Name: のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチインビトロ細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶ、質量分析とルミネベースアプローチを用いて培養細胞におけるシトクロムP450活性を評価する方法。薬物代謝研究のためのインビトロモデルの妥当性向上に貢献します。

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著者は、気道細胞と肝細胞の顕微鏡写真を提供してくださったEpithelix SarlとBiopredic Internationalに感謝し、実験手順を説明する図を提供してくださったNeil Smithに感謝します。

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

ABとEMは、この原稿の執筆時点ではブリティッシュ・アメリカン・タバコの従業員でした。この原稿で説明する作業は、ブリティッシュ・アメリカン・タバコによって資金を供給し、このビデオ、記事の掲載料は、ブリティッシュ・アメリカン・タバコによって支払われました。

現在、多くの標準化された毒物学的試験システムは、正常なヒト代謝1の代表的ではない操作細菌、細胞株、または胚細胞を使用します。これは、化学物質や薬の潜在的な毒性活性の不正確な予測につながることができます。このようなチップ上の3D細胞培養および器官などのin vitroモデル 、 革新的な、より良い人間の組織21、22、23の正常な形態および代謝活性を再現する試みで開発されています。代謝能力は、毒性学的評価と薬物生体内変化の研究のために最も適しているモデル解読するために使用することができる1つの基準です。 本稿で概説されているプロトコルは、生細胞を用いたCYP酵素の活性を測定するために設計されています。それは柔軟であり、2Dまたは3D culturにおける異なる細胞系のために使用することができますESと発光性プローブ - または質量分析ベースのアプローチのいずれかを使用するためのオプションを提供しています。両方の方法は、材料のナノグラム量を検出してのみマルチウェル形式で増殖させた細胞の小さな数を必要とするのに十分な感度です。彼らはまた、複雑なマトリックスで栽培回転楕円体または細胞に適用できます。プローブ基板の選択は、明らかに、プロトコルの重要な要素です。アッセイの特異性は、CYP酵素の選択的であるプローブに依存していると保証の別の層は、選択的CYP阻害剤を使用することによって得ることができます。この論文に記載された基質および阻害剤は、ほんの一例ですが、他は文献に見出すことができます。 酵素が低レベルで発現されることに起因する可能性が負CYP活性の結果として新たな細胞型で作業する場合、複数のインキュベーション時間を考慮することが重要です。陽性対照として使用することができる細胞型の添加は、Aを確保することが望ましいです否定結果が技術的な問題にリンクされていないと、トラブルシューティングを支援します。一次肝細胞が代謝的に有能であり、コントロールとして使用することができ、例えば、懸濁液中の初代肝細胞を使用することは非常に容易であるが、それらの生存率は、時間的に限られています。肝細胞株は、このプロトコルに記載のように使用することが比較的容易である可能な代替であるが、一部は代謝活性6、21の点で他のものより優れています。 アッセイは、総タンパク質が定量されていない限り、非破壊的であるため、長期的な研究20時間にわたってCYP活性を追従することが可能です。いくつかの細胞は、培養液中で時間をかけて、可変CYP活性を持つことになりますので、これは重要なポイントです。負の結果は、in vitroでの分化または脱分化との密集度の欠如、進行に伴うかもしれません。その場合には、アプローチは、半quantitatiありますデータは、各細胞培養物中のタンパク質の総量によって正規化されていないのでまし。 TCDDの場合のように組織に対する毒性効果を有することができるプローブ、インヒビターまたはインデューサーへの曝露のようなCYP活性を測定した後、組織を再利用することは常に可能または推奨されません。 例えばミクロソームのような細胞画分はまた、所定の細胞型のCYP活性を特徴付けるために使用することができます。ミクロソーム調製物は、しかし、細胞材料、十分な補因子の添加を多く必要とし、酵素が活性のままであることを保証するためのバッファ。生きた細胞を使用すると、トリッキーなミクロソーム調製工程を排除し、最高の仕事どのバッファおよび補因子ワークアウト。 一般的な推奨事項として、さらにそれが酵素活性と一致することを確認するために、細胞培養物中のCYPの発現プロファイルを特徴づけるためのベストプラクティスです。検証のこの追加のレベルは、代謝プローブがentiないことをお勧め与えられ、単一CYPに固有依存しており、それが測定された代謝活性は、対応する酵素発現によって一致していることを増加確信を与えます。 CYPが膜タンパク質であるので、したがって、それらは、定量的RT-PCRは、これらの酵素20をプロファイリングするための好ましいアプローチであった、ウェスタンブロットのために準備するのが比較的困難です。 このプロトコルが唯一重要なものはあるが、代謝酵素の一のファミリーを表すアッセイCYP酵素活性の方法を記載していることに留意することが重要です。質量分析アプローチの柔軟性がプローブ基板の他の代謝変換の取得方法の開発を可能にします。しかし、それらは、一度に1つを開発する必要があり、現在、少数の知られている特定のプローブおよび他の代謝酵素の家族のための選択的阻害剤です。このギャップは、in vitro細胞systeの代謝能力を総合的に評価を可能にするために取り組むべきですミズ。

