のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ

この手順の目的は、培養細胞におけるシトクロムP450（CYP）の活性を測定することです。CYPは医薬品や毒性物質の代謝に関与する主要な酵素ですが、in vitroではその発現が維持されないことが多くあります。細胞をin vitroで培養すると、CYP酵素の正常な発現がしばしば失われます。

したがって、多くのin vitroモデルは、医薬品や毒性物質の代謝を理解する上での関連性が限定的である可能性があります。本手法の主な利点は、培養細胞におけるCYP活性を評価する際の簡便さにあります。プローブ基質および阻害剤を用いることで、質量分析を含むさまざまな定量プラットフォームが提示されています。

まず、テキストプロトコルに記載されている通り、細胞が入った凍結保存バイアルを準備します。本プロトコルでは、例として肝細胞株を使用しています。無菌条件下で、凍結保存バイアルを慎重に開けて余分な圧力を逃がした後、バイアルの中身を、37°Cに予熱した9 mLのWilliams' E mediumを満たした10 mLチューブにピペットで移します。

室温で 400 ×g、10 分間、溶液を遠心分離します。上清を捨てた後、37 °C に予熱しグルタミンの補完を加えた 5 mL の専用解凍培地で細胞を再懸濁します。テキストプロトコルに記載されている方法で生存細胞数をカウントした後、1 ウェルあたり 60,000 個の生存細胞の密度で、最終容量 0.5 mL の解凍培地を用い、コラーゲンコートした 24 ウェルプレートに細胞を播種します。

数日間の培養後、細胞は亜合流的な小梁構造を形成します。最適な代謝活性は通常7日から10日の間に観察され、4日目に最も低くなります。分化した気道上皮培養を準備するには、インサート上の気液界面で育成された、市販の完全分化一次気道上皮を使用してください。

滅菌ピンセットを用いて、アガロースマトリックスからセルインサートを慎重に取り出し、700 µLの独自培養液があらかじめ充填された新しいプレートに移します。経上皮電気抵抗や繊毛拍動周波数など、テキストプロトコルで言及されている手法を用いて、気道組織の完全性を評価します。実験に先立ち、気道細胞用のセルインサートと肝細胞用のウェルを、それぞれ最低3つの繰り返し（n=3）を含む2つのシリーズで準備してください。

1つのシリーズを阻害実験に使用し、もう1つのシリーズを代謝プローブのみに使用します。さらに、培地ブランクコントロールとして3つ目の細胞シリーズを準備します。実験当日に、細胞培養培地を450 µLの新鮮な培地に交換します。

10倍濃度のCYP阻害剤を含む培地50 µLを、阻害実験用に準備した一連の細胞に加え、30分間プレインキュベートします。次に、阻害実験군의培地を450 µLの新鮮な培地に交換し、10倍濃度のCYP阻害剤と10倍濃度のプローブ基質の両方を含む培地50 µLを加えます。その他の細胞には、10倍濃度のプローブ基質を含む培地50 µLを加え、ブランク細胞コントロールには、培地で希釈した同量のビヒクルを加えます。

タイムポイント1（0分、背景コントロール）として、細胞を0分から5分間インキュベートした後、培地を個別のラベル付きチューブに回収し、後の処理のために凍結保存します。次に、タイムポイント2の細胞をセルインキュベーター内で16時間インキュベートします。インキュベーション期間の終了後、代謝産物を定量するため、同様の方法で培地を回収します。

250 µLのインキュベーション培地を1.5 mLマイクロチューブに移し、最終濃度が100 nMになるように4-メチルウンベリフェロン内部標準ストック溶液を加えます。1 M HClを1 µLずつ滴下し、培地のpHを4.5から5.0の間に調整します。培地2〜10 µLをpH試験紙に滴下してpHを確認した後、Helix pamatia由来のベタグルクロニダーゼ・アリルスルファターゼを150 units加えます。

37°Cで1時間インキュベートした後、250 µLの冷メタノールを加えて反応を停止させます。真空遠心機を用いて45°Cで溶媒を蒸発させます。その後、サンプルを30%アセトニトリル水溶液500 µLで再構成します。

質量分析ベースの定量を行うには、各連続希釈標準液250 µLを、UPLC-MSオートサンプラー注入用の琥珀色超高性能液体クロマトグラフィー用ガラスバイアルに加えます。同様に、テストサンプルを琥珀色UPLCバイアルに加えてUPLCオートサンプラーにセットします。すべてのバイアルをランダム化した後、定量する特定のプローブに応じて、テキストプロトコルに詳述されている設定を用いてUPLC-MSを実行します。

質量分析計定量ツールにある「Quantitate, Build Quantitation Method」ツールを使用して、得られた合成標準物質および内部標準物質から検量線を生成します。次に、「Quantitation Wizard」を使用して、定量するサンプルバッチとサンプルを選択し、定量メソッドを実行します。CYP1A1およびCYP1B1を誘導するには、テキストプロトコルにあるプレートレイアウトを使用してください。誘導用の細胞を、最終濃度10 nanomolarのTCDDを含む培地で72時間インキュベートします。

この期間の後、培地を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄して、新しい培地を加えます。発光レポータープローブで細胞をインキュベートする前に、誘導した細胞の指定されたサブセットを、培地中でCYP1A1、CYP1B1阻害剤とともに30分間プレインキュベートします。非誘導細胞、誘導細胞、および誘導＋阻害剤添加細胞に、最終濃度50 $\mu$Mの発光プローブであるルシフェリン 6'-クロロエチルエーテルを加えます。

4時間インキュベートした後、25 µLの培養液を白色の不透明な96ウェルプレートに移し、メーカー提供のルシフェリン検出試薬を25 µL添加します。室温で20分間インキュベートした後、ルミノメーターを用いて直ちにプレートを測定します。ここでは、CYP1A1およびCYP1B1によって触媒されるルシフェリン 6'-クロロエチルエーテルの脱アルキル化によって生じる相対発光量を提示します。

この例では、TCDD誘導がない場合には酵素活性が見られません。TCDD誘導後には、肝細胞および呼吸器細胞の両方の細胞型において、CYP1A1およびCYP1B1の活性が観察されます。最後に、CYP1A1およびCYP1B1阻害剤であるα-ナフトフラボンを添加すると、CYP活性が減少または消失します。

肝細胞および気道細胞におけるCYP2A6および2A13の活性を評価するため、酵素によるクマリンの水酸化によって生成される7-ヒドロキシクマリンの量をUPLC LC-MSを用いて測定しました。クマリン添加直後の0分時点では、バックグラウンドのみが検出されました。16時間後には、これら2つの細胞型においてクマリンの水酸化が認められ、7-ヒドロキシクマリンが生成されました。

最後に、CYP2Aおよび2A13阻害剤を添加することで、7-ヒドロキシクマリンの生成を抑制します。習得すれば、本手法におけるプローブのインキュベーションおよび定量ステップは、ほとんどの場合、数時間から最大1日で完了できます。このビデオを視聴することで、さまざまな細胞種を用いて多様な第I相代謝アッセイを実施し、必要に応じて阻害または誘導を用いて酵素の特異性を確認する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を実施する際は、細胞の種類によってインキュベーション時間を長くする必要がある場合があること、およびポジティブコントロールとして使用できる細胞種を必ず含めることが重要です。TCDDの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常にフル装備の個人用保護具を着用するなど、適切な予防措置を講じてください。本手法の意義は、新薬の前臨床評価や、消費者製品に使用される化学物質および成分のリスクアセスメントに適したin vitroモデルの活用にまで及びます。