Name: マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶマウス網膜循環における赤血球と白血球の蛍光標識法。走査型レーザー検眼鏡を用いて血流動態を可視化し、糖尿病網膜症や加齢黄斑変性症などの病態メカニズム解明に貢献する実験手法を習得できます。

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この研究プロジェクトはシンガポール国家医学研究評議会（NMRC）のNew Investigator助成金のもとで資金提供された。研究チームは、2012年11月から2014年10月まで、National Medical Research Council（NMRC）の海外研究訓練フェローシップの下、University College of Ophthalmology（IoO）、University College（UCL）のAgrawal博士に研究訓練を教えていただきます。 David Shima。 Agrawal博士は、細胞を標識し、Shima博士の研究室でライブイメージングの概念と技術を取得しました。チームはDavid Shima教授、Kenith Meissner教授、Peter Lundh博士、Daiju Iwata教授からの訓練フェローシップの監督と指導を認めたいと思っています。

この研究で使用された動物プロトコールはシンガポールSingHealthの動物実験および使用委員会の承認を受けており、眼および視力における動物の使用に関するビジョンアンド眼科研究協会（ARVO）の声明研究。 1.蛍光色素による赤血球および白血球の標識<ol><li> 試薬の調製 <ol><li> 1800μLの滅菌蒸留水中に3mgのICGを溶解してICG（1.5mg / mL）を調製する。 10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）200μLを加える。 </li><li>滅菌蒸留水6 mLに4 mLの1×PBSを加えて40％1×PBSを調製する。 PBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を、10mLの1×PBSに100mgのBSAを加えることによって調製する。 BSAが溶解するまで十分に混合する。 </li></ol></li><li> 密度勾配遠心分離を用いた赤血球および白血球の単離 <ol><li>マウスを麻酔する（野生ty（ARVOガイドラインのスケジュール1に従って）塩酸ケタミン塩酸塩（50mg / kg）と塩酸キシラジン塩酸塩（0.5mg / kg）との組み合わせを使用して、C57BL / 6を投与した。ペダル踏み戻し反射（ すなわち 、つまみ）で麻酔を確認する。 </li><li>ゆっくりと29ゲージの針（1mLシリンジに取り付けられています）を心臓に向けた肋骨の角度で挿入します。針が心臓の内側にあることを確認するには、プランジャーをわずかに引き抜き、血液がシリンジに抜き取られているかどうかを確認します。心臓から直接0.8 - 1 mLの血液を蘇生させる。 </li><li>直ちに、採血管を含むエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（血液1.8mg / mL）に血液を移し、血液の凝固を防ぐために穏やかに混合する。 </li><li>ペントバルビタール（80mg / kg）を腹腔内注射することによりマウスを安楽死させる。 </li><li>ポリスクロースおよびジアトリゾアートナトリウム溶液（1：1比;密度1.077g / mL）の上に全血を2mLのマイクロ遠心チューブおよびセントリ血漿からの白血球および赤血球の分離を可能にするために、フュージ（450×g、30分）。 </li><li>ピペットを用いて上清（血漿）を除去して捨てる。ピペットを使用してバフィコート（白血球）と赤血球（赤血球層）を新しく分離したチューブに注意深く移す。 </li></ol></li><li> 赤血球のICG（1.5％）標識 <ol><li>汚染物質を除去するために1x PBSで赤血球を洗浄する。赤血球を1×PBS（1：1）に再懸濁し、50％ヘマトクリットを作成する。 0.5％の50％ヘマトクリット（約250μLの充填赤血球）をマイクロ遠心チューブに分注する。赤血球（750×g、5分）を遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li> 40％1×PBS200μLをペレット状の赤血球に加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートする。赤血球懸濁液に100μLのICG（1.5mg / mL）を添加し、チューブを反転させて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。 300μLの1×PBSを加え、シェーカーインキュベーターで37℃で60分間インキュベートする。 </li><li>担体赤血球（750 xg、3分）を遠心分離し、1 mL PBSで再懸濁する。 </li><li>上清が透明になるまで細胞を1×PBSで3〜5回洗浄する（ステップ1.3.3）。最後の洗浄後、上清を傾瀉し、ICG標識赤血球の50％ヘマトクリット（1.25×10 8細胞/ mL）を達成するために、標識された前膨潤赤血球に1％BSA PBS（1：1）を加える。 </li></ol></li><li> 白血球のナトリウムフルオレセイン（1％）標識 <ol><li>密度勾配遠心分離（ステップ1.2.6からの）を用いて血液からバフィコートを分離した後、450xgで10分間遠心分離して10mLの1×PBSで細胞を1回洗浄し、汚染物を除去する。ペレットを900μLの1×PBSに再懸濁する。 </li><li> 100μLの10％ナトリウムフルオレセインを900μLの白血球懸濁液に加え、室温で2分間インキュベートする。標識された細胞を遠心分離によって10mLの1X PBSで3回洗浄する。ng（450×g、10分）。 100μLの1×PBSに細胞を再懸濁する。 </li></ol></li></ol> 2.蛍光標識細胞のライブイメージング<ol><li> ICG標識赤血球の生細胞イメージング <ol><li>尾静脈または逆行軌道を介して注入する細胞を調製するために、ICG標識赤血球の50％ヘマトクリットを1倍PBSで10倍および50倍希釈して、それぞれ5％および1％ヘマトクリット細胞を作製する。 </li><li>マウスを赤外線（250W強度）の下に5分間置いて尾静脈を拡張させる。ケタミン塩酸塩（50mg / kg）および塩酸キシラジン（0.5mg / kg）を腹腔内注射（ここでは、ARVOガイドラインのスケジュール1に従って）してマウスを麻酔する。 </li><li> 0.5％トロピカミドと2.5％フェニレフリン塩酸塩の滴で眼の各瞳孔を希釈する。 </li><li>イメージングのためにコンタクトレンズを一方の目の上に置きます。イメージングのための媒体として眼科用ゲルを使用し、乾燥物を防ぐsの角膜。マウス眼の屈折を補正するために、+ 25ジオプターレンズを備えた共焦点レーザー走査眼科検査（SLO）カメラを固定する。 </li><li>マウスをSLOイメージングプラットフォームに置きます。マウスの角膜がSLOマシンの光学ヘッドに向かって真っ直ぐに向いていることを確認します。 </li><li>イメージングモジュールのスイッチを入れます。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、 &quot;New Patient&quot;ボタンをクリックし、マウスの耳のタグ番号、生年月日、蛍光色素のパーセント、および標識細胞タイプなどの動物識別情報を追加します。 <ol><li>イメージングモジュールを操作して、動物の視神経をイメージングスクリーンの中央に配置します。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、「Acquire」ボタンをクリックして、30°または15°のアングルビュー設定の赤外線（IR）眼底画像を撮影します。最高品質の画像を得るために、網膜の中心、瞳孔、およびレーザーの光路が調整されていることを確認してください。 <br/&gt;注：光路は、ジョイスティックを操作して最も鮮明な画像と最良の照明を得るように調整されています。 </li></ol></li><li> ICG眼底ビデオを撮る。 <ol><li> ICGフィルター（790 nm）をオンにし、カメラを30°または15°の角度で高速モードに設定し、ICG強度を85に設定してすべての標準値を読み取ります。コントロールパネルで、 &quot;Acquire&quot;ボタンをクリックして8.8 / 15フレーム/秒で1分間ビデオ（ベースラインコントロール）を撮影します。 </li></ol></li><li> 30ゲージの針に取り付けられたインスリンシリンジに100μLのICG標識赤血球をロードする。 <ol><li>尾静脈経路を介した注射のために、ニードルベベルを尾静脈に挿入する。血液のシリンジへの逆流をチェックして静脈内アクセスを確認し、標識細胞を循環系に注入する。 </li><li>眼窩後方経路を介した注入のために、眼に隣接する針を眼窩後方の空間に挿入するe。