生体異物代謝は身体に対して外来の化学物質は、それらの排泄1を容易にするために親水性基とのコンジュゲートの付加によって修飾されるプロセスです。典型的には、生体異物の代謝は、Iは、1つまたは複数のヒドロキシル基1、2を添加した酸化の大部分からなる相との二段階プロセスです。例えばグルクロニドまたは硫酸部分1,2のような親水性結合体のための受容体として、フェーズIIにおいて、ヒドロキシル基が使用されます。受容体基が分子にすでに存在する場合、結合ステップは、独立して、フェーズI代謝の発生する可能性があります。各反応は、ヒドロキシル化（ 図1）及び化学基板3の脱アルキル化を触媒する酵素の特定の群、 例えば 、のCYP（シトクロムP450類）により行われます。 ConjugatioNスルホトランスフェラーゼによって触媒される、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（ 図1）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼおよびN-アセチルトランスフェラーゼ4。各組織及び臓器は、肝臓はこれらのタンパク質のほとんどを発現すると、特定の代謝酵素の発現プロファイルを有することになります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> 図1：クマリンためのフェーズIおよびフェーズII代謝の例。 CYP2A6 / CYP2A13クマリンの7 - 水酸化を触媒します。 7-ヒドロキシクマリンは、UGT1A6及びUGT1A9が最も高い活性を示すと、第II相酵素UGTsによってグルクロニド部分に結合されています。 生体異物の代謝を理解することは、二つの理由のための医薬品の安全性の評価では、化学的リスク評価のために重要である：反応速度は、薬物や化学物質がアクティブまたは非アクティブのB型で体内に残存する期間を決定しますEFORE排泄。親化合物は、代謝酵素によって、より反応性不安定で有毒種に変更することができます。また、「生物活性」として知られているような反応は、主相II抱合5によって位相I CYP酵素によっても稀な機会に駆動されます。 これに基づいて、正確に薬剤または化学的に関連するリスクを予測するためのインビトロモデルの能力は、細胞系の代謝能力に大きく依存します。罹患組織から、または正常細胞の形質転換に由来する細胞株は、多くの場合、一部でない場合起源6のそれらの組織の代謝酵素プロファイル代表のすべてを失います。正常な代謝酵素プロファイルのメンテナンスは、（少なくとも短期培養において）、一次細胞培養物におけるより良い表示され、組織は、その3次元構造体1を保持することを可能にするマトリックスで培養した場合に、さらに改善されます。したがって、CHARインビトロ細胞系の代謝能力のacterizationは、細胞モデルは、化学的安全性評価を実施することが適切であるに関する決定を導く上で重要な予備的なステップです。 本稿では、肝細胞ライン7と3D原発性肺細胞培養8とのそれらのアプリケーションの例を用いてインビトロでフェーズI CYP酵素の活性および発現をプロファイリングするためのプロトコルを提示します。 CYP特異的基質、それらの代謝産物及び阻害剤対照を質量spectrometry-およびルミネセンスに基づく定量方法と共に記載されています。いくつかのCYP誘導性であり、他のものは構成的であるので、実施例はまた、これらの2つのシナリオについて説明します。

<table><tbody><tr><td>試薬&細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu;mのシリンジ</td><td>フィルターWhatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24の井戸版</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Σ Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-phenyl pentyne</td><td>Σ Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxybupropion</td><td>Σ Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxychlorzoxazone</td><td>Σ Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-エトキシクマリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-ヒドロキシクマリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-メトキシプソラレン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-ナフトフラボン</td><td>SigmaAldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCAキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-グルクロニダーゼ/アリールスルファターゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>ブプロピオン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>カルバマゼピン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>chlorzoxasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>クマリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>ジスルフィラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Glutamine supplement)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG 代謝サプリメント</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG thaw培地サプリメント</td><td>メルク</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>メルク</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>ルシフェリン-CEE</td><td>プロメガ</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir 気道細胞</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir 気道細胞 メンテナンス培地</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>フェノメネックス キネテックス 2.6 &mu;m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro;m 2.1 x 50 mm</td><td>ウォーターズ</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムズE media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MSソフトウェア</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>アナリスト 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>エッペン</td><td>ドルフ-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

