Name: ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いたDNA損傷修復タンパク質の相互作用解析法。ヌクレオチド切除修復システムにおける損傷認識メカニズムを可視化し、タンパク質複合体の違いを区別する技術を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PUC19N、CPD含有オリゴヌクレオチド、およびp44は、Samuel Wilson、Korbinian HeilおよびThomas Carell、およびGudrun MichelsおよびCaroline Kiskerによりそれぞれ提供された。この研究は、ドイツForschungsgemeinschaft（DFG）FZ82およびTE-671/4からITへの助成金によって支えられました。

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

特定の標的部位を含む長いDNA断片上のタンパク質の結合位置のAFM統計分析は、これらの部位2,3,4,5,6を認識するためにタンパク質が用いる特定の戦略に関する興味深い詳細を明らかにすることができる。得られた位置分布を解釈するために、DNA中の標的の位置を正確に知る必要がある。これは、明確な配列位置に特異的部位を環状プラスミドDNAに導入し、この特異的部位を含むDNAの断片を制限酵素技術を用いて切断することによって達成される。タンパク質結合位置のAFM画像解析では、正確な長さ（切断断片の全長と一致する）のDNA断片のみが含まれ得るが、これは標的部位の位置が既知であるためである。それは価値がない本明細書中に記載される調製手順は、2つの区別できない断片末端を有する線状DNA基質を生じることを示す。したがって、位置分布は、0×DNA長（DNA断片末端に結合したタンパク質）から0.5×DNA長（断片の中心に結合したタンパク質）までしか測定およびプロットすることができない。さらに、基質の正確に中心に位置しない標的位置については、これらの分布は常に、他のDNA末端から同じ距離に非特異的に結合したタンパク質の小さなバックグラウンドを含む。しかし、ガウ...

