ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

この原子間力顕微鏡実験の全体的な目標は、DNA修復タンパク質とDNAの損傷部位との相互作用を解明し、さまざまなタンパク質複合体による異なるDNA相互作用を区別することです。この方法は、特定のDNA修復システムがDNA内の標的病変をどのように認識するかなど、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、DNA病変認識プロセスに関与するさまざまな種類の複合体を直接見て分析できることです。

この手順を実証するのは、学士課程の研究中にこのアプローチを使用したニコラス・ワースです。まず、プラスミドに一本鎖DNAギャップを作製して、適切なDNA基質を調製します。修飾された一本鎖DNAオリゴヌクレオチドでギャップを埋め、最後に、適切な制限酵素を使用して血漿DNAを直鎖化します。

これらの実験では、二本鎖DNA基質は約1, 000塩基対の長さで、DNA病変と、DNAにタンパク質をロードするためのDNAバブルと呼ばれる不対領域が含まれています。次に、まず10x Reaction Bufferと水をマイクロリアクションチューブにピペットで移し、AFM分析用のタンパク質DNAサンプルを調製します。次に、調査中のDNAとタンパク質を添加します。

例えば、ここでは、DNAサンプルの100ナノモルと、真核生物のヌクレオチド除去修復タンパク質XPDおよびp44のそれぞれと1マイクロモルである。次に、反応を37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを短時間スピンダウンします。

次に、サンプルを配置するためのマイカ基板を準備します。メスを使用して、大きなストリップから1センチずつ雲母を切り取ります。次に、粘着テープを使用してマイカの最上層を剥がし、清潔で平らで解剖学的に滑らかな基板表面を明らかにします。

AFM蒸着バッファー中でタンパク質DNAサンプルを50倍から100倍に拡張し、希釈したサンプルの20マイクロリットルをすぐにマイカ表面に沈着させます。希釈係数はサンプル濃度によって異なります。マイカ表面にサンプルを沈着させた直後に、数ミリリットルのろ過脱イオン水でサンプルを3〜4回すすぎ、余分な液体を吸い取ります。

穏やかな窒素の流れを使用して、サンプルをブロードライします。最後に、粘着テープを使用して、サンプルの端を顕微鏡スライドに固定します。サンプルをAFMステージの中央に置き、磁気パッドを使用して顕微鏡スライドをステージに固定します。

次に、AFMチップをチップホルダーに挿入します。クランプの下のホルダーに先端を固定しますamp ネジを指で締めるように締めます。固定したら、チップホルダーをAFM測定ヘッドに入れます。

位置決めネジを使用して、サンプルを中央の位置に移動します。AFM測定ヘッドをサンプルの上に置き、ヘッドがステージのくぼみの内側に脚を固定して安定して立っていることを確認します。次に、AFMレーザーをカンチレバーの背面に合わせ、最適な信号強度を実現します。

AFMビデオウィンドウで反射信号を見て、レーザーを大まかに位置決めします。このAFMモデルでは、AFM測定ヘッドの右側と背面のホイールを回して、AFMレーザーのX位置とY位置を調整し、カンチレバーの端に中央を向けます。次に、2つのホイールでレーザー位置を微調整することにより、検出器の合計信号を最適化します。

AFMレーザーの反射を検出器の中心に向けるには、検出器アレイの上部と下部のダイオードからの異なる信号をゼロにします。この手順では、このAFMモデルの測定ヘッドの左側にあるネジを回します。次に、ソフトウェアのマスターパネルチューンウィンドウに移動して、カンチレバーの滞留周波数を決定します。

カンチレバー振動を駆動するピエゾの1ボルト入力に対応する振幅を選択し、発振周波数を滞留周波数よりわずかに低い負の5%に設定します。次に、自動周波数調整を実行し、振動の位相をゼロにします。ドリフトを避けるために、イメージングを開始する前に約1時間、システムを熱平衡状態にしてください。

イメージングを開始する準備ができたら、ソフトウェアのメインパネルで保護設定値を設定し、エンゲージを選択してチップをサンプル表面に近づける準備をします。保護設定または設定値に達するまで、AFMヘッドの前輪を手動で下げます。次に、Zセンサー信号が左に完全に伸びるまで、前輪をさらに慎重に下げます。