のフェーズi代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ<em&gt;インビトロ</em&gt;細胞培養

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

生体異物代謝酵素は、溶解度を増加し、排泄を促進する官能基を追加することにより、医薬品や毒物の生体内変化における重要な機能を果たしています。いくつかの場面で、それらの構造変更は、新毒性産物の形成につながります。動物実験を低減するために、化学的リスクは、代謝コンピテント細胞を用いて評価することができます。代謝酵素の発現は、しかしながら、 インビトロでの初代培養系において多くの時間にわたって安定ではなく、多くの場合、細胞株において部分的または不在です。したがって、in vitroでの薬品、添加物、および環境汚染物質代謝の研究は、理想的に代謝活性を特徴づけされた細胞系で実施されるべきです。ここではUPLC質量分析法による定量化化学プローブおよびそれらの代謝産物を使用して、2D細胞株および初代3D培養における代謝酵素（ヒトフェーズI）のクラスの活性を測定する手法を説明しルミノメトリー。この方法は、細胞株および種々の組織に由来する一次細胞における代謝活性を試験するために実施することができます。

3人の異なるドナー（気道M360、M370、M417）及び肝細胞株（Hep細胞ライン）からの気道細胞培養における2つのCYPの対（CYP1A1 / 1B1及びCYP2A6 / 2A13）について測定された代謝活性の例は、 図6に示されています20。 ルミノメトリーによって測定されたCYP活性 図6Aは、気道細胞におけるリュック-CEE（ルシフェリン6&#39;-クロロエチルエーテル）（3人のドナー）とを有するとTCDD誘導せず、肝細胞のCYP1A1 / 1B1 O -脱アルキル化活性によって産生さ相対発光を示します。 CYP1A1 / 1B1高度に誘導性酵素であり、典型的には、ほとんどの組織で構成的なレベルでは発現されません。 図6Aに見られるように、細胞が誘導されていない場合、何のルミネセンス信号が検出されません。両方の細胞型は、TCDD、強力なCYP1A1 / 1B1誘導、マークと共にプレインキュベートされたときEDルミネセンス信号は、制御（ 図6A）と比較して検出されます。これは、リュック-CEEプローブがその後に定量化されたルシフェリン部分の放出をもたらす代謝されていることを示しています。全体TCDD処理された肝細胞株からの活性があっても、総タンパク質の正規化した後、気道細胞の場合よりも低いです。細胞株は、初代細胞未満代謝的に活性である傾向があるので、これは珍しいことではありません。 αナフトフラボンの添加はさらにリュック-CEE代謝のCYP依存性を確認し、全ての細胞型におけるCYP1A1 / 1B1活性に対する明確な阻害効果を有します。 UPLC-MSを使用してCYP450代謝物の定量 図6Bは、INHIの存在下および非存在下におけるクマリンとのインキュベーション後に3人のドナー（気道M343、M345、M347）および肝細胞（Hep細胞ライン）からの気道細胞におけるCYP2A6 / 2A13活性の定量化を示しますBITOR 8-メトキシ。データは、総タンパク質に対して正規化されます。 0分クマリンインキュベーション制御では、全く7-ヒドロキシクマリン（ 図6B）が検出されません。 CYP2A6 / 2A13は、特定の組織で構成的に発現され、7-ヒドロキシクマリンの形成を伴う、したがって後の16時間のインキュベーションをも誘導することなく、試験された異なる種類の細胞で検出されます。 8-メトキシ場合、CYP2A阻害剤が（ 図6B）を添加し、7-ヒドロキシクマリンの形成を大幅に低減されます。 CYP阻害剤の存在下で、阻害はめったに完了すると、その他のCYPは、基板を認識するが、はるかに少ない効率的に処理することができるかもしれないので、まだいくつかの残存活性を検出することが普通であることに留意すべきです。また、それは気道細胞におけるCYP2A6のために表示されるように一次細胞を使用する場合、記録代謝活性は、ドナーの間で異なることができることを観察することができます（ 図6B）。これは、CYP活性は、各ドナーの遺伝子型と多型の傾向があると期待されています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> 図6：活性アッセイは、肝細胞株においてスリー気道細胞ドナー（M360、M370、M417）にCYP1A1 / 1B1活性（A）及びCYP2A6 / 2A13活性（B）の検索結果。 （A）のLuc-CEEの脱アルキル化活性を有するとTCDDによるCYP1A1 / 1B1の誘導なしに示されています。 αナフトフラボンは、CYP1A1 / 1B1阻害剤として使用されました。活性は、インキュベーションの分単位の時間（分）との総タンパク質濃度（mg）で正規化し、相対発光単位（RLU）として表されます。彼らは恒常的に発現していると（B）CYP2A6 / 2A13は、誘導を必要としません。ピコモル/分/ mgタンパク質でクマリン7-水酸化活性は、阻害剤8 methoxypsorととせずに異なる時点で示されていますALEN。すべての結果は、平均値の標準偏差で3回の独立した測定の平均値として提示されています。この数字は、バクスター20から変更されました。 補足表1：UPLC及び質量分析計設定。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

