伝子発現の欠如は、主に遺伝子ノックダウンを有する細胞は、代替の細胞の運命4、6、7、10を採用することにより、生存し続けるように運命のスイッチをもたらします。第二に、このようなキメラ実験は、異なる遺伝的環境内で開発するときに型前駆細胞がどのように振る舞うか野生評価するために使用することができます。例えば、通常操作さホスト環境（ 例えば、遺伝子ノックアウト/ノックダウン）対WTに目的の遺伝子（レポーター導入遺伝子）を発現するWT細胞の発達を比較することによって、遺伝子発現および細胞運命のその影響を評価することができます。ホスト環境における特定のニューロン型の欠如は、例えば、細胞非自律的な方法で、野生型前駆体の挙動に影響を与えることが示されており、過小評価Oへの分化に向かってバイアスそれらにニューロンタイプ4、7、11、12が欠落して rを。網膜神経細胞は、特定の神経細胞の運命決定因子遺伝子の順次時限式（13に総説）（運命の遺伝子発現）によって保存された組織原のために生まれていることを考えると、我々は、野生型の前駆細胞における運命の遺伝子発現のどのタイミングを示すためにこれらのメソッドを使用しましたそのような前駆細胞が誘導される異常な細胞組成物と網膜のホスト環境で開発する際に影響を受けています。ここで、我々はどのように比較的標準と広く使われている技術の組み合わせは、網膜前駆細胞8、9の開発に運命の遺伝子発現のタイミングの検査を可能にします。ための証拠としてこれらのアプローチを概説しますこのプロトコルは、あたりの容易さとタイムラプスイメージングを組み合わせた実験的なアプローチについて説明します発達retinogenesisの全期間を通じて個々のモザイク状の標識細胞を追跡するためにゼブラフィッシュ胚の開発エクスビボでの移植を形成します。いずれかの宿主胚に機能的な遺伝子操作を行うことにより、ドナー胚、両方またはどちらも、一方は遺伝子機能の細胞自律性を評価することができます。このアプローチは、ここで説明し、個々の成分が適しているため、他のシステムにおける同様の研究課題に広く適応することができます。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>バイオライン</td><td>BIO-41025</td><td>アガロースコーティングされた皿は、数日前に準備することができ、乾燥を防ぐためにパラフィルムで密封し、4 &#176で保管することができます。C</td></tr><tr><td>アガロース低溶融</td><td>シグマ</td><td>A9414-100G</td><td>は、大容量で調製でき、マイクロ波で液化し、40 &#176で溶融状態に保つことができます。Cウォーターバス。1 mLのアリコートを調製できます(マウントされた胚のグループごとに1つ)。</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管、フィラメントなし</td>、<td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td>、<td>同様の直径の代替品を使用できます&nbsp;</td></tr><tr><td>フィラメント付きホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td>同様の<td>直径の代替品を使用できます&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿(直径60mm)</td><td>科学供給</td><td>1070506</td><td>任意のサイズの任意のガラス代替品</td></tr><tr><td>インジェクションチューブ(2m)</td><td>エッペンドルフ</td><td>524616004</td><td>これは、移植中にニードルホルダーをシリンジに接続します</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションモールド(くさび形の突起を持つプラスチックモールド)</td>同様の形状の<td>適応科学ツール</td><td>PT-1</td><td>の代替品は、</td></tr><tr><td>マイクロニードルを使用することができます</td><td>ホルダーNarishige</td><td>M-152</td><td>インジェクション針の外径に適合する任意の代替品は、</td></tr><tr><td>マイクロインジェ</td><td>クターNarishigeまたはEppendorf Femtojet</td><td></td><td>空気圧インジェクター、ガス圧力</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td>を使用した空気圧インジェクター、<td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>同様の代替品を使用することができます</td></tr>マイクロ<tr><td>ローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマ</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>の針の引き手の</td><td>Sutterの器械</td><td>モデルP-2000</td><td>この引き手に使用する設定は次のとおりである:H 430、Fil 4、Vel 50、Del 225、Pul 75。適切な先端寸法</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>インターパス</td><td>PM996</td><td>任意のパラフィンフィルム</td></tr><tr><td>パスツールピペット プラスチック</td><td>サムコサイエンティフィック</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペットガラス</td><td>ヒルシュマン Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>シグマ</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp;プロテアーゼタイプXIV</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素シ</td><td>グマ</td><td>P7629-25G</td><td>PTUは有毒であり、粉末への頻繁な曝露を避けるためのストック溶液として調製することができます、購入/使用前にMSDSにご相談ください。</td></tr><tr><td>Qiaquickゲル抽出</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNAを精製するための任意の代替手段を使用することができます</td></tr><tr><td>Rneasy Miniキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNAを精製するための任意の代替手段を使用することができます</td></tr><tr><td>SP6 mMessageキット</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>SP6を使用してDNAを転写するための任意の代替手段</td></tr></tbody></table>