原子間力顕微鏡（AFM）は、タンパク質-DNA相互作用1,2,3,4,5,6,7,8,9の解析に強力な技術です。単一分子レベルの分解能で異種試料を直接視覚化するには、少量の試料材料しか必要としない。異種性は、タンパク質の異なる立体配座またはオリゴマー状態から生じ得る。特に、タンパク質-DNA試料に関しては、タンパク質複合体は、一般にDNA結合によって誘導されるか、またはDNA内の特定の標的部位に結合する異なる化学量論および/またはコンホメーションを示すことができる。異種試料はまた、2種類（またはそれ以上）の異なる種類のタンパク質および異なるタンパク質複合体形態（ 例えば 、1つのタイプのタンパク質対ヘテロメリック複合体のみからなる）はDNAと異なって相互作用することができる。ここで論じた研究は、これらのタンパク質の標的を表す病変を含む長い（約900塩基対、bp）DNA断片に結合したDNA修復タンパク質の静的乾燥サンプルの空気中でのAFMイメージングを利用する。 AFMの高い分子分解能は、異なるタイプのタンパク質複合体の間の区別を可能にし、DNA断片上のタンパク質の結合位置を決定する。重要なことに、病変は、明確な位置でDNA基質に導入される。 DNA中の病変部位の位置は既知であるので、DNAに結合したタンパク質の分布は、（異なる）タンパク質複合体の（異なる）病変認識特性、 例えばそれらが特定のタイプの病変をどれくらいよく認識するか（ 例えば 、非損傷DNAに対する） <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 4,5,6。 DNA上のそれらの位置はまた、病変部に特異的に結合したタンパク質複合体とDNA上の他の場所に非特異的に結合した複合体との区別を可能にする。これらの異なる複合型（病変部と非特異的複合体に特異的に結合した複合体）の別個の特徴付けは、標的部位の同定に誘導された複合体における立体配座変化を明らかにする可能性がある。 ここで焦点を当てたDNA修復タンパク質は、ヌクレオチド切除修復（NER）経路における病変認識の原因となるヘリカーゼである。細菌では、NERはタンパク質UvrA、UvrBおよびUvrCによって達成される。 UvrAは、UvaA 2 / UvrB 2 DNAスキャン複合体における初期病変感知の原因である。 UvrBによる病変確認の際、この複合体は病変部位で結合した単量体UvrBに変換され、この特定の複合体はp原核生物NERエンドヌクレアーゼUvrC。 UvrCは、病変を含む一本鎖DNA（ssDNA）の短い（12-13nt）ストレッチを切除する。失われたストレッチは、DNAポリメラーゼによって再充填される。最後に、DNAリガーゼは新しく合成されたストレッチを元のDNA 9,10 で密封する。真核生物では、NERカスケードの大部分のタンパク質は、大きな多量体転写因子II H（TFIIH）複合体の一部である。三量体CEN2-XPC-HR23B複合体による初期病変感知の後、TFIIHをDNA標的部位に補充する。複合体内のXPDがNER標的病変の存在を確認すると、真核生物のNERエンドヌクレアーゼXPGおよびXPFが病変を含むssDNAの短い（24〜32nt）ストレッチを切除するために補充される9,10 。ここでは、具体的には、原核生物および真核生物NER由来のヘリカーゼUvrBおよびXPDをそれぞれ研究した。これらのヘリカーゼは、2つのDNA一本鎖のうちの1つに糸を通し、続いてATP加水分解によってこの鎖に沿って転位するDNA（DNAバブル）。したがって、DNA損傷に加えて、DNAバブルが、タンパク質の負荷部位として機能する基質に導入された。 特異的病変DNA基質の調製手順は以前に記載されている11 。それは、ニカナーゼのための2つの密接に隔てられた制限部位を有する環状DNA構築物（プラスミド）を必要とする。この研究の文脈では、プラスミドpUC19N（2729bp）を使用した（S. Wilsonの実験室、NIEHSによって作製された）。このプラスミドは、48ヌクレオチド（nt）のストレッチを構成するニカナーゼNt.BstNBIの3つの密接に隔てられた制限部位を含む。ニカナーゼとのインキュベーション後、これらの部位間のssDNAのストレッチを除去し、任意の標的特性を含むオリゴヌクレオチドで置き換えることができる。各工程の後、完全な酵素消化をアガロースゲル電気泳動。ニッキングされた環状DNAは、元のスーパーコイルプラスミドと比較してその電気泳動移動度が低いために区別することができる。 DNAのギャップ付けおよび除去されたストレッチの特定の基質オリゴヌクレオチドによる置換は、基質のみをニックの間の領域内で切断する制限酵素による消化によって評価することができる。したがって、酵素による環状プラスミドの直線化は、ギャップを有するDNAについて抑制され、特異的オリゴヌクレオチドの挿入後に回復する。最後に、2つのエンドヌクレアーゼ制限部位（理想的には単一のカッター）は、線状DNA基質の生成を可能にし、長さは所望の通りであり、特定の標的部位と定義された位置にDNA泡があり、 &#39;または3&#39;方向。 NERヘリカーゼによる病変の認識は、AFMイメージングによって調べることができる。 tにおけるヘリカーゼのDNA転位の停止病変部位は、DNA上のタンパク質位置分布のピークとして見え、病変認識を示す。これらのヘリカーゼのDNA転位はさらに5 &#39;から3&#39;の極性で方向性があるため、装填部位（病変の上流または下流のDNAバブル）の位置に対する病変認識の依存性も病変が優先的に認識されるかどうかを示す転位されたまたは反対の、非転座のssDNA鎖5,9。以下のセクションでは、使用される方法が紹介され、これらの実験からの主要な所見が簡単に議論される。重要なことに、ここに示すDNA修復の例示的な研究に類似して、AFMイメージングは​​、DNA複製または転写などの異なるDNA相互作用系の研究に適用することができる8,12,13,14 </。