in vitro系の代謝能力は、薬物や毒物の生体内変化及び処分のための重要な要件です。このプロトコルでは、我々は、私は細胞培養で代謝相を評価するための基準の代謝プローブのアプリケーションを記述します。

のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ<em&gt;インビトロ</em&gt;細胞培養

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

この手順の目的は、培養細胞におけるシトクロムP450（CYP）の活性を測定することです。CYPは医薬品や毒性物質の代謝に関与する主要な酵素ですが、in vitroではその発現が維持されないことが多くあります。細胞をin vitroで培養すると、CYP酵素の正常な発現がしばしば失われます。したがって、多くのin vitroモデルは、医薬品や毒性物質の代謝を理解する上での関連性が限定的である可能性があります。本手法の主な利点は、培養細胞におけるCYP活性を評価する際の簡便さにあります。プローブ基質および阻害剤を用いることで、質量分析を含むさまざまな定量プラットフォームが提示されています。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、細胞が入った凍結保存バイアルを準備します。本プロトコルでは、例として肝細胞株を使用しています。無菌条件下で、凍結保存バイアルを慎重に開けて余分な圧力を逃がした後、バイアルの中身を、37°Cに予熱した9 mLのWilliams' E mediumを満たした10 mLチューブにピペットで移します。室温で 400 ×g、10 分間、溶液を遠心分離します。上清を捨てた後、37 °C に予熱しグルタミンの補完を加えた 5 mL の専用解凍培地で細胞を再懸濁します。テキストプロトコルに記載されている方法で生存細胞数をカウントした後、1 ウェルあたり 60,000 個の生存細胞の密度で、最終容量 0.5 mL の解凍培地を用い、コラーゲンコートした 24 ウェルプレートに細胞を播種します。数日間の培養後、細胞は亜合流的な小梁構造を形成します。最適な代謝活性は通常7日から10日の間に観察され、4日目に最も低くなります。分化した気道上皮培養を準備するには、インサート上の気液界面で育成された、市販の完全分化一次気道上皮を使用してください。滅菌ピンセットを用いて、アガロースマトリックスからセルインサートを慎重に取り出し、700 µLの独自培養液があらかじめ充填された新しいプレートに移します。経上皮電気抵抗や繊毛拍動周波数など、テキストプロトコルで言及されている手法を用いて、気道組織の完全性を評価します。実験に先立ち、気道細胞用のセルインサートと肝細胞用のウェルを、それぞれ最低3つの繰り返し（n=3）を含む2つのシリーズで準備してください。1つのシリーズを阻害実験に使用し、もう1つのシリーズを代謝プローブのみに使用します。さらに、培地ブランクコントロールとして3つ目の細胞シリーズを準備します。実験当日に、細胞培養培地を450 µLの新鮮な培地に交換します。10倍濃度のCYP阻害剤を含む培地50 µLを、阻害実験用に準備した一連の細胞に加え、30分間プレインキュベートします。次に、阻害実験군의培地を450 µLの新鮮な培地に交換し、10倍濃度のCYP阻害剤と10倍濃度のプローブ基質の両方を含む培地50 µLを加えます。その他の細胞には、10倍濃度のプローブ基質を含む培地50 µLを加え、ブランク細胞コントロールには、培地で希釈した同量のビヒクルを加えます。タイムポイント1（0分、背景コントロール）として、細胞を0分から5分間インキュベートした後、培地を個別のラベル付きチューブに回収し、後の処理のために凍結保存します。次に、タイムポイント2の細胞をセルインキュベーター内で16時間インキュベートします。インキュベーション期間の終了後、代謝産物を定量するため、同様の方法で培地を回収します。250 µLのインキュベーション培地を1.5 mLマイクロチューブに移し、最終濃度が100 nMになるように4-メチルウンベリフェロン内部標準ストック溶液を加えます。1 M HClを1 µLずつ滴下し、培地のpHを4.5から5.0の間に調整します。培地2〜10 µLをpH試験紙に滴下してpHを確認した後、Helix pamatia由来のベタグルクロニダーゼ・アリルスルファターゼを150 units加えます。37°Cで1時間インキュベートした後、250 µLの冷メタノールを加えて反応を停止させます。