振動振動テーブルをアクティブにし、防音エンクロージャを閉じます。次に、ハムスターホイールを使用してAFMソフトウェアの設定値を下げ、AFMチップをサンプルに細かくかみ合わせます。反発領域でタッピングモードイメージングを実行するには、位相信号が自由レベル位相よりわずかに低くなるまで設定値を下げます。

次に、サンプルのスキャンを開始します。ピクセル解像度がそれぞれ2,048または4,096のピクセル解像度で、4マイクロメートル×4マイクロメートル×4マイクロメートルまたは8マイクロメートルの正方形の画像表面積で、毎秒2.5マイクロメートルのスキャン速度を使用します。をクリックし、[スキャンを実行]ボタンを押します。AFMソフトウェアで画像を直接目視検査することにより、関連するタンパク質DNA複合体を事前に選択します。

XPDサンプルの場合、可能な複合体には、XPD p44 DNAのほか、XPDとp44の分子量が異なるため、サイズが明確に異なるXPD DNAとp44 DNAが含まれます。解析ウィンドウのセクションツールを使用して、DNA上の個々のタンパク質ピークの量を測定し、セクションウィンドウカーソルでタンパク質ピークセクションの高さと直径を測定します。これらの値を使用して、単純な数学的モデルを使用してピークのボリュームを決定し、複素タイプを確認します。

最後に、分子量がわかっているさまざまなタンパク質でAFMシステムをキャリブレーションし、これらのボリュームをタンパク質およびタンパク質複合体のおおよその分子量に変換します。DNA断片の長さ、DNA上のタンパク質複合体の位置、およびそれらの標的部位特異性またはDNAバンド角度などの追加の特徴を決定するには、添付のテキストプロトコールを参照してください。ここに示されているのは、3種類のDNA結合複合体を持つAFM画像で、サイズの違いによって区別できます。

クラス1複合体はヘリカーゼ活性化因子p44のみと一致し、クラス2複合体はXPDタンパク質のみで構成され、クラス3複合体はXPDとp44の両方から構成され、XPDによるレギオン認識にはp44によるヘリカーゼ活性の活性化が必要であり、クラス3複合体のみが病変認識を示す。さまざまな病変認識戦略を特定するために、DNA基質上のタンパク質の位置を測定し、原核生物および真核生物のNERヘリカーゼについて赤で示されているDNA病変からの5つのプライム方向または3つのプライム方向のDNAバブルでのタンパク質ローディングを測定しました。タンパク質の位置分布では、DNA損傷位置での結合が促進されるため、DNA損傷の認識がピークとして見られます。

原核生物のNERヘリカーゼUVRBとその真核生物の対応物であるXPDは、CPD病変認識の異なる戦略を示しており、DNA鎖の好みが異なることを示しています。具体的には、CPD病変は、UVRBによって転座した鎖で認識されますが、XPDによって反対の非転座鎖で優先的に認識されます。この方法を習得すると、分析を含めて数時間または数日で完了します。

高純度のタンパク質およびDNAサンプルを使用して、AFM画像の特徴を解釈し、生物学的システムや対処したい問題に応じてDNA基質を慎重に設計することが重要です。さらに、ゲル電気泳動空間、エレクトロモビリティシフト、DNA切開アッセイなどのアンサンブル法は、もちろん、これらのAFM実験を高度に補完します。また、これらの方法は、DNA結合親和性やDNA病変の切除活動など、追加の問題に対処するのに役立ちます。この手法は、タンパク質DNA複合体を直接視覚化するための比較的高速でシンプルなアプローチであり、これらの複合体は、生物学的システムで発生するプロセスをよく把握することができます。

もちろん、これはDNA修復過程の理解に役立つだけでなく、他のタンパク質DNAシステムにも応用できます。このビデオを見れば、お気に入りのタンパク質DNAシステムでサンプルを調製する方法、AFMでサンプルをイメージングする方法、データの解釈に役立つパラメータを抽出する方法について、かなり理解できるはずです。