血液のシリンジへの逆流をチェックし、循環細胞に標識された細胞を注入することにより、眼窩後方へのアクセスを確認する。 </li></ol></li><li>注入後、マウスの位置を変えて、IR眼底画像（ステップ2.1.6.1を参照）とビデオをICGフィルタ（ステップ2.1.7.1を参照）を用いて撮影する。網膜循環中の標識された細胞は、細胞の注入直後に視覚化することができる。 </li><li>ビデオフレームを取得したら、SLO表示モジュールソフトウェアを使用してビデオを書き出すときに.tiff形式を選択して、ビデオシーケンスの.tiff画像を抽出します。ファイルを目的のフォルダに保存します。 </li><li>コンタクトレンズを取り外し、もう片方の目の上に置き、ステップ2.1.4〜2.1.7で説明したようにイメージングを完了します。 </li><li>撮影後、麻酔をかけた動物を赤外線（250W）下に置き、麻酔から回復するまで体温を維持します。動物が完全に回復したら、マウスを保持ケージに戻します。</li></ol></li><li> 1％ナトリウムフルオレセイン標識白血球の生細胞イメージング <ol><li>マウスを準備し、セクション2.1で説明されているように機器をセットアップします。 </li><li>ステップ2.1.4〜2.1.6で説明したように、マウスを置いて赤外線眼底画像を撮影します。 <ol><li> 30°または15°の角度の視野を有する高速カメラモードおよび標準化のためのすべての読み取りについて85でのフルオレセイン強度を有するフルオレセインフィルター（488nm）を使用して、マウスのフルオレセイン血管造影像を得る。 8.8 / 15フレーム/秒でビデオ（ベースライン制御）を記録する（ステップ2.1.7.1を参照）。 注：ここでは、複数のトラックのビデオ（1分のビデオ）が異なる時間間隔で取得されました。 </li></ol></li><li>セクション2.1.8で説明したように、100μLの標識白血球をマウスの尾静脈またはレトロオービタル注射液に注入します。 </li><li>注射直後にマウスを置いて、赤外線眼底画像（ステップ2.1.5と2.1.6参照）とフルオマウスの血行再建術（2.2.2節参照）。 </li><li>イメージングモジュール上のフォーカスつまみを回してスキャンレーザーの焦点を調整し、網膜または脈絡膜血管の標識細胞を観察します。 </li><li> SLO表示モジュールソフトウェア（ステップ2.1.10参照）を使用してビデオフレームと画像を取得し、目的のフォルダに保存します。 </li><li>手順の後、動物の世話のためにステップ2.1.12に従ってください。 </li></ol></li><li> MtrackJソフトウェアによる画像解析 <ol><li> 「File」をクリックしてImageJで画像シーケンスを開きます。 &quot;インポート&quot;を選択し、 &quot;イメージシーケンス&quot;を選択し、目的のイメージフォルダを選択し、 &quot;開く&quot;をクリックします。画面に「Sequence options」というポップアップウィンドウが表示されます。 [OK]をクリックします。画像シーケンスが開きます。 </li><li> 「画像」をクリックして画像のフレーム間隔を設定し、速度測定のために「プロパティ」を選択します。ここでは、それは8.8フレームですes / s。 </li><li> &quot;プラグイン&quot;を選択してMTrackJプラグインを開きます。 「トラッキング」を選択し、「MtrackJ」を選択します。メニューが表示されます。 </li><li>トラッキング設定を調整するには、メニューの「トラッキング」を選択し、「ポイントを追加した後の次のタイムフレームのインデックスに移動」チェックボックスをオンにします。 </li><li>最初のセルを追跡します。 <ol><li> 1つのセルを探し、後続のフレームで同じセルを追跡します。メニューで「追加」をクリックして新しいトラックを追加します。 </li><li>画像（+記号）の上にカーソルを置き、適切なセルをクリックします。 注：MTrackJは自動的に次の時間フレームにジャンプし、軌跡の最初のポイントの位置をマークする小さな円を追加します。 </li><li>画像シーケンスのフレームを移動しながら、セルの現在の位置を続けてクリックします。 注：時々、軌跡の前のポイントをマークする円は、現在の位置を表示する機能を妨げます。これが発生した場合、ステップ2.3.5.3.1に進んでください。 <ol><li>メニューの「表示」をクリックし、「現時点のトラックポイントのみを表示する」オプションを選択して、軌道の表示オプションを変更します。すべての軌跡を表示するには、このオプションの選択を解除します。 </li></ol></li><li>最初のセルの軌跡が見えるまでクリックし続けます。次に、[保存]をクリックしてトラックを保存します。 </li></ol></li><li> 2番目のセルを追跡します。 <ol><li>メニューで、[追加]をクリックして新しいトラックを開始します。新しいセルを追跡するためにステップ2.3.5.1〜2.3.5.4を繰り返します。 2番目のトラックを保存するには、[保存]をクリックします。 </li><li>観察されたすべての追跡可能な細胞について、これらのステップを続ける。セルをトラッキングした後、メニュータブで &quot;Measure&quot;と &quot;OK&quot;をクリックして結果を取得します。 注記：結果ウィンドウが自動的に開き、詳細な分析のためにスプレッドシートに保存して開くことができます。 </li></ol></li></ol></li></ol>

著者は何も開示することはない。財務的または利益相反はありません。

網膜および脈絡膜循環における血行動態の研究は、多くの眼疾患の病態生理を理解する上で不可欠です。網膜循環における血流動態は、フーリエドメイン光コヒーレンストモグラフィ（FD-OCT）、レーザースペックルフローグラフィ（LSFG）および網膜オキシメトリーによって研究することができる。これらの方法は、網膜循環路40,41,42,43,44,45における全血流を研究するために異なるアプローチを使用するが、個々の細胞型の流れダイナミクスを研究することができないという限界を共有している。網膜および脈絡膜組織への栄養素および酸素の供給、ならびに眼の炎症性疾患における免疫細胞の移動および病因の病因におけるそれらの役割は、ERのフローダイナミクスを調べることによって研究することができる網膜および脈絡膜循環における赤血球、赤血球および赤血球である。画像法と結合した標識技術は、循環中の標識細胞を追跡し、標識細胞の流動動態を研究するのに役立つ。血液中の血流動態を調べるために、いくつかの蛍光色素を白血球および赤血球に標識するために首尾よく適用された3,17,18,19。 ここでは、食品医薬品局が承認した非毒...

網膜および脈絡膜循環における血球の流動ダイナミクスの研究は、潜在的に視力を脅かす眼疾患および他の眼の炎症状態の病因の理解に不可欠である。しかし、蛍光色素の血漿タンパク質への結合を含む従来の血管造影技術は、赤血球または白血球の動態に関する情報を提供していない1 。赤血球網膜流動ダイナミクスは、様々な炎症状態における細胞の移動、認識、接着および破壊を理解するために、網膜における代謝的に効率的な循環および白血球流動の研究に重要である2 。種々の細胞タイプの同定および特徴付けに使用されるいくつかの蛍光分子がある3 。血液細胞の血行動態は、それらを適切な蛍光で染色することによって測定することができる適切なイメージング技術を適用する4 。 加齢性黄斑変性症（AMD）や糖尿病性網膜症（DR）のような眼内疾患の炎症反応の存在には、病変部にリンパ球が蓄積している5,6 。組織内の免疫細胞を追跡することは、病因のメカニズムに関与する複雑な事象を理解するのに役立ちます。初期の研究では、 51 Crや125 Iのような放射性同位体を細胞トレーサーとして用いた。これらの色素は毒性であり、細胞生存率に影響を及ぼす。放射性マーカー3 Hおよび14 Cは、それらの低い放出エネルギーのために細胞に対して毒性が低いが、系7,8 においてそれらのシグナルを検出することは困難である。関連する潜在的な問題を克服するために、いくつかの蛍光色素が導入された蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いたインビトロでのリンパ球遊走の追跡9,10 。 Hoechst 33342およびチアゾールオレンジは、インビボでリンパ球を追跡するために使用されるDNA結合蛍光色素である。 Hoechst 33342は、DNAのATリッチ領域に結合し、膜透過性であり、2〜4日間蛍光シグナルを保持し、クエンチング9,10 に耐性がある。ヘキスト33342およびチアゾールオレンジの欠点は、リンパ球増殖の阻害11および短い半減期9である 。 カルセイン-AM、フルオレセインジアセテート（FDA）、2 &#39;、7&#39;-ビス - （2-カルボキシエチル）-5-（および-6） - カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（BCECF-AM）、5-（および-6） - （CFDA）、および5-（および-6） - カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（CFDA-AM）リンパ球移動研究に用いられる細胞質蛍光色素である。