チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

この実験の全体的な目標は、新しい光依存性イオンチャネルの塩化物選択性を決定することです。この方法は、光電流振幅、速度論、イオン選択性など、チャネルロドプシンの生物物理学における重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、生物物理学的チャネル活性を直接読み出すことができ、迅速かつ容易に複製できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、HEK細胞の調製から光電流の記録までの実験手順の各ステップを最適化する必要があるため、苦労するでしょう。HEK細胞の播種と切断は、Altina Kleinによって実証されます。この手順を開始するには、100ミリリットルの細胞内緩衝液と500ミリリットルの細胞外緩衝溶液の固体成分を別々のビーカーで計量します。

次に、調製したストック溶液のそれぞれの量を追加します。次に超純水を加え、酸と塩基を用いてpHを慎重に調整します。次に、グルコースによる浸透圧を細胞内溶液と細胞外溶液でそれぞれ290ミリオスモルと320ミリオスモルに調整します。

この手順では、最大3つのリジンコーティングされたガラスカバースリップを35ミリメートルのシャーレに並べて配置します。次に、各皿に10%FBSと1マイクロモルレチノールを添加した2ミリリットルの標準DMEMに1.5倍から5番目のHEK細胞を播種します。各ディッシュの細胞をトランスフェクションするには、FBSを含まない250マイクロリットルのDMEMと6マイクロリットルのトランスフェクション試薬に2マイクログラムのプラスミドDNAの溶液を調製します。

15分間のインキュベーション後、溶液を細胞に穏やかに加えます。測定する前に、マイクロピペットプーラーを使用して低抵抗のパッチピペットを引っ張り、ファイヤーポリッシュします。ピペットは、測定当日のためにほこりのない容器に保管してください。

録画の30分前に、すべてのセットアップコンポーネントの電源を入れて、動作温度まで加熱します。バッファーが室温にあることを確認します。まず、測定チャンバーをシリコンで密閉して、外部バッファーの漏れを防ぎます。

次に、カバースリップを1枚チャンバーに入れて閉じます。細胞が剥離するのを防ぐために、チャンバーに細胞外バッファーを慎重に充填します。ペトリ皿は、次の一連の実験のために、他のカバースリップと一緒にインキュベーターに保管します。

次に、40X対物レンズを使用して測定チャンバーを顕微鏡下に配置し、細胞を可視化します。次に、バス電極にオーガーブリッジを取り付け、液面センサーとバスハンドラーの灌流出口と一緒にチャンバー内に配置します。細胞外溶液を1ミリリットルの新鮮な外部溶液と2回交換して、残留培地と分離した細胞を取り除きます。

細胞に焦点を合わせ、他の細胞から単離する必要があるトランスフェクションされた細胞を検索します。次に、トリプルバンドフィルターセットとオレンジ色の光を使用して、mCherryを励起して視覚化します。次に、引っ張ったピペットの1つに細胞内溶液を入れます。

そして、ピペットを数回ひっくり返して気泡を取り除きます。その後、ピペットをピペットホルダーに取り付け、先端の目詰まりを防ぐために正圧を加えます。顕微鏡下でパッチピペットの先端の位置を特定し、マイクロマニピュレーターを使用して細胞の近くでナビゲートします。

データ収集ソフトウェア内で、バスモードでメンブレンテストを開始し、電圧ステップを印加します。ピペット抵抗が1.3〜3.0メガオームの所望の範囲にあるかどうかを確認します。次に、オフセット電流をゼロにし、アンプのピペットオフセットノブを回してピペット電位を調整します。

全細胞構成でパッチを確立するには、パッチピペットを上からゆっくりと細胞に近づけ、細胞に触れる直前に陽圧を解放します。その後、セルにアタッチされた構成が自動的に形成されることがあります。細胞に近づいた後、メンブレンテストをBathモードからPatchモードに変更します。

ピペットの静電容量補正ノブを回してピペットの静電容量を補正し、テストパルスの平坦な応答を取得します。メンブレンテストをセルモードに切り替えます。次に、負圧または強度を増す負圧の短いパルスを適用することにより、シールを破壊することなくパッチを破裂させ、全細胞確認を取得します。

直列抵抗補償を開始するには、セル全体の 2 つのパラメーター (セル容量と直列抵抗) を設定します。直列抵抗補償パネルでは、予測と補正を最大90%オンにし、次に全細胞補償スイッチをオンにし、全細胞パラメータを反復的に調整して、理想的にフラットなテストシール応答を取得します。全細胞構成を確立した後、少なくとも2分間待ってから記録し、パッチピペットで細胞内溶液を十分に交換します。

さまざまな保持電位で光誘起電流を記録します。次に、パッチを破壊せずにチャンバー内で細胞外緩衝液を低塩化物に少なくとも5回交換し、新しい塩化物濃度で別の電流電圧関係を記録します。この図は、緑色の光で照らされている間、PsACR1 は高速過渡電流を特徴とし、これが静止電流レベルまで急速に減衰することを示しています。

ライトがオフになると、光電流はミリ秒単位でゼロに減衰します。細胞外への塩化物濃度を下げると、外向きの光電流が完全になくなります。細胞外塩化物濃度を交換すると、電流電圧プロットから推定できる反転電位がシフトします。

複数の測定から反転電位を評価することで、外部塩化物濃度の変動によって引き起こされる劇的な反転電位シフトを定量化します。驚くべきことに、測定された反転電位は、計算された塩化物のネルンスト電位に直接対応しており、PsACR1の高い塩化物選択性が確認されています。このビデオを見れば、チャネルロドプシンを発現するHEK細胞で光誘起光電流の電気生理学的記録を行う方法について十分に理解できるはずです。

一度マスターすれば、光電流の記録には数時間かかるのに対し、すべての手順を4日で完了することができます。この手順を補完するために、部位特異的突然変異誘発法および分光法を実施して、チャネルロドプシンの構造的特徴および細胞メカニズムをさらに解明することができる。チャネルロドプシンの特性評価と分子工学は、神経科学の研究者が選択したニューロンの興奮性を光で操作する道を開きました。