定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

この手順の全体的な目標は、ラット腹膜のmiRNAを成功裏に精製および検出することです。この手順を開始するには、4%イソフルランによる吸入麻酔後。ラットの腹部の皮膚に70%エタノールをスプレーし、コルクシートの背中に取り付けます。

次に、ハサミと鉗子を使用して、動物の腹部の皮膚、筋肉、腹膜に縦方向に切開します。鉗子を使用して腹膜を拾い上げ、横隔膜の下の最も低い肋骨に沿ってその上部に水平切開を行います。そして、その下側には外科用ハサミを使用して外側の領域に。

次に、手術用ハサミを使用して、側方の縦方向に切開を行い、腹膜を体から取り除きます。次に、ペトリ皿でPPSで洗います。20ミリグラムの腹膜サンプルを切り取り、トリミングします。

この手順では、20ミリグラムの腹膜サンプルをガラスホモジナイザーに入れます。そして、700マイクロリットルのフェノールグアニジンベースの溶解試薬を追加します。その後、乳棒をねじりながらサンプルにゆっくりと押し付けることにより、氷上で腹膜サンプルを均質化します。

このプロセスを数十回繰り返して、腹膜サンプルがフェノールグアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで行います。さらに均質化するには、均質化した溶解液を 2 ミリリットルのコレクションチューブ内のマイクロ遠心分離スピンカラム内のバイオポリマーシュレッダーシステムに移します。次に、Gの14,000倍で摂氏4度で3分間遠心分離します。

次に、均質化されたライセートを新しいマイクロ遠心チューブに移します。均質化したライセートに140マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブにしっかりとキャップをします。その後、チューブを反転して15秒間混合します。

その後、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートします。その後、Gの12,000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。300マイクロリットルの上清を、沈殿物を乱さずに新しいマイクロ遠心チューブに移します。

そして、100%エタノールを450マイクロリットル加えます。次に、サンプルを5秒間ボルテックスして混合します。次に、最大700マイクロリットルのサンプルをシリコンメンブレンベースのスピンカラムにピペットで入れ、2ミリリットルの収集チューブに入れ、キャップを閉じます。

次に、15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、収集チューブ内の流れを捨てます。次に、700マイクロリットルの洗浄バッファー1をシリコンメンブレンベースのスピンカラムに加えて、サンプルを厳密に洗浄し、キャップを閉じます。

15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、収集チューブ内の流れを捨てます。シリカメンブレンベースのスピンカラムに500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加えて、塩の痕跡を取り除き、キャップを閉じます。

次に、15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、スルーフローとコレクションチューブを廃棄し、この手順を再度繰り返します。次に、シリカ膜ベースのスピンカラムを再び15, 000倍Gで1分間遠心分離します。

遠心分離後、収集チューブと通過するすべての流れを廃棄します。シリカメンブレンベースのスピンカラムを、新しいワンポイント5ミリリットルコレクションチューブに入れます。次に、25マイクロリットルのRNase遊離水をカラムに移し、キャップを閉じます。

サンプルを室温で5分間放置します。15, 000倍Gで1分間遠心分離します。その後、全RNAを含む25マイクロリットルのアルエットを新しいマイクロ遠心チューブに移し、マイナス80°Cで保存してから使用します。

この手順では、2マイクロリットルの10x核酸ミックス、2マイクロリットルの逆転写酵素ミックス、および4マイクロリットルの5x Hispecバッファー、合計8マイクロリットル/チューブを含むマスターミックス溶液を調製します。次に、8マイクロリットルのマスターミックス溶液を各チューブに分注します。分光光度計を使用して全RNAの量を測定します。

その後、腹膜サンプルから精製した単離された全RNAを1マイクログラムずつ各チューブに加えます。その後、各チューブにRNaseフリー水を加えて、合計20マイクロリットルにします。その後、ピペッティングで十分に混合し、15秒間遠心分離します。

その後、サンプルを摂氏37度で60分間インキュベートします。その後、摂氏95度で5分間インキュベートします。新しく生成されたcDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移し、RNaseフリー水で10倍に希釈します。

この手順では、各ウェルについて、12ポイント5マイクロリットルの2x PCRマスターミックス、各miRNAプライマーの5マイクロモル2ポイント5マイクロリットル、および10xユニバーサルプライマーの1ポイント25マイクロリットルを含むマスターミックスを調製します。このマスターミックスの22ポイント5マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、各ウェルに2ポイント5マイクロリットルのテンプレートcDNAを加えます。

96ウェル反応プレートをフィルムで密封します。次に、Gの1, 000倍で30秒間遠心分離します。PCRサイクリングプログラムを実行するには、プレートをリアルタイムPCR装置にセットします。

リアルタイムPCRソフトウェアで、実験特性を定義します。次に、各ウェルのサンプルとターゲットmiRNAに名前を付与します。次に、リアルタイムPCRソフトウェアで、指示に従って20マイクロリットルの反応量と次のPCRサイクリング条件を入力します。

摂氏95度で15分間インキュベートします。そして、94°Cで15秒間の変性を40サイクル、55°Cで30秒間ひざまずき、70°Cで30秒間の伸展を行います。miRNA、マイクロアレイスクリーニングに基づくと、腹膜線維症ラットの腹膜では、この原稿で提示されたプロトコルに従って、QRTCPRを使用して、模擬ラットおよび対照ラットの腹膜で6つのmiRNAのレベルが有意に増加することがわかっています。