酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

本手法の全体的な目的は、独自のATP依存性精製ステップを用いて細菌発現系からG-quadruplexヘリカーゼであるG4 Resolvase1タンパク質を単離し、ほぼ純粋で触媒活性を持つ酵素を得ることです。本手法により、研究者は幅広いin vitro生化学アッセイに使用可能な、ほぼ純粋で触媒活性を持つリコンビナントG4 Resolvase1タンパク質を調製することができます。この技術の主な利点は、誤って折り畳まれたタンパク質や、その他の理由で触媒活性を失った酵素をタンパク質調製物から排除できることです。

非常に高い塩濃度においても、触媒活性を持つ酵素をG4ビーズから溶出させることができなかったため、ATPを用いてG-quadruplexヘリカーゼを溶出させるというアイデアが生まれました。テキストプロトコルに記載されている通り、G-quadruplex Resolvase1またはG4R1を発現させた大量の細菌培養物を調製し、育成させます。室温で3 mLのTN緩衝液を用いて細菌ペレットを融解させます。

ボトルを手で持ち、回転させるように振って細菌ペレットを融解し、再懸濁させます。融解して比較的均一に懸濁したところで、TNバッファーを用いて液量を5 mLに調整します。次に、培養液1本あたり20 mgのリゾチームを250 µLの水に溶解し、再懸濁した細菌に加えます。

ボトルを手で回しながら、リゾチームで細菌を約5〜10分間消化させます。消化が進むにつれて懸濁液の色がわずかに薄くなり、粘性が比較的低くなります。プロテアーゼ阻害剤カクテル（略称：PIC）を250 µL加えます。

次に、ロイペプチンを10 µLずつ1分注し、十分に混ぜ合わせます。懸濁液を氷上に置き、冷えたTNバッファー10 mLとβ-メルカプトエタノール（BME）22 µLを加えます。その後、懸濁液を50 mLチューブに移します。

デジタルソニケーターを振幅30%に設定し、氷上で細菌をソニケーションします。2秒間のオンと2秒間のオフを1分間繰り返します。このソニケーションを3回繰り返し、各ステップの間にはサンプルを氷上で少なくとも2分間冷却させてください。

次に、同量の冷却した4X saline sodium citrate（SSC）にBME、PIC、およびleupeptinを加えた溶液を加え、懸濁液を混合します。4°Cに予冷した卓上遠心機を用い、ライセートを2,300 ×gで20分間遠心分離します。その後、上清を予冷した新しい50 mLチューブに移します。

培養あたり1 mLのストレプトアビジン常磁性ビーズ（SPB懸濁液）を採取し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マグネットを用いてSPBをペレット化します。その後、2X SSCに5 mM EDTA（pH 8）を加えた溶液でSPBを2回洗浄します。

次に、洗浄したSPBを同溶液200 µLで再懸濁します。ここにOD 1/3のG4 DNA分注液をSPB懸濁液に加えます。ピペッティングで数回素早く混ぜ合わせます。

次に、チューブをローテーターにセットし、室温で少なくとも30分間回転させます。回転操作の後、0.4% lactalbuminを1 mL加えてG4結合SPBをブロッキングし、使用時まで氷上で保持します。ヒスチジンタグ付きリコンビナントG4R1をコバルトビーズに結合させるため、清澄化した細菌溶解液を含む各50 mLチューブに、コバルトビーズスラリーを1 mL加えます。

混合液をローテーターを用いて室温で20分間インキュベートします。インキュベート後、4°Cの卓上遠心機を用い、110 ×gで5分間遠心分離してコバルトビーズを沈殿させます。液を慎重に吸引し、ペレット化したコバルトビーズを乱さないよう、数mLの液を残しておきます。

次に、ビーズを10〜15 mLの冷 4 X SSC plus BMEで洗浄し、前述と同様にビーズをペレット化します。次に、清澄化したライセートをペレット化したコバルトビーズに注ぎます。ローテーターを用いて室温でさらに20分間インキュベートし、ビーズを10〜15 mLの 4 X SSC plus BMEで洗浄します。

次に、ビーズを4°Cで100 ×gにて5分間遠心分離してペレット化します。2回目の洗浄後、上清を吸引し、チューブの底にビーズと液体を約2 mL残します。タンパク質が結合したコバルトビーズを、1 mLのワイドボアピペットチップを用いて、あらかじめ冷却した2 mLチューブに移します。

