酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ
2017年3月18日
G4 Resolvase1はG4結合タンパク質のための最も厳しい報告親和性でG-四重鎖（G4）の構造に結合し、HeLa細胞におけるG4-DNA巻き戻し活性の大部分を表しています。我々は、具体的には、触媒活性組換えG4R1を精製するための親和性およびG4-Resolvase1のATP依存性巻き戻し活性を活かした新たなプロトコルを記述します。
この方法の全体的な目標は、独自のATP依存性精製ステップを使用して細菌発現系からG-四重鎖ヘリカーゼG4 Resolvase1タンパク質を単離し、ほぼ純粋で触媒活性のある酵素を単離することです。この方法は、研究者が幅広いin vitro生化学アッセイにおいて、ほぼ純粋で触媒活性な組換えG4 Resolvase1タンパク質を取得するのに役立ちます。この技術の主な利点は、誤って折りたたまれた酵素または触媒的に不活性な酵素をタンパク質調製物から排除することです。
ATPを使用してG-四重鎖ヘリカーゼを溶出するというアイデアは、非常に高い塩濃度でもG4ビーズから触媒活性酵素を溶出できなかった後に始まりました。テキストプロトコールに記載されているように、G-四重鎖Resolvase1またはG4R1を発現する大型の細菌培養物を調製し、増殖させます。バクテリアペレットを3ミリリットルのTNバッファーで室温で解凍します。
ボトルを手に持ち、渦巻き回してバクテリアペレットを解凍し、再懸濁します。解凍して比較的均一に懸濁したら、TNバッファーで容量を最大5ミリリットルにします。次に、培養物ごとに20ミリグラムのリゾチームを250マイクロリットルの水に溶解し、再懸濁した細菌に加えます。
リゾチームが手に持ったボトルを回しながら、約5〜10分間バクテリアを消化させます。消化が進むにつれて、懸濁液の色はわずかに薄くなり始め、懸濁液は比較的粘性がなくなります。250マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル(PICと略される)を追加します。
次に、ロイペプチンの10マイクロリットルアリコートを1つ加え、よく混ぜます。懸濁液を氷の上に置き、10ミリリットルの冷たいTNバッファーと22マイクロリットルのベータメルカプトエタノールまたはBMEを追加します。サスペンションを50ミリリットルのチューブに移します。
30%の振幅に設定されたデジタル超音波装置で氷上の細菌を超音波処理します。2秒オンと2秒オフで1分間パルスします。超音波処理を3回繰り返し、超音波処理ステップの間に少なくとも2分間サンプルを氷上で冷却します。
次に、等量の冷たい4つのX生理食塩水クエン酸ナトリウムまたはSSCとBME、PIC、およびロイペプチンを加え、懸濁液を混合します。摂氏4度に予め冷却された卓上遠心分離機で、ライセートを2、300倍Gで20分間遠心分離します。次に、上清を事前に冷却した新鮮な50ミリリットルチューブに移します。
1mLのストレプトアビジン常磁性ビーズ、または1培養あたりSPB懸濁液を1mL取り、1.5mlの微量遠心チューブに移します。SPBを磁石でペレット化します。次に、2つのX SSCと5ミリモルのEDTA PH8でSPBを2回洗浄します。
次に、洗浄したSPBを同じ溶液の200マイクロリットルに再懸濁します。G4 DNAの3 ODアリコートをSPB懸濁液に1つ追加します。数回ピペッティングしてすばやく混合します。
次に、チューブをローテーターに置き、室温で少なくとも30分間回転させます。この回転期間の後、0.4%ラクトアルブミンを1ミリリットル追加してG4結合SPBをブロックし、必要になるまで氷上に保ちます。ヒスチジンタグ付き組換えG4R1をコバルトビーズに結合するには、清澄化された細菌溶解物を含む50ミリリットルのチューブごとに1ミリリットルのコバルトビーズスラリーを追加します。
混合物をローテーター上で室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、コバルトビーズを摂氏4度の卓上遠心分離機でGの110倍で5分間スピンダウンします。液体を慎重に吸引し、ペレット化されたコバルトビーズを乱さないように数ミリリットルの液体を残します。
その後、10〜15ミリリットルの冷たい4×SSCとBMEでビーズを洗い、前と同じようにビーズをペレット化します。次に清澄化したライセートをペレット状のコバルトビーズに注ぎます。ローテーター上で室温でさらに20分間インキュベートし、ビーズを10〜15ミリリットルの4つのX SSCとBMEで洗浄します。
次に、ビーズをGの100倍で摂氏4度で5分間ペレット化します。2回目の洗浄後、液体を吸引し、チューブの底に約2ミリリットルのビーズと液体を残します。タンパク質結合コバルトビーズを、1ミリリットル幅のピペットチップを使用して、予め冷却した2ミリリットルチューブに移します。
2ミリリットルのチューブ内のビーズを、摂氏4度の微量遠心分離機で高速で短時間遠心分離します。タンパク質結合コバルトビーズを失わないように注意しながら、ピペッティングにより上清を静かに取り除き、廃棄します。0.5ミリリットルのヒスチジン溶出緩衝液(HEB)をビーズにピペットで固定し、チューブを反転させて再懸濁します。
次に、コバルトビーズをHEB中のローテーターで5分間、冷蔵室でインキュベートします。次に、懸濁液を18,000倍Gで摂氏4度の微量遠心分離機で1分間遠心分離します。コバルトビーズの上に少量の液体を残しながら、慎重にピペッティングして、上清を含むタンパク質を静かに取り除きます。
上清を予冷した15ミリリットルのチューブに移します。これらの手順を繰り返して、合計3回のHEB溶出を行います。次に、0.2モルのEDTAでPH 6.0で1回溶出します。
コバルトビーズの色は、EDTAがコバルトをキレート化するにつれてピンクから白に変わります。この第4の最終的な溶出を15ミリリットルチューブに移した後、1ミリリットルのピペットチップの端にあるゲルローディングチップを使用して、コバルトビーズからの残留溶出バッファーをピペットで移します。先端をチューブの底に突っ込むことで、溶出バッファーを含む残留タンパク質を回収することができる。
