Name: 体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 学ぶ移植免疫学における制御性細胞サブセットの抑制活性評価法。ラット心臓移植モデルを用いてin vitroとin vivoの両方で免疫寛容誘導と体液性応答を評価する手法を解説します。

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この作品は、ANR (ANR-11-LABX-0016-01)、IHU セスタス プロジェクトも、資金を管理する"Investissements d'Avenir"フランス政府プログラムの一部である Labex 囲碁プロジェクト (n ° ANR-11-LABX-0016-01) のコンテキストで実現した、"Investissements d'Avenir「フランス政府プログラム、管理によって、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005)。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

新しく移植の受信者へ合計脾細胞の養子送金する誘導または治療による細胞の存在を検出する効率的な方法です。ホスト照射誘起過渡のリンパ球減少は、転送後の細胞生存率と許容範囲の確立を推進しています。また、亜致死照射は免疫寛容免疫再構築、感染耐性34と呼ばれる現象の中に新しい細胞に変換するプロパティを持つセルの時間を残します。通常、よく説明 CD4+CD25高Foxp3+CD127低トレランスを観察すると Treg が学んだ最初。ただし、負の分数の転送 (脾細胞の cd4 枯渇+Treg) により時々 拡張機能はすでに知られている細胞と新しい細胞集団1、2の同定 3,4。AdCD40Ig 誘起寛容で、CD4 の転送<...

ラット心臓移植寛容誘導とメンテナンスのメカニズムを解読するためのトレランス誘導治療を評価するために信頼性の高い臓器移植モデルで、機能的有能で支配的な細胞を誘発する可能性があります。以下のプロトコルは、ルイス 1 a 受信者ラット (LEW.1A、RT1、) に、完全に不一致異所性心臓移植ルイス 1 w ドナー ラット (LEW.1W、RT1u) をについて説明します。この台木に急性拒絶反応は急速に (約 7 日間) で発生して簡単に測定、腹部の触診を破って移植によって評価されることができます。ここでラットの心臓移植への耐性を誘導するために 3 つのプロトコルを提案する.これらのモデルで耐性誘導や各種規制のセルによって維持されます。最初に、CD40Ig をエンコード アデノ ウイルスと CD40 CD40L の相互作用のブロック (AdCD40Ig) による CD8 の世代二次グラフト受信者1に転送+ Treg ときに対して耐性を誘導することができます。さらに、による cd8 陽性+細胞 (抗 CD8α 抗体) に生成 AdCD40Ig 扱われる受信者 Bregs と RegMCs の2。CD8 の深い分析+ Treg プロパティは、インターロイキン-34 (IL-34)、Fibroleukin 2 (FGL-2)3,4,5,6 として定義されているいくつかの免疫調節分子の重要な役割を強調表示.(AAV ベクター) と IL-34 の過剰発現は、RegMCs の世代を通じて自己寛容を誘導に対し FGL 2 の過剰発現は細胞の複雑なネットワークを基になる Bregs を誘発しました。
慢性拒絶反応はゆっくり開発し、長期、慢性拒絶反応に対する許容範囲を区別するために詳細な分析が必要です。移植は通常細胞浸潤の評価 immunohistology7による血管壁と補完 C4d 沈着の肥厚、線維化。組織学方法、動物の犠牲を必要とするまたは生検を移植、ここで忍容性同種のさまざまな機能を評価する簡単な方法を説明: 出現および細胞と血液から抗ドナー抗体応答の機能フローサイトメトリーによるサンプル (ここでは、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用)。
公差、同種移植を治療の逮捕後のメンテナンスは8細胞の誘導と一般に関連付けられました。最後の十年の研究は、CD4 に焦点を当てた+Treg 満場一致で特徴と+キー マーカー Foxp3 によってそれら、CD25高CD127-9,10,11。同様に、いくつかのマーカーは、CD8 に帰因した+ Treg CD122 よう+、CD28-、CD45RC低、PD1+とヘリオス+1、12,13,14,15,16,17. 年、GITR、CTLA4、およびサイトカインの発現 (IL-10、TGFβ、イリノイ州 34、IL 35、FGL-2) Treg プロファイル3,4,6,13にさらに関連付けられました。 18,19,20,21。Bregs、RegMCs、NKTregs などの新たな規制のセル人口は、関連性の高い特定のマーカーを欠けています。確かに、Bregs は大抵未熟な CD24 として報告されますあいまいな CD27 の発現と時々 IL-10、TGFβ、またはグランザイム B22,23,24の生産、+の細胞します。骨髄性細胞系列の複雑さには、CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a、または CD163 の25,26などの規制や炎症性のプロファイルを定義するいくつかのマーカーの組み合わせが必要です。最後に、いくつかのマーカーは、CD11b など NKTregs を識別するために報告されている+CD27+表現型を記述するために27,28,29 TGFβ+、しかしより多くの研究が必要 ,30,31,32。したがって、抑制活性の証拠はさらに新しいバイオ マーカーの同定については表現型を正当化するために必要な新しい免疫メディエーターと新しい細胞療法に範囲を拡張します。
