Name: ゼブラフィッシュその場での脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ脊髄ニューロンの電気生理学的記録法。Danio rerioの胚・幼生期の感覚運動ニューロンをその場で測定し、神経発達における電気興奮性を解析する手法を解説します。

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ここで説明する方法は、脊髄の最小限の解剖後のゼブラフィッシュ胚の感覚と運動ニューロンの電気的および形態学的特性評価を可能とします。ニューロンは、少なくとも1時間、これらの記録に課される時間制限のために健康なままです。ニューロンは、標準の全細胞構成を使用して記録だけでなく、有核パッチからされています。後者の方法は、イオン電流9の詳細な生物物理学的研究を排除することができる空間クランプの問題を最小限に抑えます。 重要な課題は、皮膚を除去するために、関心のニューロンへのアクセスを提供するために必要な限られた解剖を実行するために、チャンバーへの胚や幼虫の会社の添付ファイルを達成することです。調製物はまた、適切に、全細胞パッチクランプ法のための記録チャンバーに固定する必要があります。に胚または幼虫を取り付けるために獣医縫合接着剤の使用を介して、この挑戦​​に合致する方法解剖/記録チャンバーは、ここで他のモデル生物の解剖のために使用されてきたアプローチ（ 例えば、ショウジョウバエ ）63に</...

<html>ジョージ・ストレジンガー脊椎動物の発生10の遺伝子分析のためのモデル系として、一般的にゼブラフィッシュとして知られ、 ゼブラフィッシュの使用を開拓しました。モデルは、以下を含むいくつかの利点が提供しています：（1）比較的単純で安価な畜産を、 （2）体外受精、最も初期の発達段階から胚への容易なアクセスを可能にします。 （3）透明胚、それらが形成するように、細胞、組織、および器官の直接繰り返し観察を可能にします。 その後数十年にわたり、いくつかの進歩はさらにゼブラフィッシュモデルのパワーを増加させました。具体的には、フォワード遺伝子スクリーニング及び全ゲノム配列決定努力は、14、13、12、11、多くの発生過程に重要な変異および遺伝子の同定に重要な役割を果たし「&gt; 15、16。Gatewayクローニング方法は、転写活性化因子様（TALENs）によって例示さ、トランスジェニックのルーチンアプリケーション17、18に近づくゲノム編集の最近の進歩を可能にし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）-Cas9ヌクレアーゼ、 19、20、21、22に近づく変異の標的に導入を可能と同様に、ノックアウトおよびインをノック。組み合わせ、これらの方法では、ゼブラフィッシュ、特定の行動の根底にある遺伝的メカニズムと、いくつかのヒト疾患の研究のための強力なモデルを作ります23、24、25、26、27。 この作品は、開発に焦点を当てて精神的な規制や神経の発達における電気的活動の役割。焦点は、ゼブラフィッシュモデルはいくつかの利点を提供するために脊髄にあります。まず、胚および幼生の段階でゼブラフィッシュにアクセスすることは比較的容易です。そのため、人は少ないニューロンとシンプルな回路28、29を持っているの発達段階中に脊髄機能を研究することができます。また、ゼブラフィッシュ脊髄は、転写の特性及び特徴的なパターンによって実証されるように、他の脊椎動物と同様ニューロンの多様なセットを持っている30、31、32、33、34、35因子 。 特に、脊髄回路の機能の根底にあるメカニズムを解明することを目指しゼブラフィッシュにおける大多数の研究歩行をサポートするものは、当然のことながら幼虫36、37、38、39、40、41、42、43に焦点を当てています。しかしながら、脊椎機関車のネットワークを形成するニューロンの多くは、初期胚の段階でそれらの分化を開始する、〜9-10時間後に受精（HPF）44、45、46、47、48、49、50、51。そこで、脊髄神経細胞の形態学的および電気的特性が生じ、胚および幼虫期の間でどのように変化するかを理解することOveraのために重要です運動回路の形成と機能のLL理解。 ここで説明する解剖方法は、脊髄の神経細胞からパッチクランプ記録を許可し、正常胚期（〜17から48 HPF）と幼生期（〜3-7日受精後[DPF]）で適用されています。このアプローチは、関心のニューロンへのアクセスを提供するために必要な解剖の量を制限します。プロトコルは、獣医の縫合接着剤におけるゼブラフィッシュ脊髄ニューロンから記録するための他の公表された方法の大部分とは異なる記録チャンバーに胚または幼虫を取り付けるために、かなり微細なタングステンピンよりも、使用されています。 