<table><tbody><tr><td>分子力プローブ(MFP) 3D</td><td>アサイラム研究</td><td>N/A</td><td>原子間力顕微鏡(AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>コンピュータ</td></tr><tr><td>ThermoMixer and 1.5 mL block</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>DNA調製用ヒートブロック</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 & 0.5 mLチューブ用ブロック</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 &Y267.1</td><td>タンパク質DNAインキュベーション用ヒートブロック</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>ゲルキャスターと電源付き電気泳動チャンバー</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>電気泳動電源</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D ローター付き</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>テーブル遠心分離機</td></tr><tr><td>Ultra-Lum 電子UVtransillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>UV照射テーブル</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>UV分光光度計</td></tr><tr><td>TKAX-CAD 0.2 &mu;mカプセルフィルター</td><td>ユニティラボサービス</td><td>N / A</td><td>水脱イオンおよびフィルターユニット</td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFPソフトウェアIgor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>のN / A</td><td>AFMソフト</td></tr><tr><td>ImageJ (オープンソースJava画像処理)</td> <td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>画像解析ソフト</td></tr><tr><td>Excel(Microsoft Office)</td><td>マイクロソフト株式会社</td><td>N/A</td><td>データ解析ソフト</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td>統計データ解析・グラフ作成ソフト</td></tr><tr><td>名</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>素材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>オリンパス</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM カンチレバー</td></tr><tr><td>グレード V-5 マスコバイト</td><td>SPI</td><td>1805</td><td>マイカ シート</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>遠心分離機用フィルター</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp;Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>アガロースゲル抽出キット</td></tr><tr><td>Rotilabo セルロース ペーパータイプ 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>AFM 蒸着ブロッティングペーパー</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0.02 &mu;m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td>シ<td>リンジ</td></tr><tr><td>フィルターSSpI、BspQI</td><td>ニューイングランドバイオラボス(NEB)</td><td>R0132、DNA</td><td>基質調製のための</td>R0712制限酵素</tr><tr><td>XhoI、BglII</td><td></td><td>R0146、DNA調製のためのR0146、R0144</td>制限<td>酵素は</td></tr><tr><td>、ニッキング制限酵素Nt.BstNBI</td><td>ニューイングランドバイオラボス(NEB)</td><td>R0607</td>ニ<td>ッカーゼ</td></tr><tr><td>T4DNAリガーゼ</td><td>を制御しますニューイングランドバイオラボ(NEB)</td><td>M0202S</td><td>リガーゼ</td></tr><tr><td>トリス、HEPES</td><td>カールロスGmbH</td><td>4855、9105</td><td>緩衝剤</td></tr><tr><td>NaCl、MgCl2、KCl、MgAcetate</td><td>カールロスGmbH</td><td>3957、HN03、HN02、P026</td><td>塩化学薬品</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>塩薬品</td></tr><tr><td>DTT、TCEP、EDTA</td><td></td><td>6908、HN95、8040</td><td>化学薬品/試薬</td></tr><tr><td>アガロース、酢酸、HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267、3738、K025</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>ヌクレオチド</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド #1 表 1</td><td>Biomers</td><td>カスタム</td><td>補完 DNA オリゴヌクレオ</td></tr><tr><td>チド オリゴヌクレオチド #2、#3、#6 表 1</td><td>Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td>カスタム</td><td>フルオレセインオリゴヌクレオチド</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド #4&nbsp; および #5 (表 1 の</td><td>プライベート) (TriLink や GlenResearch などから入手可能)</td><td></td> <td>CPD オリゴヌクレオチドを含む</td></tr><tr><td>SafeSeal 反応チューブ 0.5 mL および 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 および 72.706</td><td>インキュベーションチューブ</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA ラダー</td></tr><tr><td>6x 濃縮ゲルローディング色素 パープル</td><td>新品England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>DNAローディング色素</td></tr><tr><td>ミドリ・グリーン&nbsp;</td><td>日本ジェネティクスヨーロッパGmbH</td><td>999MG28055DNA</td><td>染色</td></tr></tbody></table>