細胞の抑制活性を評価する 2 つの補完的な手法を提案する.まず、体外法ドナー抗原提示細胞 (APCs) 異なる比率で 6 日間で刺激したラベル付きエフェクター T 細胞の抑制細胞を培養で構成され、分析、エフェクター T 細胞の増殖をドナー監督免疫抑制を反映しています。投与したラットからの細胞は素朴なラットおよび非投与移植ラット抑制活性のため (またはその他の規制のセル人口) から抑制: エフェクターの比率の範囲内のセルに直接比較できます。また、このメソッドは、すべての移植を必要としない、6 日以内に結果が得られます。第二に、体内のメソッドは、目的の細胞を投与群のラットから新しく照射移植の受信者に転送するで構成されます。B 細胞、骨髄細胞、T 細胞から世間知らずの非投与ラット、養子の転送時にグラフト生存を延長する、急性拒絶反応を抑制することができる通常、扱われる受信者から増強作用抑制活性を持つ細胞があるこれらの属性1,2,3,4,33。受信者の照射によるリンパ球減少症に対して転送細胞血液の恒常性によって影響を受けませんし、抗ドナー免疫反応をより簡単にマスターできるように推奨します。両方の方法は、同種造血幹細胞の in vitro利用第三者 Apc または生体内で養子伝達抑制のためサードパーティ心移植の受信者に細胞は抗ドナー特異性の解析を許可します。体内法表現悪い細胞のかなりの数を必要とするのに対し、細胞の亜集団は抑制活性の in vitro33より簡単に評価できます。
体液性応答は、寛容の状態、ドナー抗原に対する抗体の監督のコントロールを評価するためにも測定できます。確かに、寛容は、ドナーに対する体液性応答の不在が、受信者が新しい抗原に対する体液性応答を開発するための能力の保全と記憶応答の保全によって特徴付けられます。まず、alloantibody 検出の原理は、移植の受信者から次のドナー細胞血清型のインキュベーション受信者抗体によるドナー細胞の認識に基づいています。外因性の抗原に対する 2 番目、体液性応答は、長期許容受信者鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) が乳化フロイント完全アジュバントの評価次刺激をすることができます。抗原に対する特異 IgM および IgG 抗体の存在を検出できます 4 と 13 日、それぞれ、免疫、酵素リンク免疫測定法 (ELISA)34以下。第三に、移植と赤血球染色受信者血清日収集 +8 と移植 +17 日-7 と +3 で異種の赤い血球 (赤血球) の注射による免疫学的記憶の保存を評価できます。これらすべてのメソッドは、免疫グロブリンのサブタイプの同定、特定の二次抗体と FACS の汚損によって未満 1.5 h で結果の迅速な収集や elisa 法によるいくつかの時間を使用しています。
最後に、これらのプロトコルは移植モデルのために設計されて、ある程度、自己免疫疾患モデルに適用することができます。法の原則は、すべての種に置き換えることができます。

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1WおよびLEW.1Aラット</td><td>Janvier Labs、フランス</td><td></td>、<td>8週齢、&nbsp;</td></tr><tr><td>BN第三者ドナーラット</td><td>Janvier Labs、フランス</td><td></td>、<td>生後8週間、&nbsp;</td></tr><tr><td>name</td><td>strongcompany</td><td>カタログ番号</td><td>comments</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>ウイルスベクターコア、INSERM UMR 1089、INSERM UMR 1089、</td><td></td>フランス、ナント、<td>自家製プラスミド</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>, フランス</td><td></td><td>自家製プラスミド</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>ウイルスベクターコア, INSERM UMR 1089, ナント, フランス</td><td></td><td>自家製プラスミド</td></tr><tr><td>抗TCRab</td><td>ハイブリドーマ from European Collection of Cell Culture, ソールズベリー, イギリス</td><td>R7/3 クローン</td><td>自家製培養、精製、フルオロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD25</td><td>ハイブリドーマ from European Collection of Cell Culture, ソールズベリー, イギリス</td><td>OX39 クローン</td><td>自家製の培養、精製、およびフルオロロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD8</td><td>ハイブリドーマ ヨーロッパ細胞培養コレクション、ソールズベリー、英国</td>からの抗CD8<td>ハイ</td>ブリドーマ <td>自家製培養、精製、およびフルオロロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD45RA</td><td>ハイブリドーマ ヨーロッパ細胞培養コレクション、ソールズベリー、英国</td><td>OX33クローン</td>自家製<td>培養、精製、およびフルオロロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD161</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, ソールズベリー, 英国</td><td>3.2.3 クローン</td><td>自家製培養、精製、フルオロロフォア結合抗</td></tr><tr><td>CD11b/c</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, ソールズベリー, 英国</td><td>OX42クローン</td><td>自家製培養、精製、フルオロロフォアカップリング</td></tr><tr>抗<td>TCRgd</td><td>ハイブリドーマ from European Collection of Cell Culture, ソールズベリー, 英国</td><td>V65クローン</td><td>自家製培養、精製、およびフルオロロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD45RC</td><td>ハイブリドーマ、ヨーロッパ細胞培養コレクション、ソールズベリー、</td>英国<td>OX22クローン</td>からの自家製<td>培養、精製、およびフルオロロフォアカップリング</td></tr><tr><td>抗CD4</td>ハイ<td>ブリドーマヨーロッパ細胞培養コレクション、ソールズベリー、英国</td><td>OX35クローン</td>自家製<td>培養、精製、フルオロログループカップリング</td></tr><tr><td>抗CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554881, His24 