定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出
2017年6月27日
ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。
この手順の全体的な目標は、ラット腹膜のmiRNAを成功裏に精製および検出することです。この手順を開始するには、4%イソフルランによる吸入麻酔後。ラットの腹部の皮膚に70%エタノールをスプレーし、コルクシートの背中に取り付けます。
次に、ハサミと鉗子を使用して、動物の腹部の皮膚、筋肉、腹膜に縦方向に切開します。鉗子を使用して腹膜を拾い上げ、横隔膜の下の最も低い肋骨に沿ってその上部に水平切開を行います。そして、その下側には外科用ハサミを使用して外側の領域に。
次に、手術用ハサミを使用して、側方の縦方向に切開を行い、腹膜を体から取り除きます。次に、ペトリ皿でPPSで洗います。20ミリグラムの腹膜サンプルを切り取り、トリミングします。
この手順では、20ミリグラムの腹膜サンプルをガラスホモジナイザーに入れます。そして、700マイクロリットルのフェノールグアニジンベースの溶解試薬を追加します。その後、乳棒をねじりながらサンプルにゆっくりと押し付けることにより、氷上で腹膜サンプルを均質化します。
このプロセスを数十回繰り返して、腹膜サンプルがフェノールグアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで行います。さらに均質化するには、均質化した溶解液を 2 ミリリットルのコレクションチューブ内のマイクロ遠心分離スピンカラム内のバイオポリマーシュレッダーシステムに移します。次に、Gの14,000倍で摂氏4度で3分間遠心分離します。
次に、均質化されたライセートを新しいマイクロ遠心チューブに移します。均質化したライセートに140マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブにしっかりとキャップをします。その後、チューブを反転して15秒間混合します。
その後、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートします。その後、Gの12,000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。300マイクロリットルの上清を、沈殿物を乱さずに新しいマイクロ遠心チューブに移します。
そして、100%エタノールを450マイクロリットル加えます。次に、サンプルを5秒間ボルテックスして混合します。次に、最大700マイクロリットルのサンプルをシリコンメンブレンベースのスピンカラムにピペットで入れ、2ミリリットルの収集チューブに入れ、キャップを閉じます。
次に、15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、収集チューブ内の流れを捨てます。次に、700マイクロリットルの洗浄バッファー1をシリコンメンブレンベースのスピンカラムに加えて、サンプルを厳密に洗浄し、キャップを閉じます。
15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、収集チューブ内の流れを捨てます。シリカメンブレンベースのスピンカラムに500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加えて、塩の痕跡を取り除き、キャップを閉じます。
次に、15 、 000 倍 G で 15 秒間遠心分離します。遠心分離後、スルーフローとコレクションチューブを廃棄し、この手順を再度繰り返します。次に、シリカ膜ベースのスピンカラムを再び15, 000倍Gで1分間遠心分離します。
遠心分離後、収集チューブと通過するすべての流れを廃棄します。シリカメンブレンベースのスピンカラムを、新しいワンポイント5ミリリットルコレクションチューブに入れます。次に、25マイクロリットルのRNase遊離水をカラムに移し、キャップを閉じます。
サンプルを室温で5分間放置します。15, 000倍Gで1分間遠心分離します。その後、全RNAを含む25マイクロリットルのアルエットを新しいマイクロ遠心チューブに移し、マイナス80°Cで保存してから使用します。
この手順では、2マイクロリットルの10x核酸ミックス、2マイクロリットルの逆転写酵素ミックス、および4マイクロリットルの5x Hispecバッファー、合計8マイクロリットル/チューブを含むマスターミックス溶液を調製します。次に、8マイクロリットルのマスターミックス溶液を各チューブに分注します。分光光度計を使用して全RNAの量を測定します。
その後、腹膜サンプルから精製した単離された全RNAを1マイクログラムずつ各チューブに加えます。その後、各チューブにRNaseフリー水を加えて、合計20マイクロリットルにします。その後、ピペッティングで十分に混合し、15秒間遠心分離します。
その後、サンプルを摂氏37度で60分間インキュベートします。その後、摂氏95度で5分間インキュベートします。新しく生成されたcDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移し、RNaseフリー水で10倍に希釈します。
この手順では、各ウェルについて、12ポイント5マイクロリットルの2x PCRマスターミックス、各miRNAプライマーの5マイクロモル2ポイント5マイクロリットル、および10xユニバーサルプライマーの1ポイント25マイクロリットルを含むマスターミックスを調製します。このマスターミックスの22ポイント5マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、各ウェルに2ポイント5マイクロリットルのテンプレートcDNAを加えます。
96ウェル反応プレートをフィルムで密封します。次に、Gの1, 000倍で30秒間遠心分離します。PCRサイクリングプログラムを実行するには、プレートをリアルタイムPCR装置にセットします。
リアルタイムPCRソフトウェアで、実験特性を定義します。次に、各ウェルのサンプルとターゲットmiRNAに名前を付与します。次に、リアルタイムPCRソフトウェアで、指示に従って20マイクロリットルの反応量と次のPCRサイクリング条件を入力します。
摂氏95度で15分間インキュベートします。そして、94°Cで15秒間の変性を40サイクル、55°Cで30秒間ひざまずき、70°Cで30秒間の伸展を行います。miRNA、マイクロアレイスクリーニングに基づくと、腹膜線維症ラットの腹膜では、この原稿で提示されたプロトコルに従って、QRTCPRを使用して、模擬ラットおよび対照ラットの腹膜で6つのmiRNAのレベルが有意に増加することがわかっています。
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概要
このプロトコルは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いたラットの腹膜膜におけるマイクロRNA発現の検出を概説しています。様々な病理学的条件下でのマイクロRNA発現プロファイルを研究するために設計されています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- マイクロRNA研究
背景
- マイクロRNAは遺伝子調節において重要な役割を果たします。
- 病理学的条件下でのそれらの発現を理解することは重要です。
- ラットの腹膜膜はこれらの発現を研究するためのモデルとして機能します。
- 定量的リアルタイムPCRは検出のための信頼できる方法です。
研究の目的
- ラットの腹膜膜からのmiRNAの精製と検出。
- 様々な条件下でのマイクロRNA発現プロファイルの分析。
- この分野の研究者のための詳細なプロトコルの提供。
使用された方法
- 4%のイソフルランによる吸入麻酔。
- 70%エタノールによる腹部領域の準備。
- 腹膜膜へのアクセスのための外科的切開。
- 膜の抽出のためのはさみと鉗子の使用。
主要な結果
- 腹膜膜からのmiRNAの成功的な精製。
- マイクロRNA発現の定量的検出の達成。
- 様々な病理学的研究での使用のためのプロトコルの検証。
- 疾患メカニズムの理解における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルはラットモデルにおけるマイクロRNAの研究に効果的です。
- 病理学におけるマイクロRNAの役割への洞察を提供します。
- 将来の研究は、より広範な応用のためにこの方法論を基に構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
