Name: 酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学ぶG4 Resolvase1タンパク質の精製法。ATP依存性の親和性精製により、細菌発現系から高純度で触媒活性を持つ酵素を単離します。生化学アッセイに適した活性酵素の調製が可能です。

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我々は（PJS）は寛大（JPVに）陶器財団からの贈り物、（PJSへ）HealthGrant T32-CA079448の国立研究所、およびボール州立大学のスタートアップ資金を含め、当社の資金源に感謝したいと思います。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていません。

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
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<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
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<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
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<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
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<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、DHX36遺伝子産物、G4-Resolvase1（またラウとDHX36呼ばG4R1）（ 図1）を単離するための非常に効率的な発現、精製、および定量化スキームを表します。 G4-DNA複合化ビーズ上のHisタグの親和性コバルト親和性ビーズ上での精製と酵素精製：このプロトコルは、2つの精製工程を利用しています。後者のステップは、それがrG4R1はG4構造に持っているタイトな親和性、高特異性、および触媒巻き戻し活性を活用するという点で独特です。 G4構造のためのタイトな親和性（低pMの範囲のK d）は大幅に非特異的なタンパク質の存在を減少させる、G4のビーズから溶出前に（塩化ナトリウムの溶解度限界に近い）高塩洗浄を可能にします。 G4構造上G4R1の触媒活性は、ATPおよびMgCl 2の添加時にアクティブrG4R1の特定の溶出を可能にします。この二段階精製スキームが一貫して高純度の生成しますほとんどの生化学分析に適した量でrG4R1 13、触媒活性。 <p class="jove_conten...