ヌクレオチド切除修復におけるdna損傷認識の原子間力顕微鏡検査

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFMイメージングは、タンパク質-DNA相互作用の研究のための強力な技術です。この単一分子法では、不均一なサンプル中の異なる分子と分子集合体を同時に分離できます。したがって、DNA相互作用タンパク質システムの特定の状況では、さまざまなタンパク質複合体の形態と、DNA断片を含む標的部位上のそれらに対応する結合位置を区別することができます。ここでは、原核生物および真核生物のヌクレオチド除去DNA修復(NER)システムにおけるDNA損傷認識の研究へのAFMの応用を紹介します。DNAおよびタンパク質サンプル調製の手順が説明され、実験の実験的および分析的詳細が提供されます。このデータにより、NERタンパク質による標的部位の検証を達成するための戦略について重要な結論が得られます。興味深いことに、彼らは、病変の種類に応じて、真核生物のNERシステムの病変認識と同定の異なるアプローチを示しています。さらに、原核生物と真核生物のNERに関与する2つの異なるヘリカーゼの異なる構造特性は、これら2つのシステムで観察された異なる戦略をもたらし、説明しています。重要なことは、これらの実験的および分析的アプローチは、DNA修復の研究だけでなく、複製や転写プロセスに関与する他のDNA相互作用タンパク質システムにも非常に同様に適用できるということです。

タンパク質複合体の体積に基づいて異なる複合型を区別する原核生物のNERヘリカーゼUvrBのヘリカーゼ活性は、DNA結合によって刺激される22,23 。 UvrBは、2つの単一のssDNA鎖のうちの1つに正確にロードするために、DNA（DNAバブル）中に不対領域を必要とする。 インビボでは、このDNA構造は、NERカスケードの別のタンパク質を介したDNA相互作用によって提供される。 インビトロ実験では、バブルは、標的病変のすぐ近くのdsDNA断片に人為的に導入することができる。タンパク質 - タンパク質相互作用はまた、UvrB 9による DNA結合を増強する。しかしながら、一旦UvrBがDNAにロードされると、その活性はタンパク質補因子に依存しないように見える9 。対照的に、真核生物...

ここでは、ヌクレオチド除去修復システムを例に、単一分子AFMイメージングによるさまざまなDNA病変認識アプローチの研究が実証されています。DNAおよびタンパク質サンプル調製の手順と、AFM実験の実験的および分析的詳細について説明します。