準備したG4 SPBを磁石でチューブの側面に誘導し、上清を捨てます。次に、1ミリリットルの3つのXresバッファーをG4 SPBとピペットで加えて混合します。3つのX resバッファーに懸濁したG4 SPBを、HEB EDTAを含む約2ミリリットルのタンパク質を含む15ミリリットルのチューブにピペットで移します。
摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートし、ビーズが沈殿しないように時々攪拌します。テキストプロトコールに記載されているようにタンパク質結合G4 SPBを洗浄した後、G4 SPBを氷上に磁石でペレット化し、ビーズを100マイクロリットルの予熱した溶出バッファーに再懸濁します。直ちにビーズを予熱したPCRチューブに移し、摂氏37度で30秒間インキュベートします。
すぐに5モルの塩化ナトリウムの12マイクロリットルを追加し、ピペットで激しく上下に20〜30回。溶出バッファーに含まれる高塩とATPの組み合わせにより、G4ビーズから組換えG4R1が溶出されます。直ちにG4 SPBを磁石でペレット化し、溶出物を含むタンパク質を氷上の新しいPCRチューブに移します。
溶出を繰り返して最終生成物を移した後、精製された組換え体G4R1を含む約200マイクロリットルの溶出緩衝液である。最後に、品質管理酵素活性アッセイを実施して、高活性組換えG4R1がテキストプロトコルに記載されているように精製されているかどうかをテストします。G4アッセイは、組換えG4R1酵素活性の尺度を提供します。
酵素の0.2〜0.013マイクロリットルの範囲内で、通常、テトラメチルローダミン標識四分子G4 DNAの0.2ピコモルの50%がモノマーに変換されることが観察されます。精製組換え体G4R1のクマシースタンディングは、予想される120キロダルトンのサイズで単一のバンドを示し、約75キロダルトンのマイナーな汚染バンドがあります。このバンドは、ATP依存的な方法でG4 DNAビーズを溶出に結合する能力を維持している切断された組換えG4R1を表していてもよい。
目的のバンドは、タンパク質標準曲線に対して定量されます。このプロトコルは、通常、細菌培養1リットルあたり200〜100ナノモル精製酵素の200マイクロリットルを得る。このビデオを見れば、独自のATP依存性精製ステップを使用して細菌発現系からG4 Resolvase1タンパク質を精製し、ほぼ純粋で触媒活性のある酵素を単離する方法を十分に理解できるはずです。
一度習得し、凍結したバクテリアペレットを事前に調製すれば、組換えG4R1の精製は約6時間で行うことができます。酵素の最適な触媒活性を維持するためには、特に断りのない限り、調製物を氷上に保つことが重要です。常にプロテアーゼ阻害剤を使用してください。
チューブ内に気泡が形成されないようにしてください。精製された酵素を迅速に凍結し、不必要な凍結融解サイクルを避けてください。開発後、この技術は、この分野の研究者がこのタンパク質の広範なDNAおよびRNA基質への結合親和性とヘリカーゼ活性を正確に定義する道を開きました。
この方法は、酵素反応の生成物が酵素の結合基質でなくなった他のATP依存性核酸酵素の精製にも適応できます。
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概要
この記事は、細菌系からG-四重体ヘリカーゼG4リゾルバーゼ1タンパク質を分離する手法を紹介します。この技術はATP依存性の精製ステップを利用して、ほぼ純粋で触媒活性の高い酵素を生成し、様々なin vitro生化学的アッセイに不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- タンパク質精製
- 分子生物学
背景
- G4リゾルバーゼ1はG-四重体構造に高い親和性を持っています。
- HeLa細胞におけるG4-DNAのアンワインディングにおいて重要な役割を果たしています。
- 以前の手法では、G4ビーズから触媒活性の高い酵素を溶出させることに苦労していました。
- ATPが効果的な溶出のための重要な要因であることが特定されました。
研究目的
- G4リゾルバーゼ1タンパク質を精製する信頼性の高い手法を開発すること。
- 触媒活性の高い酵素の分離を確実にすること。
- 生化学的アッセイにおけるG4リゾルバーゼ1の使用を促進すること。
使用した方法
- G4リゾルバーゼ1を発現する大規模な細菌培養を育成します。
- TNバッファーで細菌ペレットを解凍します。
- ATPを使用してG4ビーズから酵素を溶出させます。
- 分離されたタンパク質の純度と活性を評価します。
主要な結果
- この方法はほぼ純粋なG4リゾルバーゼ1を成功裏に分離します。
- ATP依存性の精製は非活性酵素を効果的に除外します。
- 分離された酵素は高い触媒活性を示します。
- この技術は様々な生化学的アッセイに適用できます。
結論
- 開発された方法はG4リゾルバーゼ1を精製するのに効率的です。
- 研究用の活性酵素の信頼できる供給源を提供します。
- この手法はG-四重体構造を含む研究を強化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Purifying catalytically active G4 Resolvase1 enables mechanistic studies of G-quadruplex biology, a target class with implications in oncology and gene regulation. The ATP-dependent elution strategy addresses a key bottleneck in isolating functional helicases, improving confidence in downstream biochemical assays. This approach supports target validation by providing a reliable source of active enzyme for screening and profiling efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of G4-resolving enzyme activity to validate G4 structures as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a purified active enzyme source for consistent assay readouts in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields enzyme with defined helicase activity for use in biochemical screens targeting G4-modulating compounds.