G4構造は、DNAやRNAのグアニンリッチ領域内に形成安定性の高い核酸の二次構造です。 G4構造は、フーグスティーン結合相互作用を介して安定化され、大幅G4構造1、2の顕著な熱安定性に貢献する一価の陽イオン（ すなわち 、K +およびNa +）と中央の空洞内に配位結合しています。初期のバイオインフォマティクス研究は、ヒトゲノムは&gt; 375,000 &quot;潜在的なG4形成モチーフ「3、4含まれていることを示唆しました。さらに最近の研究で推定値は、別の研究は、ヒトゲノム6の716310の異なる潜在的なG4形成配列を予測しながら、G4モチーフの数は、2-5 5倍高いことを示唆しています。 G4形成配列は、進化的に保存し、ランダムに分散されていませんゲノム。 G4のモチーフは、遺伝子コード領域に濃縮され、そしてすべての遺伝子プロモーターの40％の上方には、G4モチーフ7を含んでいます 。興味深いことに、遺伝子G4モチーフの富化の程度は、遺伝子の機能を示唆することが実証されています。例えば、開発に関与するプロトオンコジーンおよび遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子8,9よりG4構造の有意に高い濃縮度を有しています。 高い熱安定性により、ゲノム全体でほぼユビキタスプレゼンス、および大幅に主要な細胞プロセスに影響を与える可能性、細胞がこれらの構造を管理するために酵素を進化させたことを見つけるために驚くべきことではありません。 、我々はヒト（HeLa細胞）細胞10内tetramolecular G4-DNA解消活性の大部分のソースとして特徴づけ; 1つのこのような酵素はG4 Resolvase1（また、ラウとDHX36呼ばG4R1）です。それ以来、それが示されているTHAトンG4R1はしっかりと結合し、触媒G4結合タンパク質11、12、13のための最も厳しい報告KDSとtetramolecularと単分子G4-DNAとG4-RNAを巻き戻します。さらに、G4R1のG4分解活性は、テロメア/テロメラーゼ生物学11、14、15、16、転写及びスプライシング17、18、19、20、現像21、造血を含む生化学的および細胞プロセスの広い範囲に関与しています21、及び免疫調節22、23。 G4シーケンスが優勢と特異的にゲノムと多様な細胞のp全域にG4R1は最近表現し、効率的に高活性rG4R1を精製する能力は、このタンパク質の生化学的メカニズムや行動を解明するために最も重要なのだろう、と関与することが示唆されていることをrocesses。 ここでは、効率的に活性酵素を単離するためにrG4R1のATP依存性、G4分解活性を利用して新規発現および精製スキーム（ 図1）を示しています。このスキームは、酵素反応の生成物は、もはやG4R1の場合のように、結合のための基質であるため、他のATP依存性核酸酵素を精製するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 & micro;細菌プレート/大型培養物中のg / mLカル</td></tr><tr><td>ベニシリン(植物細胞培養試験済み)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro;細菌プレート/大規模培養物中のg / mL</td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム(鶏卵白由来)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>または標準供給源</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl、pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>年または標準源から</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl、pH 8.8</td><td></td><td></td><td>キャスティング分離ゲル用(タンパク質定量ゲル用);標準供給源から</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl、pH 6.8</td><td></td><td></td><td>スタッキングゲルのキャスティング用(タンパク質定量ゲル用)。標準供給源</td></tr><tr><td>1 Mトリスアセテート、pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>年または標準供給源から</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td>標準供給源から</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (1&nbsp;M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>または標準供給源</td></tr><tr><td>から&beta;-メルカプトエタノール(2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr>ロイ<tr><td>ペプチン半硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr>スト<tr><td>レプトアビジン常磁性ビーズ</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA、pH 8&nbsp;</td><td>ユニバーサル・サイエンティフィック・サプライ株式会社&nbsp;</td><td>0718</td><td>または標準供給源</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA、pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>標準的な供給源から;最初にNaOHでpHを調整し、次にHClでpHを下げます。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>A-ラクトアルブミン(ウシ乳由来1型)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>コバルト金属アフィニティービーズ</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷</td>河 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン5'-三リン酸(細菌源由来)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド/ビス溶液 (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>でタンパク質ゲルランニングバッファー (192 mM グリシン、25 mM トリス塩基、0.1% SDS)</td></tr> <tr><td>10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>タンパク質ゲルランニングバッファー (192 mM グリシン、25 mM トリス塩基、0.1% SDS) を調製するか、または標準供給源</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td>は<td>、標準供給源</td><td></td></tr>の<tr><td>Trisベース</td><td>であるFisher Scientific</td><td>BP152-1</td>を11666703001または標準供給源から使用して、<td>タンパク質ゲルランニングバッファー(192 mMグリシン、25 mMトリスベース、0.1%SDS)を調製します。標準供給源</td></tr><tr><td>から TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>広範囲タンパク質 MW マーカー</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 Z33 オリゴ ("Z33-Bio")</td> <td>オリゴ Etc</td><td></td><td>5'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-ビオチン 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33オリゴ("Z33-TAM")</td><td>オリゴなど</td><td></td><td>5'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>フッ素コーティングTLCプレート</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H2</>O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>マルチバンドUVランプ</td><td></td><td></td><td>365nm</td></tr><tr><td>でUV光を放射可能卓上遠心分離機(スイングバケットローター付き)</td><td></td><td></td><td>4°Cまで冷却可能。C</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td></td><td></td><td>4°Cに冷却可能。C</td></tr><tr><td>デジタル Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>または超音波処理パルスを送達できる同等品 (30% 振幅、2 秒 ON/2 秒 OFF)</td></tr><tr><td>50 &deg;Cウォーターバス</td><td></td><td></td><td>Z33を4重37°Cに形成するため</td></tr><tr><td>。Cイン</td><td></td><td></td>キュベーター <td>Rosetta2 E. coliの大規模な培養物の細菌の形質転換および初期一晩成長に、TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg;C/14&nbsp;&deg;Rosetta2</td><td></td><td></td><td>E. coliの大きい文化の成長そして蛋白質の誘導のための細菌のための TriEx4-DHX36</td></tr><tr>OD600 を読むことができる分光<td>光度計</td><td></td><td></td><td>; 塩基配列(Biorad SmartSpec 3000のような)に基づいてオリゴマーの集中を読める</td></tr> 温度<tr><td>計</td><td></td><td></td><td>標準的な源</td></tr><tr><td>のPCRストリップの管</td><td></td>から<td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>15 mL および 50 mL 遠心チューブ (ポリプロピレン)</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (2.0 mL)</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>500 mL 遠心分離ボトル (ポリプロピレン)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップおよび血清学的ピペット</td><td></td><td></td>の標準配列 標準<td>ソースから</td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>自動繰り返しピペット</td><td></td><td></td><td>rG4R1の迅速な分注に。標準ソースから</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>Laemlli サンプルバッファー&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>大型スラブゲルを実行するための装置</td><td>Biorad</td><td></td> 私たちは、Biorad Magnet Life Technologies 12301Dの<td>Protean II xiセル装置を使用しています</td></tr> One <tr><td></td><td></td><td></td><td>Lambda(現在はThermo Fisher Scientificブランド)の磁石を使用しています。そして、LifeもThermoの子会社であるため、ここにリストされている磁石は適切な交換</td></tr><tr><td>用カミソリの刃</td><td></td><td></td><td>である必要があります標準ソースから</td></tr><tr><td>濾紙と漏斗</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>ガラスキャセロール皿</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>キワイプ</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>クリアシートプロテクター</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>スキャナーおよび関連TWAINソフトウェア</td><td></td><td></td><td>標準ソースから</td></tr><tr><td>Fuji Multiguageなどの</td><td>画像解析ソフトウェア</td><td></td><td></td>、または同等の</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>または同等のもの&nbsp;</td></tr></tbody></table>