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

この原子間力顕微鏡実験の全体的な目標は、DNA修復タンパク質とDNAの損傷部位との相互作用を解明し、さまざまなタンパク質複合体による異なるDNA相互作用を区別することです。この方法は、特定のDNA修復システムがDNA内の標的病変をどのように認識するかなど、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、DNA病変認識プロセスに関与するさまざまな種類の複合体を直接見て分析できることです。この手順を実証するのは、学士課程の研究中にこのアプローチを使用したニコラス・ワースです。まず、プラスミドに一本鎖DNAギャップを作製して、適切なDNA基質を調製します。修飾された一本鎖DNAオリゴヌクレオチドでギャップを埋め、最後に、適切な制限酵素を使用して血漿DNAを直鎖化します。これらの実験では、二本鎖DNA基質は約1, 000塩基対の長さで、DNA病変と、DNAにタンパク質をロードするためのDNAバブルと呼ばれる不対領域が含まれています。次に、まず10x Reaction Bufferと水をマイクロリアクションチューブにピペットで移し、AFM分析用のタンパク質DNAサンプルを調製します。次に、調査中のDNAとタンパク質を添加します。例えば、ここでは、DNAサンプルの100ナノモルと、真核生物のヌクレオチド除去修復タンパク質XPDおよびp44のそれぞれと1マイクロモルである。次に、反応を37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを短時間スピンダウンします。次に、サンプルを配置するためのマイカ基板を準備します。メスを使用して、大きなストリップから1センチずつ雲母を切り取ります。次に、粘着テープを使用してマイカの最上層を剥がし、清潔で平らで解剖学的に滑らかな基板表面を明らかにします。AFM蒸着バッファー中でタンパク質DNAサンプルを50倍から100倍に拡張し、希釈したサンプルの20マイクロリットルをすぐにマイカ表面に沈着させます。希釈係数はサンプル濃度によって異なります。マイカ表面にサンプルを沈着させた直後に、数ミリリットルのろ過脱イオン水でサンプルを3〜4回すすぎ、余分な液体を吸い取ります。穏やかな窒素の流れを使用して、サンプルをブロードライします。最後に、粘着テープを使用して、サンプルの端を顕微鏡スライドに固定します。サンプルをAFMステージの中央に置き、磁気パッドを使用して顕微鏡スライドをステージに固定します。次に、AFMチップをチップホルダーに挿入します。クランプの下のホルダーに先端を固定しますamp ネジを指で締めるように締めます。固定したら、チップホルダーをAFM測定ヘッドに入れます。位置決めネジを使用して、サンプルを中央の位置に移動します。AFM測定ヘッドをサンプルの上に置き、ヘッドがステージのくぼみの内側に脚を固定して安定して立っていることを確認します。次に、AFMレーザーをカンチレバーの背面に合わせ、最適な信号強度を実現します。AFMビデオウィンドウで反射信号を見て、レーザーを大まかに位置決めします。このAFMモデルでは、AFM測定ヘッドの右側と背面のホイールを回して、AFMレーザーのX位置とY位置を調整し、カンチレバーの端に中央を向けます。次に、2つのホイールでレーザー位置を微調整することにより、検出器の合計信号を最適化します。AFMレーザーの反射を検出器の中心に向けるには、検出器アレイの上部と下部のダイオードからの異なる信号をゼロにします。この手順では、このAFMモデルの測定ヘッドの左側にあるネジを回します。次に、ソフトウェアのマスターパネルチューンウィンドウに移動して、カンチレバーの滞留周波数を決定します。カンチレバー振動を駆動するピエゾの1ボルト入力に対応する振幅を選択し、発振周波数を滞留周波数よりわずかに低い負の5%に設定します。次に、自動周波数調整を実行し、振動の位相をゼロにします。ドリフトを避けるために、イメージングを開始する前に約1時間、システムを熱平衡状態にしてください。イメージングを開始する準備ができたら、ソフトウェアのメインパネルで保護設定値を設定し、エンゲージを選択してチップをサンプル表面に近づける準備をします。保護設定または設定値に達するまで、AFMヘッドの前輪を手動で下げます。次に、Zセンサー信号が左に完全に伸びるまで、前輪をさらに慎重に下げます。振動振動テーブルをアクティブにし、防音エンクロージャを閉じます。次に、ハムスターホイールを使用してAFMソフトウェアの設定値を下げ、AFMチップをサンプルに細かくかみ合わせます。反発領域でタッピングモードイメージングを実行するには、位相信号が自由レベル位相よりわずかに低くなるまで設定値を下げます。次に、サンプルのスキャンを開始します。ピクセル解像度がそれぞれ2,048または4,096のピクセル解像度で、4マイクロメートル×4マイクロメートル×4マイクロメートルまたは8マイクロメートルの正方形の画像表面積で、毎秒2.5マイクロメートルのスキャン速度を使用します。をクリックし、[スキャンを実行]ボタンを押します。AFMソフトウェアで画像を直接目視検査することにより、関連するタンパク質DNA複合体を事前に選択します。XPDサンプルの場合、可能な複合体には、XPD p44 DNAのほか、XPDとp44の分子量が異なるため、サイズが明確に異なるXPD DNAとp44 DNAが含まれます。解析ウィンドウのセクションツールを使用して、DNA上の個々のタンパク質ピークの量を測定し、セクションウィンドウカーソルでタンパク質ピークセクションの高さと直径を測定します。これらの値を使用して、単純な数学的モデルを使用してピークのボリュームを決定し、複素タイプを確認します。最後に、分子量がわかっているさまざまなタンパク質でAFMシステムをキャリブレーションし、これらのボリュームをタンパク質およびタンパク質複合体のおおよその分子量に変換します。DNA断片の長さ、DNA上のタンパク質複合体の位置、およびそれらの標的部位特異性またはDNAバンド角度などの追加の特徴を決定するには、添付のテキストプロトコールを参照してください。ここに示されているのは、3種類のDNA結合複合体を持つAFM画像で、サイズの違いによって区別できます。クラス1複合体はヘリカーゼ活性化因子p44のみと一致し、クラス2複合体はXPDタンパク質のみで構成され、クラス3複合体はXPDとp44の両方から構成され、XPDによるレギオン認識にはp44によるヘリカーゼ活性の活性化が必要であり、クラス3複合体のみが病変認識を示す。さまざまな病変認識戦略を特定するために、DNA基質上のタンパク質の位置を測定し、原核生物および真核生物のNERヘリカーゼについて赤で示されているDNA病変からの5つのプライム方向または3つのプライム方向のDNAバブルでのタンパク質ローディングを測定しました。タンパク質の位置分布では、DNA損傷位置での結合が促進されるため、DNA損傷の認識がピークとして見られます。原核生物のNERヘリカーゼUVRBとその真核生物の対応物であるXPDは、CPD病変認識の異なる戦略を示しており、DNA鎖の好みが異なることを示しています。具体的には、CPD病変は、UVRBによって転座した鎖で認識されますが、XPDによって反対の非転座鎖で優先的に認識されます。この方法を習得すると、分析を含めて数時間または数日で完了します。高純度のタンパク質およびDNAサンプルを使用して、AFM画像の特徴を解釈し、生物学的システムや対処したい問題に応じてDNA基質を慎重に設計することが重要です。さらに、ゲル電気泳動空間、エレクトロモビリティシフト、DNA切開アッセイなどのアンサンブル法は、もちろん、これらのAFM実験を高度に補完します。また、これらの方法は、DNA結合親和性やDNA病変の切除活動など、追加の問題に対処するのに役立ちます。この手法は、タンパク質DNA複合体を直接視覚化するための比較的高速でシンプルなアプローチであり、これらの複合体は、生物学的システムで発生するプロセスをよく把握することができます。もちろん、これはDNA修復過程の理解に役立つだけでなく、他のタンパク質DNAシステムにも応用できます。このビデオを見れば、お気に入りのタンパク質DNAシステムでサンプルを調製する方法、AFMでサンプルをイメージングする方法、データの解釈に役立つパラメータを抽出する方法について、かなり理解できるはずです。