しかし、FDA、CFDAおよびCFDA-AMは細胞内の保持率が低い9 。 BCECF-AMは、増殖応答を低下させ、走化性およびスーパーオキシド産生に影響を及ぼす9,12。カルセイン-AMは蛍光色素であり、短期インビボリンパ球遊走研究に有用である。それは強い蛍光シグナルを放出し、細胞機能の大部分を妨げず、3日まで蛍光シグナルを保持する（ 12,13） 。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA-SE）は、リンパ球の移動研究に使用される共有結合性の蛍光色素です。 FITCは、細胞生存率に影響を示さず、Tリンパ球14,15よりもBリンパ球との親和性が強い</sup&gt;。 CFDA-SEで標識されたリンパ球は、8週間以上および8細胞分裂までの間、インビボで追跡することができる9,16。 C18ジ（1,1&#39;-ジオクタデシル-3,3,3 &#39;、3&#39;-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩）、DiO（3,3&#39;-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩）、Paul Karl Horan（PKH）2、PKH3およびPKH26は、白血球および赤血球を標識するために使用される蛍光親油性カルボシアニン色素を挿入する。 C18 DilおよびDiOは、細胞膜に取り込まれるとより高いシグナルを示し、比較的毒性がない12,17。 PKH2、PKH3およびPKH26標識細胞は、毒性の低い18,19,20,21,22の蛍光シグナルの良好な保持を示す。しかし、PKH2はCD62L発現をダウンレギュレートし、<html> mphocyte viability 23 。 上記の研究の大部分は、リンパ球におけるリンパ球の移動および増殖を追跡し、非眼球循環における標識された赤血球を研究するために行われてきた。眼球循環中の血液細胞を研究するための標識技術を応用した研究はほとんどない。走査型レーザー検眼鏡（SLO）の適用は、眼底血管撮影法24によって網膜および脈絡膜循環中の標識細胞をインビボで研究することに大きな利点を有する。 SLO 25,26,27,28,29,30,32,34,36,38,40,42,44,46,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,57,58,56,56,56,56,56,57,58,59,56,56,56,56,56,56,56,56class = &quot;xref&quot;&gt; 31,32,33,34 。アクリジンオレンジの光毒性および発がん性26,27 、 FITCと細胞活性の干渉、および網膜および脈絡膜血管の解像度のための血管内造影剤の必要性は、インビボ動物実験29 におけるそれらの適用を制限する。フルオレセインナトリウムおよびICGは、食品医薬品局によって承認された非毒性であり、ヒトでの試験に安全です32,35 。フローダイナミックス研究の大部分は、白血球または赤血球の標識および網膜および脈絡膜血管におけるその視覚化に関連する36,37,38,39 </sアップ&gt;。ここでは、赤血球のICGラベリング、白血球のフルオレセインナトリウム標識、およびSLOを用いたマウス網膜循環における可視化標識細胞の追跡の標準化プロトコルを記載する。

<table><tbody><tr><td>カーディオグリーンポリメチン染料(インドシアニングリーン)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン100mg / mL</td>ノ<td>バルティス</td><td>U1705A / H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ウルトラピュアグレード</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>K2E(K2EDTA)付きマイクロテーナーチューブ - EDTA濃度 - 1.8mg/mLの血液</td><td>BD、米国</td><td>参照 