Name: 放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶ放射性標識ATPを用いたタンパク質キナーゼ活性アッセイ法。抗体とprotein A-Sepharoseビーズを使用した精製と定量測定により、キナーゼ特異性や活性変化を正確に評価できます。

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著者は貴重な作業と討論のためにCobb研究所のすべての現メンバーと元メンバー、そして管理援助のためのDionne Wareに感謝します。これらの研究は、国立保健研究所R37 DK34128およびウェルチ財団グラントI1243によってMHCに支持された

キナーゼ精製リソースおよび一般的な免疫沈降パイプライン注：このアッセイで使用するためのキナーゼは、培養細胞の免疫沈降物から、またはアフィニティータグ精製などの組換え手段によって供給され得る6 。以下は、関心対象のキナーゼに依存して修飾しなければならないかもしれないフラッグタグ免疫沈降のための一般的プロトコールである。可能な限りすべてを氷上に置いておくべきです。 <ol><li> 2μLの1mg / mL抗体を200μLの細胞ライセート（通常は1mg / mL総タンパク質濃度）に添加し、4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> プロテインAセファロースビーズを、溶解バッファー（以下参照）で2〜3回、短時間4℃で5,000xgで30秒間〜1分間回転させ（「タッチスピン」）、ピペットで上清を除去し、緩衝液にビーズを再懸濁する。 <ol><li>溶解緩衝液を調製する：50mM HEPES pH7.7,150mM NaCl、1.5mM MgCl 2、1mM EGTA、10％グリセロール、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mMフッ化ナトリウム、50mMβ-グリセロリン酸、0.1％Triton X100または0.1％NP-40を含む。 </li></ol></li><li>ライセートに溶解緩衝液中のプロテインAセファロースビーズの50％スラリー30μLを加える;ロッキングしながら4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃で回転させてビーズをペレット化し、上清を除去する。 </li><li> 1mLのビーズ洗浄バッファー（1M NaCl、20mMトリスpH7.4）で3回洗浄する。 </li><li> 1xキナーゼ反応緩衝液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl 2 ）で1回洗浄する。ビーズを除去せずにできるだけ多くのバッファーを除去する。 </li></ol>キナーゼ反応の初期化注：IPキナーゼアッセイの場合、約15μLの懸濁していないビーズが典型的な開始サンプルです。組換えタンパク質キナーゼアッセイの場合、典型的な出発量は、25〜50μLの最終反応容積に対して0.1〜1.0μg/ l〜1/10の範囲である。組換えタンパク質サンプルの容量を調整するアッセイを初期化する前にそれらが保存されているバッファーと等しくなるようにします。大量のキナーゼを使用する場合は、アッセイ期間中のタンパク質安定性の維持を助けるために、BSAなどのキャリアタンパク質を含める。 <ol><li> 以下に示す5xキナーゼ反応バッファーを調製する： 50mM HEPES pH 8.0 50mM MgCl 2 50mMベンズアミジン（プロテアーゼ阻害剤） 50mMのDTT（還元剤） 250μMATP（非標識または「コールド」） </li><li> キナーゼサンプルを1.5 mLチューブに氷上で保存してください。以下の反応混合物を別々に冷却した1.5mLチューブで調製する： 21μLのH 2 O 6μL5xキナーゼ反応緩衝液 1μLの放射標識（「ホット」）ATP 基質2μL（約5mg / mL） 注：組換えキナーゼアッセイでは、精製タンパク質に対応するように容量を調整することができます。最終反応容積が30μLとなるように計算する。このレシピを使用してマスターを準備するミックス。標識されたATPを受領したら、反応混合物に加える前にH 2 O中のストックを0.01mCi /μLの比活性に希釈する。 </li><li>アッセイを初期化するために、反応混合物全体をキナーゼサンプルに添加し、アッセイされるキナーゼの活性に依存して、30℃で5分〜1時間インキュベートする。 注記：以前にアッセイされていないキナーゼを用いて作業する場合は、キナーゼ活性の経時変化を時間間隔で5分間隔で実行します。 </li></ol>反応停止およびSDS-PAGE <ol><li>氷上に置き、7.5μLの5倍Laemmliサンプルバッファー6を加えることにより反応を停止する。 </li><li>ヒートブロック中、100℃で30秒〜2分間加熱する。 </li><li> 10-15％SDS-PAGEゲル上でスピンをタッチし、ウェルあたり20μLを負荷する。キナーゼと基質を分離するのに十分な長さのゲルを流します（通常5Wの定電力で1時間）。ゲル装置をシールドして32 </sup&gt; Pである。 <ol><li>ここでは自家製ゲル装置を使用していますが、標準的な市販のミニゲルが完全に適しています。次のように寸法を使用します。 ゲル：幅8cm、長さ5.5cm（分解能）、厚さ1.5mm。 コムズ：15ウェル、1.5mm厚、2.9mm幅、16mm深さ</li></ol></li></ol> 4.ゲル染色および乾燥注意：すべてのステップで、放射性遮蔽を使用し、個人用保護具を着用して、 32 Pまでの人体への暴露を減らしてください。具体的な手順の詳細については、参考文献をいくつか記載しています。 <ol><li>ガラス/アルミナプレートからゲルを取り出し、50rpmに設定されたオービタルシェーカー上で50mLのクーマシー染色液（10％氷酢酸、50％メタノール、0.25％R-250色素）に1時間入れる。このステップでは、ゲル自体よりもわずかに大きい容器を使用してください。 8 </li><li>ゲルをステインから固定溶液（10％氷酢酸d、20％メタノール）を用いて脱色する。軌道シェーカー上で一晩、固定溶液600-700mL中でゲルを50rpmで揺する。クーマシー染料8,9を吸収するために、容器に泡や結び目のある実験用ワイプをゲルに入れます。 </li><li>固定溶液からゲルを取り出し、ゲルが乳白色に変わるまで静かに攪拌しながらメタノール200mLで1〜2分間浸します。これは、乾燥工程中の割れを防止するのに役立つ。 </li><li> 14cm×14cmの定性濾紙をメタノールで濡らし、スラブゲル真空乾燥機の上に置く。フィルターペーパーの前面を上にしてゲルを下にして置きます。 </li><li>しわや気泡を避けるために、プラスチックラップで慎重にゲルを覆う。乾燥機を80℃で1.5時間運転する。真空が達成された後、ふたを開け、必要に応じて柔らかいゴム製のブレイラで気泡をロールアウトします。 </li></ol> 5.オートラジオグラムおよびシンチレーションカウント<ol><li> driを削除ゲルの側面のろ紙にオートラッドマーカー、リン光ルーラーまたはドットを付けます。ドットを使用する場合は、それらが非対称パターンになっていることを確認してください。これは、露光および現像後にゲルをフィルムと整列させる。 </li><li> Geigerカウンタを使用して信号の強度を確認します。強度の高い画面で-70℃〜-80℃で弱い信号を照射すると、フィルムのバンド密度が増加します。 </li><li>暗室では、フィルムと増感スクリーンを備えたフィルムカセットに乾燥ゲルを、上から下の順番に、ゲル、フィルム、増感紙の順で入れます。 </li><li> 増感紙をカセットの蓋に取り付け、ゲルを適所にテープで貼り、このステップを簡単にします。増感スクリーンは、 32 Pからのベータ粒子によって照射されると光を発する。これらの光の放出は、ベータ粒子よりも効率的にフィルムに浸透する。 <ol><li>増感紙から放出される波長がフィルムが最も敏感である波長に池を維持する。 </li><li>ガイガーカウンターを使用して、曝露をどのくらいの期間放置するかを決定する：cpmカウントが〜100以下の場合は、-70℃で一晩お試しください。カウントが〜10,000の場合は、1時間の露出で開始し、そこから最適化します。 </li></ol></li><li>露光終了後、フィルムを取り出し、医療/ X線フィルムプロセッサーで現像する。暴露が-70〜-80℃で行われた場合は、カセットを室温まで温めて、結露が生じる前にフィルム上の結露を最小にしたり、フィルムを取り除いたりしてください。 </li><li>フィルムを乾燥したゲル/濾紙の上に置き、乾燥ゲル上のマーカー/ドットの画像をマーカー/ドットと整列させる。タンパク質標準に対応するバンドをフィルムに記入する。タンパク質標準にラベルを付け、将来の参照のために反応がどのレーンであるかを記録する。 </li><li>フィルム上の関心のあるバンドに対応するバンドをゲルから切り取って置きます7mLのシンチレーションバイアルに入れた。 4mLのシンチレーション液を加え、液体シンチレーションカウンターでカウントする。カウンタが32 Pの正しいエネルギースペクトルウィンドウを監視するように設定されていることを確認します。 注：基質に対応するバンドも、ノンキナーゼ対照レーンから切り出してください。これは、すべてのサンプルシンチレーションカウントから差し引かれるバックグラウンド放射線を計算するために使用されます。 </li></ol> 6.結果の分析注：オートラジオグラムは結果の定性的な視覚化を提供します。正確な定量のために、シンチレーションカウンターを用いて32 P取り込みを測定することができる。データは、通常、 図1Bに示すように、相対的な活動の観点から表現されます。全てのサンプルについて均一な条件が維持されている限り、比活性の相対的な測定は、処置を比較するのに十分である。 <ol><li>絶対的な特定の活動値を計算するときは、厳密に時間経過（ 例えば、 2×[キナーゼ] = 2×比活性）にわたる直線的な活性範囲を確保するために、キナーゼ、基質、および冷ATP濃度を含む、すべての反応条件の最適化。高い比活性を有するキナーゼについては、キナーゼ活性が基質の量によって制限される場合には、基質濃度を増加させてアッセイを行う。 </li><li> 関心のあるキナーゼの特異的活性を、1mg /キナーゼ当たりのナノモルリン酸塩単位の単位で計算する。 <ol><li>カウントされたバンドのcpmから空白を差し引く。 </li><li>熱いATPの減衰を計算する：[（1/2）^（t / t 1/2 ）] x 0.95ここで、 tは基準日からの日数であり、 t 1/2は32 Pの半減期は14.3日であり、0.95はシンチレーションカウンターの効率を反映する。例：28日目の高温ATPを使用する場合、減衰値は0.245でなければなりません。 </li><li> Calcアッセイの容量（μL）×[冷ATP]（μM）=全ATP（pmols）。アッセイ中の全ATPのピコモル（pmol）を測定します（通常、これは反応中の冷ATPの量に等しい）。例：30μL×50μM= 1500pmol </li><li> cpm / pmol ATPを計算する：冷ATPの[高温ATP x（2.2×10 7 ）×減衰係数] / pmolのμL。 注：2.2 x 10 7の値は、0.01 mCi /μLのATPをcpmに変換します。 </li><li>アッセイにおけるキナーゼの量をmgで計算する。組換えキナーゼおよび免疫沈降キナーゼの両方について、BCAアッセイのような標準的方法が出発濃度を決定するのに適している。例：50μLキナーゼ反応におけるwtERK20.0002μg/μLは0.01μg、または1×10 -5 mgです。 </li><li>アッセイで総cpmを計算する。 30μLの反応物を集め、ゲル上の各反応物から20μLを流す。計数されたcpm（ブランク減算後）に、総アッセイ容量/負荷された容量の係数を掛けます。上記を続けるたとえば、すべてのカウントに1.5、または30/20を掛けます。 </li><li>アッセイされたキナーゼの比活性を計算する： アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）/（アッセイ時間（分））/（キナーゼのmgでの量） 注：上記の値を1000で割ると、比活性はナノモル/分/ mg </li></ol></li><li> 分子量がわかっている限り、どれくらいのモルのリン酸が基質に取り込まれているかを計算する。これは、反応が完了すると、特定のタンパク質上のホスホサイトの数を決定するために使用されます。 アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmol中の基質の量） </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