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

遺伝的および技術的な強みは、遺伝子操作の結果は急速な発達期間を通じて生体内で追跡することができたゼブラフィッシュ脊椎動物鍵モデル生物を行いました。複数のプロセスは、細胞増殖、遺伝子発現、細胞遊走及び形態形成を含む、研究することができます。重要なことは、移植を介してキメラの生成を容易にホスト環境の影響下で個々の細胞のモザイク標識および追跡を可能にする、実行することができます。例えば、宿主胚の機能的な遺伝子操作組み合わせることによって（ 例えば、モルホリノマイクロインジェクションによって）ライブイメージング、外因性の影響は、個々の移植されたドナー細胞上の（遺伝的に改変された環境が提供された）細胞非自律信号を評価することができます。ここでは、このアプローチは、細胞の運命determinのタイミングのためのプロキシとして蛍光導入遺伝子発現の発症を比較するために使用される方法を示し異なる遺伝子ホスト環境でエーション。 この記事では、我々は、ドナー細胞をマークするために、ホスト胚における遺伝子ノックダウンを引き起こすためにゼブラフィッシュの胚をマイクロインジェクションのためにin vivoタイムラプス共焦点に準備し、実行するためのキメラ胚を生成するために使用される移植技術、およびプロトコルの説明をプロトコルを提供します複数の胚のイメージング。このような遺伝子発現の開始などのイベントのタイミングを比較した場合、特に、多位置イメージングを行うことが重要です。これは、複数の制御と同時に処理実験胚からのデータ収集が必要です。このようなアプローチは、簡単に選択した任意の器官または組織に外因性の影響の研究のためのイメージングを生きるためにアクセス可能な拡張することができ、移植が確立胚の運命マップに従って、容易に標的とすることができることを条件とします。

この作品は、野生型の網膜前駆細胞がモルファント宿主胚内で開発する場合、遺伝子の発現タイミングの変化を評価するための実験プロトコルを提示します。実験宿主胚は、網膜7、26の中間生まれ水平およびアマクリン介在ニューロンを欠いPtf1aのモルファント、です。これらは、標準の制御モルホリノを注射した宿主胚を制御するために比較されました。 （網膜を含む）、中枢神経系発生を横切るニューロンの異なるタイプの神経新生ので高度に保存された組織原のため27、28、29、30、31...