2 mLチューブに入ったビーズを、4 °Cのマイクロ遠心機を用いて高速で短時間遠心します。タンパク質が結合したコバルトビーズを損失しないよう注意しながら、ピペッティングで上清を静かに除去し、廃棄します。0.5 mLのヒスチジン溶出バッファー（HEB）をビーズに添加し、チューブを転倒混和して再懸濁させます。

次に、コバルトビーズをHEB中でローテーターを用い、低温室で5分間インキュベートします。続いて、4 °Cに設定したマイクロ遠心機を用いて、懸濁液を18,000 ×gで1分間遠心分離します。ピペッティングで慎重に、タンパク質を含む上清を除去し、コバルトビーズの上に少量の液体が残るようにします。

上清をあらかじめ冷却した15 milliliterチューブに移します。これらの手順を繰り返し、計3回のHEB溶出を行います。その後、PH 6.0の0.2 molar EDTAで1回溶出します。

EDTAがコバルトをキレートするにつれて、コバルトビーズの色はピンクから白に変化します。この4回目にして最後となる溶出液を15 mLチューブに移した後、1 mLピペットチップの先端にゲルローディングチップを取り付け、コバルトビーズから残りの溶出バッファーをピペットで回収します。チップをチューブの底まで到達させることで、タンパク質を含む残りの溶出バッファーを回収できます。

マグネットを用いて、調製したG4 SPBをチューブの側壁に寄せ、上清を廃棄します。次に、G4 SPBに3X res bufferを1 mL加え、ピペッティングして混合します。3X res bufferに懸濁させたG4 SPBを、約2 mLのタンパク質含有HEB EDTAが入った15 mLチューブにピペッティングして移します。

ビーズが沈殿しないよう時々撹拌しながら、37 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってタンパク質結合G4 SPBを洗浄した後、氷上でマグネットを用いてG4 SPBをペレット化し、あらかじめ温めておいた溶出バッファー100 µLでビーズを再懸濁します。直ちにビーズをあらかじめ温めておいたPCRチューブに移し、37 °Cで30秒間インキュベートします。

5 M の塩化ナトリウムを 12 µL 速やかに加え、ピペッティングで 20 ～ 30 回激しく撹拌します。溶出バッファーに含まれる高濃度の塩と ATP の組み合わせにより、G4 ビーズからリコンビナント G4R1 が溶出されます。直ちにマグネットを用いて G4 SPB をペレット化し、タンパク質を含む溶出液を氷上の新しい PCR チューブに移します。

溶出と転移を繰り返した後、最終産物は精製された組換えG4R1を含む約200 microlitersの溶出バッファーとなります。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、活性の高い組換えG4R1が精製されたかどうかを確認するため、品質管理のための酵素活性測定を行います。G4アッセイにより、組換えG4R1の酵素活性を測定できます。

酵素において0.2から0.013 µLの範囲内では、通常、0.2 pmolのテトラメチルローダミン標識四分子G4 DNAの50%がモノマーに変換されることが観察されます。精製した組換えG4R1のクマシー染色では、期待される120 kDaのサイズに単一のバンドが見られ、約75 kDaに少量の不純物バンドが認められます。このバンドは、ATP依存的にG4 DNAビーズに結合し溶出する能力を維持している、切断された組換えG4R1である可能性があります。

目的のバンドをタンパク質標準曲線に基づいて定量します。このプロトコルでは、通常、細菌培養液1リットルあたり 20から100 nanomolar の精製酵素を 200 microliters 得ることができます。このビデオを視聴することで、独自のATP依存性精製ステップを用いて細菌発現系からG4 Resolvase1タンパク質を精製し、ほぼ純粋で触媒活性を持つ酵素を単離する方法について十分に理解できるはずです。

習得し、凍結細菌ペレットを事前に準備しておけば、組換えG4R1の精製は約6時間で完了します。酵素の最適な触媒活性を維持するため、特に指示がない限り、調製物は常に氷上に保持することが重要です。プロテアーゼ阻害剤を必ず使用してください。

チューブ内での気泡形成を避けてください。精製した酵素は速やかに凍結させ、不必要な凍結融解サイクルを避けてください。この手法の開発により、このタンパク質と広範囲のDNAおよびRNA基質との結合親和性およびヘリカーゼ活性を正確に定義することが可能になりました。

この手法は、酵素反応の産物が酵素の結合基質ではなくなるような、他のATP依存性核酸酵素の精製にも応用可能です。