放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

このアッセイの全体的な目標は、プロテインキナーゼの酵素活性を測定することです。この方法は、キナーゼまたはキナーゼ変異体の活性、その特異性、その活性が異なる細胞処理に敏感かどうかなど、キナーゼシグナル伝達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、汎用性と量的さの両方を備えていることです。

この手順を実演するのは、このアッセイの経験が豊富なコブ研究所の研究科学者であるスティーブ・スティペックです。まず、200マイクロリットルの細胞溶解物に1ミリグラム/ミリグラムの抗体を2マイクロリットル加え、ロッキングしながら摂氏4度で1時間インキュベートします。Lysis Bufferを添加してプロテインA-セファロースビーズを2〜3回洗浄し、4°Cで5000 gで30秒から1分間タッチスピニングした後、ピペットで上清を除去し、ビーズをバッファーに再懸濁します。

次に、30マイクロリットルの50%スラリーのタンパク質A-セファロースビーズと溶解バッファーを溶解物に加えます。ライセートを4°Cで1時間、揺さぶりながらインキュベートします。4°Cでタッチスピンしてビーズをペレット状にし、上清液を取り除きます。

ビーズを1ミリリットルのビーズ洗浄バッファーで3回洗浄した後、タッチスピニングを行い、次にビーズを1つのXキナーゼ反応バッファーで1回洗浄します。タッチスピニング後、ビーズを抜かずにできるだけ多くのバッファーを取り除いてください。アッセイを初期化するには、反応混合物全体をキナーゼサンプルに加えます。

反応を摂氏30度で5分間から1時間インキュベートします。これは、アッセイするキナーゼの活性によって異なります。氷の上に置き、7.5マイクロリットルの5つのX Laemmliサンプルバッファーを加えて反応を停止し、ヒートブロック内で100°Cで反応を3〜5分間加熱します。サンプルをタッチスピンした後、ウェルあたり20マイクロリットルを10〜15%SDS-PAGEゲルにロードします。

ゲル装置は高エネルギーベータエミッターであるため、リン-32への曝露を制限するために、ゲル装置をシールドしてください。キナーゼと基質を分離するのに十分な時間ゲルを泳動します。実行後、ガラスプレートとアルミニウムプレートからゲルを取り出し、50 RPMに設定されたオービタルシェーカーで50ミリリットルのクーマシー染色にゲルを1時間置きます。

このステップでは、ゲル自体よりも少し大きい容器を使用します。ゲルを染色除去するには、ゲルを染色液から固定液に移します。フォームまたは結び目のある実験用ワイプをジェルの入った容器に入れて、クーマシー染料を吸収します。

600〜700ミリリットルの固定溶液でゲルを50RPMのオービタルシェーカーで一晩揺さぶります。翌日、固定液からゲルを取り出し、200ミリリットルのメタノールに1〜2分間、ゲルが乳白色になるまで穏やかに攪拌しながら浸します。これにより、乾燥工程でのひび割れを防ぐことができます。

次に、約14cm×14cmの定性的な濾紙をメタノールで濡らし、スラブゲル真空乾燥機に置きます。ゲルを濾紙の上に置き、表側を上にします。ジェルをラップで丁寧に覆い、電源を入れて乾燥機を運転し、真空を塗ります。

数秒後に真空に達したら、柔らかいゴム製のブレイヤーで気泡を広げます。実行を 90 分間続けます。乾燥させたゲルを取り出し、ゲル側面の濾紙に蓄光定規やドットなどのオートラッドマーカーを取り付け、強化スクリーンが入ったカセットに入れます。

ガイガーカウンターを使用して、信号の強度を確認します。信号が弱い場合は、マイナス70°Cからマイナス80°Cのスクリーンで露光すると、フィルムのバンド密度が増加します。暗室で、強化スクリーンが入ったフィルムカセット内の乾燥ゲルの上にフィルムを置きます。

CPMカウントが100以下の場合は、マイナス70〜80°Cで一晩かけてみてみて。あるいは、カウントが10, 000に近い場合は、1時間の露出から始めて、そこから最適化します。露光の終了時に、医療用またはX線フィルムプロセッサーで現像する前にフィルムをはがしてください。

フィルム上のタンパク質標準に対応するバンドに印を付けます。また、将来の参照のために、タンパク質標準と反応レーンを標識します。フィルム上の目的のバンドに対応するバンドをゲルから取り出します。

バンドを7ミリリットルのシンチレーションバイアルに入れ、4ミリリットルのシンチレーション液を追加します。液体シンチレーションカウンターでバンドを数えます。カウンタが Phosphorus-32 の正しいエネルギー スペクトル ウィンドウを監視するように設定されていることを確認します。

テキストプロトコルで説明されているように、結果の分析に進みます。精製されたERK2フラクションは、ERK2キナーゼ活性の構成的に活性な刺激因子であるMEK1R4Fの存在下または非存在下で、MBPを用いたキナーゼアッセイで使用されました。同様の実験では、MBPキナーゼアッセイを使用して、細菌培養物から精製された組換えERK2変異体の活性を野生型タンパク質と比較して測定しました。

ERK2は、MEK1R4Fによって刺激されるとMBPをリン酸化することができましたが、ERK2キナーゼ活性は、触媒リジンまたは二重リン酸化の標準的な部位に近接するスレオニンのいずれかの突然変異によって劇的に低下します。ERK2 T188DおよびERK2 T188Eは、小さなフレキシブルペプチドに対して限界キナーゼ活性を示します。しかし、野生型ERK2に見られるように、既知のERK2基質であるNup153およびPDX1を強固にリン酸化することはできません。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1〜2日で完了します。このビデオを見れば、放射性標識ATPを使用してプロテインキナーゼの活性をアッセイし、それらが存在するシグナル伝達ネットワークをよりよく理解する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、目的のキナーゼをプルダウンするためのアミノ沈降プロトコルを最適化して、等しいタンパク質量を考慮し、組換えタンパク質の濃度を測定してキナーゼ活性の正確な比較を確保することを覚えておくことが重要です。

その開発後、この技術は、細胞シグナル伝達の分野の研究者が特定の形質導入経路と恒常性調節におけるそれらの役割、および疾患の進行への貢献を探求する道を開きました。放射性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、常に個人用保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。