真空遠心機を用いて45°Cで溶媒を蒸発させます。その後、サンプルを30%アセトニトリル水溶液500 µLで再構成します。質量分析ベースの定量を行うには、各連続希釈標準液250 µLを、UPLC-MSオートサンプラー注入用の琥珀色超高性能液体クロマトグラフィー用ガラスバイアルに加えます。同様に、テストサンプルを琥珀色UPLCバイアルに加えてUPLCオートサンプラーにセットします。すべてのバイアルをランダム化した後、定量する特定のプローブに応じて、テキストプロトコルに詳述されている設定を用いてUPLC-MSを実行します。質量分析計定量ツールにある「Quantitate, Build Quantitation Method」ツールを使用して、得られた合成標準物質および内部標準物質から検量線を生成します。次に、「Quantitation Wizard」を使用して、定量するサンプルバッチとサンプルを選択し、定量メソッドを実行します。CYP1A1およびCYP1B1を誘導するには、テキストプロトコルにあるプレートレイアウトを使用してください。誘導用の細胞を、最終濃度10 nanomolarのTCDDを含む培地で72時間インキュベートします。この期間の後、培地を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄して、新しい培地を加えます。発光レポータープローブで細胞をインキュベートする前に、誘導した細胞の指定されたサブセットを、培地中でCYP1A1、CYP1B1阻害剤とともに30分間プレインキュベートします。非誘導細胞、誘導細胞、および誘導＋阻害剤添加細胞に、最終濃度50 $\mu$Mの発光プローブであるルシフェリン 6'-クロロエチルエーテルを加えます。4時間インキュベートした後、25 µLの培養液を白色の不透明な96ウェルプレートに移し、メーカー提供のルシフェリン検出試薬を25 µL添加します。室温で20分間インキュベートした後、ルミノメーターを用いて直ちにプレートを測定します。ここでは、CYP1A1およびCYP1B1によって触媒されるルシフェリン 6'-クロロエチルエーテルの脱アルキル化によって生じる相対発光量を提示します。この例では、TCDD誘導がない場合には酵素活性が見られません。TCDD誘導後には、肝細胞および呼吸器細胞の両方の細胞型において、CYP1A1およびCYP1B1の活性が観察されます。最後に、CYP1A1およびCYP1B1阻害剤であるα-ナフトフラボンを添加すると、CYP活性が減少または消失します。肝細胞および気道細胞におけるCYP2A6および2A13の活性を評価するため、酵素によるクマリンの水酸化によって生成される7-ヒドロキシクマリンの量をUPLC LC-MSを用いて測定しました。クマリン添加直後の0分時点では、バックグラウンドのみが検出されました。16時間後には、これら2つの細胞型においてクマリンの水酸化が認められ、7-ヒドロキシクマリンが生成されました。最後に、CYP2Aおよび2A13阻害剤を添加することで、7-ヒドロキシクマリンの生成を抑制します。習得すれば、本手法におけるプローブのインキュベーションおよび定量ステップは、ほとんどの場合、数時間から最大1日で完了できます。このビデオを視聴することで、さまざまな細胞種を用いて多様な第I相代謝アッセイを実施し、必要に応じて阻害または誘導を用いて酵素の特異性を確認する方法を十分に理解できるはずです。この手順を実施する際は、細胞の種類によってインキュベーション時間を長くする必要がある場合があること、およびポジティブコントロールとして使用できる細胞種を必ず含めることが重要です。TCDDの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常にフル装備の個人用保護具を着用するなど、適切な予防措置を講じてください。本手法の意義は、新薬の前臨床評価や、消費者製品に使用される化学物質および成分のリスクアセスメントに適したin vitroモデルの活用にまで及びます。

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学ぶ、質量分析とルミネベースアプローチを用いて培養細胞におけるシトクロムP450活性を評価する方法。薬物代謝研究のためのインビトロモデルの妥当性向上に貢献します。

のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ

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