- Operational Value: ATP-dependent purification step reduces false positives by excluding misfolded or inactive enzyme fractions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by enabling quantitative measurement of G4 unwinding kinetics in disease-relevant contexts.
- Operational Value: Facilitates biomarker-aligned assays by linking enzyme activity to G4 substrate resolution in cellular models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation requires functional protein to assess modulator effects on G4 dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing active G4R1 to probe G4 structure resolution in vitro.
- Screening: Enables assay readiness through production of homogeneous, catalytically active compound screening reagent.
- Analytics: Generates quantitative activity readouts via G4-DNA unwinding assays to compare inhibitor or activator effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing assessment of G4R1 modulation in disease models where G4 stability impacts transcription or replication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable purification platform for ATP-dependent nucleic acid enzymes beyond G4R1.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation studies by ensuring enzyme functionality.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized elution conditions that isolate active protein.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by minimizing false negatives from inactive enzyme preparations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of G4-targeting compounds based on reliable biochemical profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, affinity purification, and enzymatic activity assays.
- Dependent on access to streptavidin beads, cobalt resins, G4-DNA substrates, and ATP-containing buffers.
- Necessitates standardization across teams for consistent bead binding, washing, and elution conditions.
- Adaptation to other ATP-dependent enzymes requires validation of substrate binding and elution conditions.
- Activity must be validated post-purification to confirm catalytic function, as purity alone does not guarantee activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Lyse Bacterial Pellets Expressing Human Recombinant G4 Resolvase1 (rG4R1)
3:06
Prepare G4-magnetic Beads
4:07
Bind Histidine-tagged rG4R1 to Cobalt Beads
5:47
Elute rG4R1 from Cobalt Beads
7:07
Bind rG4R1 to G4-bound SPB and Elute in an ATP-dependent Manner
8:55
Results: Analysis and Quantification of Catalytically Active, Purified rG4R1
10:06
Conclusion