酵素的に活性g4 resolvase1の精製のためのg-四重鎖dna親和性のアプローチ

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

高次核酸構造は、両方のDNAおよびRNAのグアニンリッチ領域に形成することができ、G四重鎖（G4において、G4構造）と呼ばれ、非常に熱的に安定です。そこヒトゲノム中に375,000の推定上のG4形成配列が&gt;であり、それらは、プロモーター領域、非翻訳領域（UTR）、およびテロメア反復内で濃縮されています。このような複製および転写などの細胞プロセスに影響を与えるために、これらの構造のための潜在的に、細胞は、それらを管理するために酵素を進化してきました。 1つのこのような酵素は生化学的に我々の研究室と長嶺らが共同で特徴付けられたG4リゾルバーゼ1（G4R1）、です。そして、G4-DNAとG4-RNA（低pMの範囲内の K d）の両方に非常に強固に結合することが判明。 G4R1は、HeLa細胞溶解物中のG4分解活性の大部分の原因であるとからテロメア代謝、リンパ開発、遺伝子転写、造血および免疫監視において役割を果たすことが示唆されています。 EFする能力ficiently表現し、触媒活性G4R1がG4構造とG4分解酵素の動力学的相互作用にさらなる洞察を得ることに興味を持って研究室のために重要である浄化。ここでは、組換えG4R1（rG4R1）の精製のための詳細な方法について説明します。説明する手順は、C末端ヒスチジンタグ付き酵素の伝統的な親和性に基づく精製は、ATPで活性の高い酵素を精製するために、G4-DNAに結合し、くつろぐのにrG4R1の能力の活用でヒト・コドン最適化された細菌において発現組み込ん依存溶出工程。プロトコルはまたrG4R1の酵素活性は、G4-DNAをほどくする精製酵素の能力を調べることによって測定される品質管理ステップを含みます。この方法はまた、精製rG4R1の定量化を可能にすることが記載されています。このプロトコルの代替適応が議論されています。

このプロトコル（ 図1）は、日常的にほぼ純粋な、触媒活性rG4R1をもたらします。 rG4R1 0.013μLの範囲（ 図上に概説G4活性アッセイによってアッセイし、 - TAMRA標識tetramolecular G4-DNAの0.2ピコモルの50％が0.2の範囲内の単量体に変換される酵素活性の尺度として、それは、典型的に観察され2）。精製rG4R1のクマシー染色は、G4-DNAビーズを結合し、ATP依存性に溶出するために、その能力を維持していることrG4R1を切り捨てとなることができる〜75kDaの、でマイナー汚染バンドで、予想される120 kDaのサイズで単一のバンドを示し、方法（ 図3）。目的のバンドは、タンパク質標準曲線に対して定量化、およびこのプロトコルは、一般的に、細菌培養物1リットルあたり20から100 nMの精製酵素の200μLを取得しています。 <img alt=...