2つの異なるアプローチの可用性は（ すなわち、タングステンピン対縫合のり）電気生理学的解析のためにゼブラフィッシュの胚や幼生を取り付けるための代替オプションを持つ研究者が具体的な実験の目標を達成するために用意されています。 まず、ポップからアクセスして記録するための手順<html>一次感覚ニューロンのピュレーションは、Rohon-ベアード細胞は、記載されています。これらのニューロンの細胞体は、背側脊髄内にあります。 Rohon・ベアード細胞は、多数の脊椎動物種に存在する初期の開発で差別化、および胚タッチレスポンス6、44、47、48の基礎となります。 第二に、脊髄運動ニューロンからアクセスして記録するための手順が詳述されています。ゼブラフィッシュ脊髄運動ニューロンは、神経発生の二つの波の間に生じます。以前生まれの一次運動ニューロンはhemisegment 45、46、49あたりに存在するだけで3-4一次運動ニューロンと、原腸形成の終わり（〜9-16 HPF）で発生します。これとは対照的に、二次運動ニューロンの後に生まれ人口は、より多数で、長期間の間に発生する、〜14 HPFで始まりますEF &quot;&gt; 45、50。中間トランクセグメントにおける二次運動ニューロン起源が主に51 HPF 50によって完成される。二次運動ニューロンは、羊膜46における運動ニューロンの相手であると考えられる。興味深いことに、脊柱上のニューロンは、ドーパミンを介して、運動を制御します胚及び若い幼虫50における幼虫と二次運動ニューロン起源で、51。一次および二次運動ニューロンそれぞれは、いくつかの異なるサブタイプを含む。各一次運動ニューロンのサブタイプは、ステレオタイプその結果、特性の筋肉群を神経支配する末梢軸索を投射軸索の軌跡を識別する。一般に、二次運動ニューロンは、以前に一次運動ニューロンによって確立された軸索の経路をたどる。このように、軸索軌道に対して、一次および二次運動ニューロンを除いて、類似している軸索の厚さと細胞体サイズA一次運動ニューロン45のための大きい再。 第三に、介在ニューロンの数のタイプからの記録のための方法が説明されています。しかしながら、これらの場合に、他の脊髄細胞の除去の限られた量が必要であり、従って脊髄Rohon-ひげ細胞又は運動ニューロンから記録のためのより少ない無傷です。

<table><tbody><tr><td>真空フィルター/保存ボトル、0.22 mmポア</td><td>コーニング</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター0.2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>3-aminobenzoateエチルメタンスルホン酸塩&nbsp;</td></tr><tr><td>&α;-ブガロトキシン</td><td>トクリス</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>トクリス</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ-549 ヒドラジン塩</td><td>分子プローブ</td><td>A-10438</td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td>スピンX遠心分離管フィルター</td><td>コーニング</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>シルガード シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>184</td><td>シリコーン エラストマー</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ハーバード装置</td><td>30-0038</td><td>内径と外径 0.78 および 1.0 mm (薄肉ガラス毛細管)</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>1-000-1000-100</td><td>内径と外径1.13mmと1.55mm(厚肉ガラスキャピラリー)</td></tr><tr><td>ミニチュアトゲ付きポリプロピレンフィッティング&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbondティッシュ接着剤&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極プーラー</td><td>サッター装置</td><td>&nbsp;P-97型&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr> 電動マイクロマニピュレーター <tr><td>CV203BU</td><td></td><td>ヘッドステージ</td><td>モレキュラーデバイス</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon チューブ</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN、OD 1/8 IN および WALL 1/32 IN (フレキシブル実験用チューブ)</td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal 3方向ストップコック&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ取得および分析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - ClampexおよびClampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>型名</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">解剖および録音ソリューション(mM)</td></tr><tr><td>細胞内を除くすべての溶液は、ろ過(0.22 mmフィルターカップ)および室温(RT)で保存した場合、~2〜3か月間安定です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞内溶液をろ過し(0.2 mmシリンジフィルター)、凍結保存(-20°C;C)使用日に個別に解凍される小さなアリコートで。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖/リンガー'溶液</td><td></td><td></td><td>145 NaCl、3 KCl、1.8 CaCl2.2H2O、10 HEPES; pH 7.4 (NaOH含有)</td></tr><tr><td>ピペット(細胞内)記録溶液</td><td></td><td></td><td>135 KCl、10 EGTA酸、10 HEPES; pH 7.4 (KOHを含む)。</td></tr><tr><td>バス(細胞外)記録溶液/電圧および電流クランプ</td><td></td><td></td><td>125 NaCl、2 KCl、10 CaCl2.2H2O、5 HEPES; pH 7.4(NaOHを含む)。</td></tr><tr><td>Alexa-594ヒドラジン塩原液&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ddH2O、アリコート(~100 &micro;l)で保存し、-20°Cで保存します。使用するには、ピペット溶液で132倍に溶液したストックを最終濃度100 mMまで希釈します。希釈後、Alexa-594を含むピペット溶液をろ過します&nbsp;遠心分離管フィルター付き。</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>固定化剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4%エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩(トリカイン)</td><td></td><td></td><td>0.2 Mトリス、pH 9(0.4 gトリカイン/ 100 mL 0.2 Mトリス)に0.4%ストック溶液を準備し</td></tr>ます<tr><td colspan="4">NaOHでpHを7に調整し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td colspan="4">使用するには、胚培地250 mMでストック溶液を~25倍に希釈</td></tr>します <tr><td>&α;-ブンガロトキシン</td><td></td><td></td><td>ddH2O(1 mg / 500 mL)に250 mMストックを準備し、100 & micro;Lアリコート、および-20°Cでsotre。</td></tr><tr><td colspan="4">使用するには、細胞外溶液で2,500倍に希釈して最終濃度を100 nMにします。</td></tr><tr><td>1 mM テトロドトキシン</td><td></td><td></td><td>ddH2O (1 mg/3 mL) 中の 1 mM ストックを調製し、100 & micro を調製します。Lアリコート、および-20°Cでsotre。</td></tr><tr><td colspan="4">使用するには、細胞外溶液で2,000倍に希釈して最終濃度を500 nMにします。</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