365974</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>シェーカーインキュベーター</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td><td>Alcon&nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&nbsp;0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5%ミドフリン5mL(塩酸フェニレフリン2.5%)</td><td>アルコン&nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&nbsp;0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>針付きテルモシリンジ 1 cc/mL ツベルクリン</td><td>テルモ(フィリピン)コーポレーション、フィリピン</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>ビディシックゲル 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>Assure medical disposables</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型血管造影システム(ハイデルベルグ網膜血管造影2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>モデル: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

網膜および脈絡膜血流動態は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD）および他の眼炎症状態などの様々な眼疾患の病態生理学および後遺症についての洞察を提供し得る。また、眼の治療反応をモニターするのに役立ちます。標識された細胞の生細胞イメージングと結びついた血液細胞の適切な標識は、網膜および脈絡膜循環における血流動態の調査を可能にする。ここでは、マウス赤血球および白血球のそれぞれ1.5％インドシアニングリーン（ICG）および1％ナトリウムフルオレセイン標識の標準化プロトコルを記載する。 C57BL / 6Jマウス（野生型）の網膜循環中の標識された細胞を視覚化するために走査型レーザー検眼鏡（SLO）を適用した。両方の方法は、マウス網膜循環において明瞭な蛍光標識細胞を示した。これらの標識方法は、様々な眼疾患モデル。

1.5％ICGで標識した赤血球を、C57BL / 6Jマウス（野生型）の網膜循環において視覚化した。 1.5％ICG標識赤血球の1％および5％ヘマトクリットの両方が、網膜循環において区別可​​能であった。しかし、個々の標識細胞は、1.5％ICG標識赤血球の1％ヘマトクリットでより明瞭に視覚化された（ 図1 ）。 5％ヘマトクリットでは、網膜血管中の多数の標識細胞のために、個々の細胞にマーキングすることは不可能であった。いずれの条件下でも、若干の赤芽球が乳頭周囲領域で観察されたが、標識赤血球の5％ヘマトクリットでより顕著であった（ 図2 ）。 白血球は上記プロトコールに従って1％ナトリウムフルオレセインでうまく標識され、蛍光顕微鏡を用いて緑色標識細胞として視覚化された（ <strong<html> class = &quot;xfig...

眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

この手順の総合的な目的は、走査型レーザー眼底計を用いて、マウスにおける網膜内の血球循環を可視化することです。この手法は、白血球（WBC）および赤血球（RBC）の網膜底における動態はどのようなものであるか、また、それらの血流動態が疾患の病態生理にどのように寄与しているかなど、網膜疾患に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまな疾患表現型を反映できること、および実施が非常に容易であることです。本手順は、チームメンバーのPraveen、Bo Bo、Nehaによって実演されます。マウスの血液細胞層を単離するため、2 mLチューブに1:1のポリスクロースおよびジアトリゾームナトリウム溶液を入れ、その上に採取したばかりの全血を静かに加えます。その後、チューブを30分間遠心分離します。次に、血漿上清を吸引して廃棄します。その後、白血球で構成されるバフィーコート層と、その下の赤血球層を慎重に別々のチューブに回収します。次に、赤血球を1XPBSで洗浄して不純物を除去し、同量のPBSに再懸濁します。次に、懸濁液を0.5 mLずつマイクロ遠心チューブに分注します。