キナーゼは、数多くの状況において広範な機能を発達させたタンパク質の多様なファミリーであり、キナーゼアッセイは、いくつかのシグナル伝達タンパク質の研究に非常に有用であり、細胞通信の現在の理解に大きく貢献しています。特に、同じ基本アッセイを、構造および活性の大きな違いにもかかわらず、2つの異種キナーゼの特徴付けに使用した。 WNK1キナーゼは、臨界リジンが独特の位置にシフトした非定型触媒ポケットを含み、キナーゼおよび足場機能の両方を介してカチオン - クロリド共輸送体の調節において役割を果たすことが知られている。 WNK1のキナーゼ活性は、その最も特徴付けられた基質であるプロテインキナーゼ酸化ストレス応答1（OSR1）およびSPS / STE20関連プロリンアラニンリッチキナーゼ（SPAK）でさえ、低い代謝回転数を有することが知られている。対照的に、密接に関連するキナーゼERK1と共にERK2は、活性化された場合に堅牢なキナーゼ活性を示す<eインビトロで細胞を培養し、細胞13,14中の100個の基質上でリン酸化することが知られている。 ア...

プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である1 。ホメオスタシスの維持と病態2の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている3 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態4に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。 IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。 本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols 6を参照することをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。

<table><tbody><tr><td>プロテインAセファロース CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>放射性標識 [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>放射性遮蔽</td><td>研究製品 International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman グレード 3 定性的濾紙</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>スラブゲル真空乾燥機</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 ゲル乾燥機 #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autoradマーカー</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>蓄光定規</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>燐光ドット</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>ガイガーカウンター</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMaxMSフィルム 8インチ x 10インチ</td> <td>ケアストリームヘルス</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>バイオマックス MSインテンシファイイングスクリーン 8インチ x 10インチ</td> <td>ケアストリームヘルス</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>医療/X線フィルムプロセッサ</td><td>コニカミノルタ</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>研究製品 国際</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション液</td><td>MP バイオメディカル 188245305</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマンLS6500シンチレーションカウンター</td><td>ベックマン</td><td>LS6500</td><td></td></tr></tbody></table>

放射性標識atpによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

プロテインキナーゼは、複雑な刺激配列に応答して大規模な細胞の変化を制御することができ、その調節のアロステリックな詳細を明らかにするために多くの努力が向けられている。キナーゼは、欠陥がしばしば複数の形態の癌および関連疾患の特徴であり、上流の調節因子の操作および改善された治療法の探索において重要な反応要求の検証に適したアッセイプラットフォームを形成するシグナルネットワークを含む。ここでは、生化学的および薬理学的作用物質の試験、突然変異および欠失などの遺伝子操作、ならびに細胞培養条件およびプローブに対する処理を含むが、これに限定されない特定の実験的問題に適合するように容易に適合させることができる基本キナーゼアッセイを記載する細胞シグナル伝達機構。このアッセイは、定量的な比較および結果の明確な視覚化を可能にする放射性標識[γ- 32 P] ATPを利用し、そしてmod広範囲の反応条件にわたって、免疫沈降または組換えキナーゼ、特異的または典型的な基質と共に使用することができます。

WNK1 IPキナーゼアッセイ Myc標識WNK1をHEK293細胞にトランスフェクトし、抗Myc抗体11で免疫沈降した。免疫沈降物は、モデル基質MBPに向かって、そしてそれ自体に向かってキナーゼ活性を示した（ 図1A ）。 WNK1突然変異体を、同様の方法でMBPに対するキナーゼ活性について試験したが、今回はGSTタグ付き構築物を用いた（ 図1B ）。野生型と比較した突然変異体キナーゼの挙動の分析は、最適なWNK1活性にとって重要な残基を明らかにした。 HEK293細胞を、薬理学的および生化学的処理のパネルに曝露した。 WNK1 N末端ペプチドに対して生じた抗体を用いて、免疫沈降した内在性WNK1キナーゼ活性を、基質と...

