のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチインビトロ細胞培養

この手順の目標は、培養細胞におけるシトクロムP450(CYP)の活性を測定することです。CYPは、医薬品や毒物の代謝に関与する重要な酵素であり、その発現はin vitroでは保持されないことがよくあります。CYP酵素の正常な発現は、細胞をin vitroで培養すると失われることがよくあります。

したがって、多くのin vitroモデルは、医薬品や毒物の代謝を理解するための関連性を制限する可能性があります。この方法の主な利点は、培養細胞のCYP活性を評価する際のその単純さです。プローブ基質と阻害剤を使用して、質量分析を含むさまざまな定量プラットフォームを示します。

まず、テキストプロトコルに記載されているように、細胞を含む極低温バイアルを入手します。提供されるプロトコルでは、例として肝細胞株を使用します。無菌条件下で作業しながら、極低温バイアルを慎重に開けて過剰な圧力を解放し、極低温バイアルの内容物を、摂氏37度で9ミリリットルの予熱したWilliams'E培地で満たされた10ミリリットルのチューブにピペットで移します。

溶液を室温で400 gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を5ミリリットルの独自の解凍培地に再懸濁し、摂氏37度に予熱し、グルタミンを補充します。テキストプロトコルに記載されているように生細胞を数えた後、ウェルあたり60,000個の生存細胞の密度と0.5ミリリットルの解凍培地の最終体積で、24ウェルコラーゲンコーティングプレートに細胞を播種します。

培養で数日後、細胞はサブコンフルエントな小柱構造を形成します。最適な代謝活動は通常、7日目から10日目の間に観察され、4日目に最も低くなります。分化した気道上皮培養物を調製するには、インサート上の気液界面で成長させた市販の完全分化型一次気道上皮を使用します。

滅菌ピンセットを使用して、細胞インサートをアガロースマトリックスから静かに取り除き、700マイクロリットルの独自の培地を予め充填した新しいプレートに移します。経上皮抵抗や繊毛拍動頻度など、テキスト プロトコルで参照されている方法を使用して、気道組織の完全性を評価します。実験に先立ち、気道細胞用の細胞インサートと肝細胞用のウェルを2つのシリーズを最低3回の繰り返しで調製します。

一方のシリーズは阻害実験に使用し、もう一方は代謝プローブのみに使用します。セルの 3 番目のシリーズをメディアブランクコントロールとして準備します。実験当日は、細胞培養培地を450マイクロリットルの新鮮な培地と交換してください。

10x CYP阻害剤を含む50マイクロリットルの培地を阻害実験用に調製した一連の細胞に加え、30分間プレインキュベートします。次に、阻害シリーズの培地を450マイクロリットルの新鮮な培地と交換し、10x CYP阻害剤と10xプローブ基質の両方を含む50マイクロリットルの培地を添加します。10倍プローブ基板を含む50マイクロリットルの培地を他のセルに加え、次に培地で希釈したビヒクルをブランクセルコントロールに同量加えます。

1番目の時点、ゼロバックグラウンドコントロールで細胞を0〜5分間インキュベートした後、培地を別々の標識チューブに回収し、将来の処理のために培地を凍結します。次に、その時点の2つの細胞を細胞インキュベーターで16時間インキュベートします。インキュベーション期間の終了時に、代謝産物の定量と同じ方法を使用して培地を収集します。

250マイクロリットルのインキュベーション培地を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、4-メチルウンベリフェロン内部標準液を添加して最終濃度100ナノモルに到達します。培地のpHを4.5〜5.0に調整するには、一度に1マイクロリットルのモルHClを追加します。2〜10マイクロリットルの培地をpHストリップにピペットで移し、Helix pamatia由来のベタグルクロニダーゼアリールスルファターゼを150ユニット加えてpHを確認します。

摂氏37度で1時間インキュベートした後、250マイクロリットルの冷メタノールを加えて反応を停止します。45°Cの真空遠心分離機を使用して溶媒を蒸発させます。500マイクロリットルの30%アセトニトリルと水溶液でサンプルを再構成します。

質量分析に基づく定量を行うには、各連続希釈標準試料250マイクロリットルを琥珀色の超高速液体クロマトグラフィーガラスバイアルに添加し、UPLC-MSオートサンプラーに注入します。また、テストサンプルを琥珀色のUPLCバイアルに加え、UPLCオートサンプラーに入れます。すべてのバイアルをランダム化した後、定量する特定のプローブに応じて、テキストプロトコールに詳述されている設定を使用してUPLC-MSを実行します。

質量分析計定量ツールの定量、定量法の構築ツールを使用して、取得した合成標準と内部標準から検量線を生成し、次に定量ウィザードを使用して、定量および定量法を実行するサンプルバッチとサンプルを選択します。CYP1A1、CYP1B1を誘導するには、テキストプロトコルにあるプレートレイアウトを使用します。誘導用に指定された細胞を、最終濃度10ナノモルTCDDの培地で72時間インキュベー

この期間の後、培地を取り出し、PBSでウェルを3回すすぎ、新しい培地を追加します。発光レポータープローブで細胞をインキュベートする前に、誘導された細胞の指定のサブセットを培地中のCYP1A1、CYP1B1阻害剤と30分間事前にインキュベートします。ルミノジェニックプロッベ、ルシフェリン6'クロロエチルエーテルを最終濃度50マイクロモルで非誘導、誘導および誘導プラス阻害剤細胞に加える。

4時間インキュベートした後、25マイクロリットルの培地を白色の不透明な96ウェルプレートに移し、メーカーが提供する25マイクロリットルのルシフェリン検出試薬を添加します。室温で20分間インキュベートした後、すぐにルミノメーターでプレートを読み取ります。ここでは、CYP1A1、CYP1B1によって触媒されるルシフェリン6'クロロエチルエーテルの脱アルキル化によって生成される相対発光を示します。

この例では、TCDD誘導がない場合、酵素活性は示されていません。TCDD誘導後、CYP1A1、CYP1B1活性は、肝臓細胞と呼吸器細胞の両方のタイプで観察されます。最後に、CYP1A1、CYP1B1阻害剤α−ナフトフラボンの添加は、CYP活性を減少または排除する。

肝臓および気道細胞型におけるCYP2A6、2A13活性を評価するために、酵素によるクマリンのヒドロキシル化によって産生される7-ヒドロキシクマリンの量を、UPLC-MSを用いて測定した。クマリンとの0分間のインキュベーションでは、バックグラウンドのみが検出されます。16時間後、クマリンのヒドロキシル化が観察され、2つの細胞型で7-ヒドロキシクマリンが形成されます。

最後に、CYP2A、2A13阻害剤の添加により、7-ヒドロキシクマリンの形成が防止されます。この手法のプローブインキュベーションと定量の一部を習得すると、ほとんどの場合、数時間から最大1日で完了します。このビデオを見れば、さまざまな細胞タイプを使用してさまざまな第1相代謝アッセイを行う方法を理解し、必要に応じて阻害や誘導を使用して酵素の特異性を確認する方法が理解できるはずです。

この手順を試みる際には、細胞タイプが異なればインキュベーション時間が長くなる場合があり、ポジティブコントロールとして使用できる細胞タイプを含めることが不可欠であることを覚えておくことが重要です。TCDDでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、完全な個人用保護具などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。この手法の意味するところは、新薬の前臨床評価や消費者製品に使用される化学物質や成分のリスク評価に適したin vitroモデルの使用にまで及びます。