分注したサンプルを遠心分離して上清を捨て、ペレット化した赤血球に40% 1XPBSを約200 µL加えます。これらを十分に混合します。それらを室温で5分間インキュベートします。5分後、各懸濁液に100 µLのICGを添加します。チューブを転倒混和し、その後、室温で5分間インキュベートします。次に、300 µLの1XPBSを加え、37 °Cで緩やかに撹拌しながら1時間インキュベートします。その後、懸濁液を遠心分離し、ペレット化した細胞を回収して1 mLの1XPBSで再懸濁します。上清が透明になるまで、1XPBSで細胞の洗浄を繰り返します。上清をデカンテーションした後、1% BSAおよびPBSを1容量分加え、ICG標識赤血球のヘマトクリット値を50%にします。次に、バフィーコートの回収処理を行います。まず、細胞を10 mLの1X PBSで1回洗浄し、不純物を除去します。サンプルを再度遠心分離し、ペレットを900 µLの1XPBSで再懸濁します。次に、10%ナトリウムフルオレセインを100 µL加え、細胞を室温で2分間インキュベートします。最後に、ラベル化したリンパ球を10 mLの1XPBSで3回洗浄します。遠心分離し、100 µLの1XPBSに再懸濁します。注入用のICG標識赤血球を調製するには、まず注入用のアリコートをヘマトクリット値5%または1%まで希釈します。マウスを麻酔し、瞳孔を散瞳させます。次に、両眼に眼科用軟膏を塗布します。そして、片方の眼にコンタクトレンズを装着します。次に、眼の屈折を補正するために+25ジオプトリーのレンズを用い、共焦点SLOカメラでマウスの撮像を行います。角膜をSLO装置の光学ヘッドに正確に向けます。次に、イメージングモジュールをオンにし、視神経がイメージングスクリーンの中心に来るまで操作します。その後、30度の角度で赤外線眼底画像を撮影します。次に、赤外線眼底ビデオを撮影します。790 nanometerのICGフィルターをオンにし、カメラモードを高速撮影（high speed addition）に設定し、視野角を15～30度に維持します。その後、すべての測定においてICG強度を85に設定します。コントロールパネルで「acquire」ボタンをクリックし、8.8～15 frames per secondの速度で1分間、ベースラインビデオを撮影します。次に、30ゲージの針を装着したインスリン用注射器に100 µLのICG標識赤血球を充填し、尾静脈または後眼窩的に細胞を注入します。注入直後に、新しい赤外線眼底画像と新しいICGフィルタービデオを撮影します。ビデオの取得後、画像解析のためにTIFF形式でエクスポートします。無料で利用可能な画像解析ソフトウェアパッケージであるMHJを用いて画像を処理します。ファイルを開いた後、速度測定のために画像ビデオのフレーム間隔を設定します。次に、MtrackJプラグインを開きます。メニューからtrackingを選択し、点を追加した後に次のタイムフレームインデックスに移動するオプションを有効にします。これで、目的の細胞を特定し、各フレームにわたって追跡します。メニューから「add」をクリックして新しいトラックを追加し、選択した細胞をクリックします。その後、フレームが進むにつれて、細胞の現在位置をクリックし続けます。トラッキングが完了したら、軌跡の表示オプションから表示形式を変更し、現在の時刻におけるトラックポイントのみを表示するように選択してください。細胞の軌跡が表示されるまでクリックを続け、その後トラックを保存します。次に、「add」コマンドから始めて、最初の細胞と同様の手順で次の細胞のトラッキングを行います。目的のすべての細胞のトラッキングが完了したら、「measure」オプションを使用して、すべてのトラック測定結果の表示を開きます。その後、さらなる解析のために出力を保存します。1.5%ICGでラベル化した赤血球を、1%または5%のヘマトクリット値を用いてC57 black 6Jマウスの網膜血流で可視化しました。細胞の識別は可能でしたが、1%ヘマトクリットの方がラベル化された細胞をより容易に可視化できました。いずれの注入濃度においても、乳頭周囲領域でいくらかの赤血球停滞が観察され、それは5%ヘマトクリットにおいてより顕著に認められました。白血球を1%フルオレセインナトリウムで標識し、蛍光顕微鏡を用いて緑色に標識された細胞として可視化した。一部に凝集が観察された。この手法に習熟すれば、適切に実施することで6時間で完了させることができる。本手順を実施する際は、高品質な網膜画像および動画を取得するために、散瞳させることが重要です。

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