ゼブラフィッシュは、最初に発達モデルとして導入、他の多くの分野で人気を得ています。急速に発展する生物の大量飼育の容易さは、胚の光学的透明性と組み合わせて、このモデルの初期の魅力的な属性を務めていました。過去20年間、このモデルの成功は、さらに大規模突然変異誘発画面へと遺伝子導入の容易さによって、その従順によって推進されてきました。さらに最近では、遺伝子編集手法は、モデルの力を高めています。 神経発達の研究のために、ゼブラフィッシュ胚及び幼虫は、複数の方法が適用可能なモデルを提供します。ここでは、神経細胞の本質的な特性、電気的興奮の研究を可能にする方法に焦点を当てています。ゼブラフィッシュ脊髄ニューロンの電気生理学的研究のための私たちの準備は、記録室への準備を確保する獣医師の縫合接着剤の使用を含みます。記録のための代替方法ゼブラフィッシュ胚および幼虫から微細なタングステンピン1、2、3、4、5を用いてチャンバに製剤の付着を含みます。最大4幼虫の背側をマウントするために使用されてきたものの、タングステンピンはほとんどの場合、横方向で準備を取り付けるために使用されます。縫合糸の接着剤は両方の向きで胚および幼生をマウントするために使用されています。接着剤を使用して、最小限の解剖は、それによってどんな結果として損傷を回避する、酵素処理を使用せずに脊髄の神経細胞へのアクセスを許可する、実行することができます。しかし、幼虫のために、脊髄の周囲の筋肉組織を除去するために簡単な酵素処理を施す必要があります。ここで説明する方法は、いくつかのdevelopmentaで運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンの固有の電気的特性を研究するために使用されていますLステージ6、7、8、9。

我々が正常幼虫DPF 7を介して17個のHPF胚でRohon-ひげニューロンから記録された（ 図5Aおよび5B）。 Rohon-ベアード細胞を記録した場合、調製物は、背側を上に取り付けました。そのような実装は、その表層背側位置と大細胞体のサイズに基づいRohon-ビアード細胞の明確な同定を可能にします。識別は、さらにこれらのニューロンのステレオタイプの過分極静止膜電位（ 図5、 挿入図のテーブル ）6、54によって確認されます。また、一次感覚ニューロンとして、Rohon-ひげニューロンは、シナプス入力を欠いています。電流クランプモード（ 図5B」）に記録しつつ、電気的刺激の非存在下で、膜電位の変化は生じないはずです。ゼブラフィッシュにおけるRohon-ビアード細胞から最初の記録が行われたので&lt;SUP...

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

本調製における全体的な目的は、胚および幼生期のゼブラフィッシュ脊髄ニューロンをin situで電気生理学的に研究できるようにすることです。電気生理学的解析は、ゼブラフィッシュモデルで可能な強力な遺伝学的アプローチおよびイメージングアプローチを補完するものです。この手法はもともとrohon beardニューロンを研究するために開発されましたが、時間の経過とともに容易に適用範囲を広げ、現在は様々な種類の脊髄ニューロンの研究が可能となっています。本手順の実演は、長年共同研究を行ってきたリサーチアソシエイトのRosa Moreno博士が行います。まず、一方のガラスボアから黒色のバルブを取り外し、もう一方のガラスボアから取り出した白色のゴムアダプターと交換します。次に、フレキシブルチューブを約38 cmの長さに切断します。次に、小さな直線状のポリプロピレン継手を用いて、フレキシブルチューブを取り付けます。シリコンエラストマーを準備するために、ベースと硬化剤を4:1の比率でプラスチック製コニカルチューブに加えます。その後、エラストマーベースと硬化剤を十分に混合します。混合液を2枚の100 millimeterペトリ皿に注ぎ、一方の皿には約1 millimeter、もう一方の皿には約2.5 millimetersの深さになるようにします。シリコンエラストマーを空気にさらして4〜5日間放置し、硬化させます。より早く硬化させる必要がある場合は、60 degrees Celsiusでインキュベートしてください。その後、硬化させた厚さ1 mmのエラストマーから、チャンバーの底面として使用するために3.8 cm × 6.3 cmの長方形を切り出します。硬化させた厚さ2.5 mmのシリコーンから3.8 cm × 6.3 cmの長方形を切り出します。次に、そこから2.5 cm × 5 cmの内部長方形を切り出し、チャンバー上部のフレームを作成します。