atomic-force-microscopy-investigations-dna-lesion-recognition

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、細胞核溶解物中のDNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。アッセイは、動態解析に従順DNA修復活性の速度を得られる組織および腫瘍溶解液または精製したタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。...

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

電子分光イメージングは、ナノメートルの分解能で核酸とタンパク質を画像化し、区別することができます。miniSOGシステムと組み合わせることで、透過型電子顕微鏡サンプル中のタグ付きタンパク質を特異的に標識することができます。これらの技術の使用を例として、二本鎖断線修復病巣を使用して説明します。...

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation...

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ...

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ...

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ...

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

このプロトコルは、レーザーマイクロ照射によるDNA修復タンパク質の採用測定など、下流顕微鏡研究のためのS相細胞を効率的に同定するための非侵襲的な方法を記述する。...

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

この作品は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で多塩基多型を検出するためのシンプルで視覚的な方法を提示します。提案手法では、多塩基多型の液滴操作および検出を含む全体の実験は、高度な機器の助けを借りずに、23℃付近で行うことができます。...

空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

ショウジョウバエの卵形成は、ミトコンドリアの増殖と遺伝の研究において非常に有用であり続けています。この原稿では、ショウジョウバエの成体卵巣の複製ミトコンドリアDNA(mtDNA)を5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)で標識するために使用される詳細なプロトコルについて説明しています。これにより、以前は議論の余地があったミトコンドリア遺伝に関連するメカニズムの解明が容易になります。...

EDU染色によりショウジョウバエアダルト卵巣内のミトコンドリアDNA複製のその場の標識で

学ぶ原子間力顕微鏡を用いたDNA損傷修復タンパク質の相互作用解析法。ヌクレオチド切除修復システムにおける損傷認識メカニズムを可視化し、タンパク質複合体の違いを区別する技術を解説します。

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

さらに動画を探す