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

これらの手順の全体的な目的は、発達中の細胞内またはその周囲の環境における遺伝子発現の変化が、発生過程の時間的なプロセスにどのように影響するかを研究することです。この手法は、運命決定のタイミングが細胞内で細胞自律的に発現する遺伝子によって制御されているのか、あるいは隣接する細胞において細胞非自律的に制御されているのかという重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝的に異なる環境で細胞が発達する際に、生体内の脊椎動物において個々の前駆細胞を追跡できる点にあります。手順の実演は、私の研究室のリサーチアシスタントであるStefanie Dudczigが行います。テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュ胚およびMorpholinosまたはmRNAを満たしたマイクロインジェクション用針を準備した後、ディッシュ内のミネラルオイルの滴に針先を浸します。フットペダルを押して注入量を測定し、マイクロメーター स्लाइडまたは接眼レンズのレティクルで測定して、注入量が1 nanoliterと同等になるまでガス圧および/または注入時間を調整します。顕微鏡スライドグラスをペトリ皿に置き、転送ピペットを用いて、スライドの端に沿って単細胞期の胚を滴下します。次に、極細の転送ピペットを使用して、注入中の移動を防ぐため、可能な限り液体を除去します。その後、先端の半分をカットしたMicroloaderピペットチップを用い、胚を1列に整列させます。次に、針を単細胞期の胚に向けて下ろし、1回のスムーズな動作で絨毛膜と卵黄を貫通させます。針先が卵黄の中心に位置したところで、フットペダルを1回押し、1 nlのH2AGFPまたはH2BRFP mRNAを単細胞期胚の卵黄にマイクロインジェクションします。注入針を抜き、胚が入ったディッシュを移動させて次の胚を定位置に合わせ、胚の列すべてに注入が完了するまでこれを繰り返します。すべての胚に注入した後、ディッシュを30から45度の角度に傾け、squeeze bottleに入れたE3 mediumの緩やかな流れを用いて、注入済みの胚を新しい清潔なペトリ皿に移します。受精から3時間後、蛍光顕微鏡を用いて2倍から5倍の倍率で、RFPフィルターを使用してドナー胚に標識シグナルがあるかを確認します。強い蛍光シグナルを持つ、十分に発達した胚を選択してください。テキストのプロトコルに従って注入プレートとシャーレを準備した後、ダイヤモンドナイフでガラス管を回転させながら傷をつけ、先端が脱落するまで調整し、操作しやすい長さにカットした細引きのガラス製パストールピペットを用意します。切り口が直線的であることを確認してください。その後、脱膜した胚を傷つけないよう、ブンゼンバーナーで切り口を回転させて火炎研磨し、先端を滑らかにします。胚の卵膜を除去（脱膜）するには、十分に発達したホスト胚とドナー胚をそれぞれ別の10 milliliterのエルレンマイヤーカーグラスビーカーに入れ、液体をできるだけ取り除きます。あらかじめ調製した0.5 milligram per milliliterのプロテアーゼ溶液を各ビーカーに5 milliliters加え、解剖顕微鏡下で観察しながら胚をゆっくりと撹拌します。撹拌を続けながら、最初の胚が卵膜から脱出した時点で、液体の大部分を捨て、ビーカーの壁面に沿ってE3培地を静かに注いで満たすという操作を3回素早く繰り返し、プロテアーゼ溶液を洗い流します。最初の数個の脱卵膜胚が観察されたら、速やかに、かつ穏やかに洗浄して酵素による脱卵膜処理を停止させます。移植には、細胞塊が対称的であり、卵黄に明らかな変形や損傷がない脱卵膜胚のみを選択してください。胞胚移植を行うには、ニードルをニードルホルダーに取り付け、移植装置のチューブに接続します。シリンジを手動で操作して、針から液体を吸い込んだり排出したりし、密閉状態を確認します。次に、ガラスピペットを用いて、ドナー胚をアガロースモールドの1列目に移します。続いて、ホスト胚をアガロースモールドの2列目から6列目に移します。移植針をドナー胚の割球細胞にそっと当て、約20から50個の細胞をゆっくりと移植針の中に吸い上げます。このとき、卵黄を吸い込まないように注意してください。マイクロマニピュレーターを使用して、ドナー胚から移植針を持ち上げます。注入皿を左に移動させ、移植用針の先端を細胞塊の側面から、1番目のホスト胚の動物極へと挿入します。運命地図に基づき、この領域が前脳眼野に分化することを確認し、表面付近に5〜10個の細胞を配置します。イメージング用に胚を固定するため、プラスチック製転送ピペットで最大5個の胚を吸い上げ、重力によって胚が先端に集まるようにします。あらかじめ準備した1%低融点アガロース入りのプラスチックチューブの表面に転送ピペットを接触させ、E3転送液の量を制限しながら、胚をチューブの中に沈み込ませます。次に、アガロース入りプラスチックチューブから5個の胚を、0.5〜1 mLのアガロースが入ったペトリ皿に転送し、同じ転送ピペットを使用して、少量の滴だけが残るように過剰なアガロースを取り除きます。チップを切り落としたマイクロローディングピペットを用いて、アガロースが凝固するまで胚を横方向に整列させます。その後、一度に最大5個までの胚を、個別の低融点アガロースドロップに載せて固定し続けます。正立顕微鏡でイメージングを行う場合は、胚をペトリ皿の縁から1 cm以内に配置しないようにしてください。イメージング中の脱落や横方向への移動を防ぐため、さらに1%低融点アガロースを用いて、皿の端にあるアガロースドロップ同士を連結させます。適切なマウント角度にあり、心拍が強く、さらに遺伝子発現の波が始まる発達中の網膜の前腹側四分面に少数の移植ドナー細胞が存在する胚を選択します。テキストのプロトコルに従ってイメージングを行います。この図に示すように、単細胞期の胚の卵黄に1 nLのmRNAをマイクロインジェクションすると、受精後3時間までに蛍光レポータータンパク質が発現し、この段階で最も輝度の高いドナーを選択します。受精後24時間において、適切な網膜部位にドナー細胞を移植した胚を、16時間から24時間にわたってタイムラプス撮影に供しました。この単一の光学Zセクションの共焦点画像は、発達中の眼における明視野を赤色チャンネルで重ね合わせたものであり、ラベルなしのホスト環境の中に、少数のラベル済みドナー細胞が赤色で示されています。これらの顕微鏡写真は、ラベルなしの野生型ホストに移植された、atoh7:gapGFP 導入胚由来の発達中の野生型ドナー細胞をタイムラプス撮影したものです。ここで示されているように、いくつかの細胞で導入遺伝子の発現が始まっていることがわかります。習熟すれば、微量注入は2時間で完了し、胚の選別、調製、および移植を同日中に3時間で完了させることができます。これらの手順の後、または並行して、死後解析のために特定の齢の胚を固定することも可能です。例えば、ドナー細胞のどの程度の割合が特定の遺伝子やタンパク質を発現しているか、特定の形態を有しているか、あるいは特定の場所に遊走したかを定量化できます。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚を遺伝的に操作し、遺伝的に異なるドナーとホストの間でキメラを作成する方法について深く理解できるはずです。また、固定組織では解決できない疑問に答えるために、in vivo タイムラプスイメージング用の胚のマウント方法についても習得できます。

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JoVE Journal

Developmental Biology

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