解剖記録チャンバーを作成するには、薄いシリコンの長方形をガラススライドの上に直接置き、シリコンとガラスの間に気泡が入らないようにします。次に、シリコンの長方形フレームを、この薄いシリコンの下層の上に配置します。この手順では、2〜3 mLのリンガー液を含む解剖チャンバーに胚を入れます。チャンバーに0.4%トリカイン溶液を100 µL添加して、胚を固定します。次に、マイクロピペットプラーを用いて、薄壁ガラス管から先端が細く長い注入用マイクロピペットを作成します。作成したガラスマイクロピペットを、グルーディスペンサーのガラス底面に装着します。解剖顕微鏡下でピンセットを使用してガラスマイクロピペットの先端を折り、直径約75 µmの先端を作成します。次に、マウスピースから吸引して、3〜5 µLの接着剤をガラスマイクロピペットに充填します。接着剤を満たした先端を解剖チャンバーまで移動させます。次に、マウスチューブを介してマイクロピペットにわずかな正圧をかけながら、接着剤を充填したマイクロピペットの先端を胚の頭部に近づけます。先端が胚の頭部に近づいたら、十分な正圧をかけて、チャンバーの底に接着剤を少量滴下します。解剖ピンを使用して胚を接着剤の滴の方へ移動させ、頭部を接着剤に接触させます。胚を背面が上になるように向きを合わせ、頭部を軽く押して接着剤に十分に密着させます。接着剤がゆっくりと硬化する間に、解剖ピンを使用して胚の位置を調整し、腹側が下、背面が上になるように配置します。解剖ピンを接着剤の滴に浸し、接着剤を数本、胚の頭部の上や周囲に引き延ばして、位置をさらに固定します。頭部をシリコンにしっかりと固定し、接着剤が凝固したら、別のガラスマイクロピペットを用いて後脳レベルで切断し、胚を犠牲にします。新しいガラスマイクロピペットを使用し、後脳より尾側の位置で皮膚を数回浅く切開します。背面を上にして固定した検体の場合は体幹の両側で、側面を上にして固定した検体の場合は体幹の露出した側で、ピペットを吻尾軸に垂直に動かして皮膚を浅く貫通させます。ピンセットで掴むための皮膚のフラップを作成するため、最初の切開部位と同レベルで、かつ切開線に対して垂直に、マイクロピペットで皮膚を数回掻き出します。ピンセットを用いて皮膚のフラップを徐々に持ち上げ、皮膚を尾側方向に引っ張ります。その後、胚の尾に近い位置に接着剤を少量滴下します。この接着剤を使用して、尾を解剖チャンバーの底に固定します。接着剤が硬化する間に、解剖ピンで体幹の位置を調整し、体幹が背面を上にした状態でチャンバーにしっかりと固定されていることを確認してください。この初期解剖の後、リンガー液で標本を十分にすすいでトリカインと残渣を取り除き、5分間静置します。次に、解剖液を細胞外記録液に交換します。必要に応じて、標本に固定剤を添加してください。続いて、胚をマウントした解剖チャンバーを、40 Xの水浸長作動距離対物レンズを備えた正立複合顕微鏡のステージに移動させます。次に、中空のケイ酸塩厚壁ガラスマイクロピペットをヘッドステージの電極ホルダーに取り付けます。チューブの一端を電極ホルダーの空気出口に、もう一端を三方活栓に取り付けます。その後、別のチューブの一端にマウスピースを取り付け、もう一端を三方活栓に接続します。続いて、マイクロピペットのチップを脊髄の最も背側に持っていき、髄膜をそっと貫通させます。次に、素早く短い横方向の動作を繰り返し、髄膜を緩めます。マイクロピペットのチップが髄膜を通過したら、チップを前進させて持ち上げ、髄膜を脊髄から剥がします。その後、マイクロピペットを吻側へ1〜2個の半節分移動させ、rohon beard細胞を露出させます。我々の経験では、rohon beardニューロンは他の脊髄ニューロンよりも脆弱です。これらの健康な状態を維持するため、一度に露出させるrohon beardは1〜2個に留めます。受精後1日、2日、および7日の胚および幼魚のrohon beardニューロンから、外向きおよび内向き電流のボルテージクランプ記録を取得した。保持電位は-80 mVとし、+20 mVへの脱分極ステップによって電流を誘発させた。カレントクランプモードでは、1 msの間0.35 nAの電流を注入することで、胚と幼魚の両方のrohon beardニューロンから単一の活動電位を誘発させた。電気刺激がない状態では、rohon beardニューロンに自発的なスパイクは見られません。rohon beardニューロンの静止電位は、発生が進むにつれてより負の値になります。この手法を習得すれば、10分以内に胚を固定して解剖し、rohon beardを露出させることができます。プロトコルで述べたように、接着剤が硬化する速度を決定する要因を理解することが重要です。このビデオでは、ゼブラフィッシュの脊髄ニューロンから記録を行うための重要な手順を解説します。

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