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

このアッセイの全体的な目的は、プロテインキナーゼの酵素活性を測定することです。本手法は、キナーゼまたはキナーゼ変異体の活性レベル、特異性、およびその活性がさまざまな細胞処理に対して感受性を持つかなど、キナーゼシグナリング分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、汎用性が高く、かつ定量的な点にあります。本手順のデモンストレーションを行うのは、このアッセイに精通しているCobb Laboratoryのリサーチサイエンティスト、Steve Stippecです。まず、1 mg/mLの抗体 2 µLを200 µLの細胞溶解液に加え、4 °Cで1時間ロッキングしながらインキュベートします。Protein A-Sepharoseビーズに溶解バッファーを加えて2〜3回洗浄し、4 °Cで5000 ×gにて30秒から1分間スピンダウンさせます。その後、ピペットで上澄みを除去し、ビーズをバッファーで再懸濁します。次に、Protein A-Sepharoseビーズの50%スラリーと溶解バッファーの混合液を30 µL、ライセートに加えます。ライセートを4 °Cで1時間、ロッキングしながらインキュベートします。4 °Cでタッチスピンしてビーズをペレット化し、上清を除去します。ビーズを1 mLのビーズ洗浄バッファーで3回洗浄し、タッチスピンを行います。次に、1×キナーゼ反応バッファーでビーズを1回洗浄します。タッチスピン後、ビーズを除去しないように注意しながら、可能な限りバッファーを取り除きます。アッセイを開始するために、反応混合物全量をキナーゼサンプルに添加します。測定するキナーゼの活性に応じて、反応液を30 °Cで5分から1時間インキュベートします。反応液を氷上に置き、5 X Laemmliサンプルバッファーを7.5 µL添加して反応を停止させ、その後ヒートブロックを用いて100 °Cで3〜5分間加熱します。サンプルをタッチスピンした後、10〜15% SDS-PAGEゲルに1ウェルあたり20 µLずつロードします。リン32（phosphorus-32）は高エネルギーのベータ線放出体であるため、被ばくを制限するためにゲル装置を必ず遮蔽してください。キナーゼと基質が分離するまで十分にゲル電気泳動を行います。泳動後、ガラスプレートとアルミニウムプレートからゲルを取り出し、50 mLのクマシー染色液に入れ、50 RPMに設定したオービタルシェーカーで1時間染色します。このステップでは、ゲル自体よりもわずかに大きい容器を使用します。ゲルの脱色を行うには、ゲルを染色液から固定液に移動させます。クマシー染料を吸収させるため、ゲルと一緒にフォーム片または結び目を作ったラボワイプを容器に入れます。オービタルシェーカーを用い、50 RPMで600～700 mLの固定液に浸したゲルを一晩ロッキングします。翌日、ゲルを固定液から取り出し、200 mLのメタノールに1～2分間浸し、ゲルが乳白色になるまで緩やかに撹拌します。これにより、乾燥工程中のひび割れを防ぐことができます。次に、約14 cm × 14 cmの定性ろ紙をメタノールで湿らせ、スラブゲル真空乾燥機の上に置きます。ゲルをろ紙の上に、表面を上に向けて置きます。ゲルをプラスチックラップで慎重に覆い、乾燥機のスイッチを入れて真空ポンプを作動させます。数秒で真空状態になった後、柔らかいゴム製のブレイヤーで気泡を押し出します。そのまま90分間ランニングを継続します。乾燥したゲルを取り出し、燐光定規やドットなどのオートラドマーカーをゲルの側面のフィルターペーパーに取り付けてから、増感スクリーンを入れたカセットに配置します。ガイガーカウンターを使用して信号の強度を確認します。信号が弱い場合は、増感スクリーンを用いて-70°Cから-80°Cで露光させることで、フィルムのバンド密度を高めることができます。暗室内で、増感スクリーンを含むフィルムカセットに入れ、乾燥させたゲルの上にフィルムを配置します。CPMカウントが100以下の場合は、-70～-80°Cで一晩露光させてください。あるいは、カウントが10,000に近い場合は、まず1時間の露光から開始し、そこから最適化を行ってください。露光終了後、フィルムを取り出し、医療用またはX線フィルム現像機で現像します。フィルム上のタンパク質標準に相当するバンドに印を付けます。また、後で参照できるよう、タンパク質標準と反応レーンにラベルを貼ります。フィルム上の目的のバンドに相当するバンドをゲルから切り出します。バンドを7 mLのシンチレーションバイアルに入れ、4 mLのシンチレーション液を加えます。液体シンチレーションカウンターを用いてバンドを計測します。カウンターがphosphorus-32の正しいエネルギースペクトルウィンドウをモニターするように設定されていることを確認してください。テキストプロトコルに従って結果の解析に進みます。精製したERK2画分を、ERK2キナーゼ活性の恒常的活性化刺激因子であるMEK1R4Fの存在下または非存在下で、MBPを用いたキナーゼアッセイに使用しました。同様の実験において、細菌培養液から精製したリコンビナントERK2変異体の活性を、野生型タンパク質と比較して測定するためにMBPキナーゼアッセイを用いました。ERK2はMEK1R4Fによる刺激を受けてMBPをリン酸化することができましたが、触媒リシンまたは二重リン酸化の標準的部位に近接するトレオニンを置換すると、ERK2のキナーゼ活性は劇的に消失します。ERK2 T188DおよびERK2 T188Eは、小さく柔軟なペプチドに対してわずかなキナーゼ活性を示します。しかし、野生型ERK2で見られるような、既知のERK2基質であるNup153およびPDX1に対する強力なリン酸化能は認められませんでした。この手法を習得すれば、適切に実施することで1〜2日で完了させることができます。このビデオを視聴することで、放射標識ATPを用いてプロテインキナーゼの活性を測定し、それらが関与するシグナル伝達ネットワークをより深く理解する方法について、十分な知識を得ることができます。この手順を試みる際は、目的のキナーゼを沈殿させるためのアミノ沈殿プロトコルを最適化してタンパク質量を均一にし、リコンビナントタンパク質の濃度を測定してキナーゼ活性を正確に比較することが重要です。本手法の開発後、細胞シグナリング分野の研究者は、特定の伝達経路とその恒常性調節における役割、および疾患の進行への寄与について探索することが可能となりました。放射性物質の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、個人用保護具の着用などの予防措置を必ず講じてください。

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