G4 Resolvase1はG4結合タンパク質のための最も厳しい報告親和性でG-四重鎖（G4）の構造に結合し、HeLa細胞におけるG4-DNA巻き戻し活性の大部分を表しています。我々は、具体的には、触媒活性組換えG4R1を精製するための親和性およびG4-Resolvase1のATP依存性巻き戻し活性を活かした新たなプロトコルを記述します。

酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

本手法の全体的な目的は、独自のATP依存性精製ステップを用いて細菌発現系からG-quadruplexヘリカーゼであるG4 Resolvase1タンパク質を単離し、ほぼ純粋で触媒活性を持つ酵素を得ることです。本手法により、研究者は幅広いin vitro生化学アッセイに使用可能な、ほぼ純粋で触媒活性を持つリコンビナントG4 Resolvase1タンパク質を調製することができます。この技術の主な利点は、誤って折り畳まれたタンパク質や、その他の理由で触媒活性を失った酵素をタンパク質調製物から排除できることです。非常に高い塩濃度においても、触媒活性を持つ酵素をG4ビーズから溶出させることができなかったため、ATPを用いてG-quadruplexヘリカーゼを溶出させるというアイデアが生まれました。テキストプロトコルに記載されている通り、G-quadruplex Resolvase1またはG4R1を発現させた大量の細菌培養物を調製し、育成させます。室温で3 mLのTN緩衝液を用いて細菌ペレットを融解させます。ボトルを手で持ち、回転させるように振って細菌ペレットを融解し、再懸濁させます。融解して比較的均一に懸濁したところで、TNバッファーを用いて液量を5 mLに調整します。次に、培養液1本あたり20 mgのリゾチームを250 µLの水に溶解し、再懸濁した細菌に加えます。ボトルを手で回しながら、リゾチームで細菌を約5〜10分間消化させます。消化が進むにつれて懸濁液の色がわずかに薄くなり、粘性が比較的低くなります。プロテアーゼ阻害剤カクテル（略称：PIC）を250 µL加えます。次に、ロイペプチンを10 µLずつ1分注し、十分に混ぜ合わせます。懸濁液を氷上に置き、冷えたTNバッファー10 mLとβ-メルカプトエタノール（BME）22 µLを加えます。その後、懸濁液を50 mLチューブに移します。デジタルソニケーターを振幅30%に設定し、氷上で細菌をソニケーションします。2秒間のオンと2秒間のオフを1分間繰り返します。このソニケーションを3回繰り返し、各ステップの間にはサンプルを氷上で少なくとも2分間冷却させてください。次に、同量の冷却した4X saline sodium citrate（SSC）にBME、PIC、およびleupeptinを加えた溶液を加え、懸濁液を混合します。4°Cに予冷した卓上遠心機を用い、ライセートを2,300 ×gで20分間遠心分離します。その後、上清を予冷した新しい50 mLチューブに移します。培養あたり1 mLのストレプトアビジン常磁性ビーズ（SPB懸濁液）を採取し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マグネットを用いてSPBをペレット化します。その後、2X SSCに5 mM EDTA（pH 8）を加えた溶液でSPBを2回洗浄します。次に、洗浄したSPBを同溶液200 µLで再懸濁します。ここにOD 1/3のG4 DNA分注液をSPB懸濁液に加えます。ピペッティングで数回素早く混ぜ合わせます。次に、チューブをローテーターにセットし、室温で少なくとも30分間回転させます。回転操作の後、0.4% lactalbuminを1 mL加えてG4結合SPBをブロッキングし、使用時まで氷上で保持します。ヒスチジンタグ付きリコンビナントG4R1をコバルトビーズに結合させるため、清澄化した細菌溶解液を含む各50 mLチューブに、コバルトビーズスラリーを1 mL加えます。混合液をローテーターを用いて室温で20分間インキュベートします。インキュベート後、4°Cの卓上遠心機を用い、110 ×gで5分間遠心分離してコバルトビーズを沈殿させます。液を慎重に吸引し、ペレット化したコバルトビーズを乱さないよう、数mLの液を残しておきます。次に、ビーズを10〜15 mLの冷 4 X SSC plus BMEで洗浄し、前述と同様にビーズをペレット化します。次に、清澄化したライセートをペレット化したコバルトビーズに注ぎます。ローテーターを用いて室温でさらに20分間インキュベートし、ビーズを10〜15 mLの 4 X SSC plus BMEで洗浄します。次に、ビーズを4°Cで100 ×gにて5分間遠心分離してペレット化します。2回目の洗浄後、上清を吸引し、チューブの底にビーズと液体を約2 mL残します。タンパク質が結合したコバルトビーズを、1 mLのワイドボアピペットチップを用いて、あらかじめ冷却した2 mLチューブに移します。2 mLチューブに入ったビーズを、4 °Cのマイクロ遠心機を用いて高速で短時間遠心します。タンパク質が結合したコバルトビーズを損失しないよう注意しながら、ピペッティングで上清を静かに除去し、廃棄します。0.5 mLのヒスチジン溶出バッファー（HEB）をビーズに添加し、チューブを転倒混和して再懸濁させます。次に、コバルトビーズをHEB中でローテーターを用い、低温室で5分間インキュベートします。続いて、4 °Cに設定したマイクロ遠心機を用いて、懸濁液を18,000 ×gで1分間遠心分離します。ピペッティングで慎重に、タンパク質を含む上清を除去し、コバルトビーズの上に少量の液体が残るようにします。上清をあらかじめ冷却した15 milliliterチューブに移します。これらの手順を繰り返し、計3回のHEB溶出を行います。その後、PH 6.0の0.2 molar EDTAで1回溶出します。EDTAがコバルトをキレートするにつれて、コバルトビーズの色はピンクから白に変化します。この4回目にして最後となる溶出液を15 mLチューブに移した後、1 mLピペットチップの先端にゲルローディングチップを取り付け、コバルトビーズから残りの溶出バッファーをピペットで回収します。チップをチューブの底まで到達させることで、タンパク質を含む残りの溶出バッファーを回収できます。マグネットを用いて、調製したG4 SPBをチューブの側壁に寄せ、上清を廃棄します。次に、G4 SPBに3X res bufferを1 mL加え、ピペッティングして混合します。3X res bufferに懸濁させたG4 SPBを、約2 mLのタンパク質含有HEB EDTAが入った15 mLチューブにピペッティングして移します。ビーズが沈殿しないよう時々撹拌しながら、37 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってタンパク質結合G4 SPBを洗浄した後、氷上でマグネットを用いてG4 SPBをペレット化し、あらかじめ温めておいた溶出バッファー100 µLでビーズを再懸濁します。直ちにビーズをあらかじめ温めておいたPCRチューブに移し、37 °Cで30秒間インキュベートします。5 M の塩化ナトリウムを 12 µL 速やかに加え、ピペッティングで 20 ～ 30 回激しく撹拌します。溶出バッファーに含まれる高濃度の塩と ATP の組み合わせにより、G4 ビーズからリコンビナント G4R1 が溶出されます。直ちにマグネットを用いて G4 SPB をペレット化し、タンパク質を含む溶出液を氷上の新しい PCR チューブに移します。溶出と転移を繰り返した後、最終産物は精製された組換えG4R1を含む約200 microlitersの溶出バッファーとなります。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、活性の高い組換えG4R1が精製されたかどうかを確認するため、品質管理のための酵素活性測定を行います。G4アッセイにより、組換えG4R1の酵素活性を測定できます。酵素において0.2から0.013 µLの範囲内では、通常、0.2 pmolのテトラメチルローダミン標識四分子G4 DNAの50%がモノマーに変換されることが観察されます。精製した組換えG4R1のクマシー染色では、期待される120 kDaのサイズに単一のバンドが見られ、約75 kDaに少量の不純物バンドが認められます。このバンドは、ATP依存的にG4 DNAビーズに結合し溶出する能力を維持している、切断された組換えG4R1である可能性があります。目的のバンドをタンパク質標準曲線に基づいて定量します。このプロトコルでは、通常、細菌培養液1リットルあたり 20から100 nanomolar の精製酵素を 200 microliters 得ることができます。このビデオを視聴することで、独自のATP依存性精製ステップを用いて細菌発現系からG4 Resolvase1タンパク質を精製し、ほぼ純粋で触媒活性を持つ酵素を単離する方法について十分に理解できるはずです。習得し、凍結細菌ペレットを事前に準備しておけば、組換えG4R1の精製は約6時間で完了します。酵素の最適な触媒活性を維持するため、特に指示がない限り、調製物は常に氷上に保持することが重要です。プロテアーゼ阻害剤を必ず使用してください。チューブ内での気泡形成を避けてください。精製した酵素は速やかに凍結させ、不必要な凍結融解サイクルを避けてください。この手法の開発により、このタンパク質と広範囲のDNAおよびRNA基質との結合親和性およびヘリカーゼ活性を正確に定義することが可能になりました。この手法は、酵素反応の産物が酵素の結合基質ではなくなるような、他のATP依存性核酸酵素の精製にも応用可能です。

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酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

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