clone</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td><td>#112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG1</td><td>Serotec</td> <td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>抗ラットIgG2a</td><td>Serotec</td> <td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット IgG2b</td><td>Serotec</td> <td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td><td>#115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA</td><td>#9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc.、カルシウム</td><td>とマグネシウムを含まない米国</td><td></td>リン酸緩衝液、&nbsp;</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>TMB substrate reagent kit</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM CFSE cell proliferation kit</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc #C34554</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RPMI 1640 medium 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc, USA#</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン連鎖球</td>菌<td>サーモフィッシャー&nbsp;Scientific Inc, USA#</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc, USA#</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc, USA#</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>ソルビオン</td>酸ナトリウム <td>サーモフィッシャー&nbsp;Scientific Inc, USA#</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 beta mercaptoethanol</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr> #M3148 <tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor&reg; 450 Cell</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc, USA</td><td>#65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr> #G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc #D1306</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics, Germany</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr> #E5134 <tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td> <td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic dynabeads</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Goat anti-mouse IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, USA</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>機関</td><td></td><td></td>ガイドラインを参照</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>機関ガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>Naplbuphine</td><td>機関ガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>Terramycine</td><td>機関ガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>機関ガイドラインを参照ガイドライン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td>施設のガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>完全なフロイントのアジュバント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロンプン</td><td>施設のガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>リンガー乳酸</td><td>施設のガイドライン</td><td></td><td></td>を参照</tr><tr><td>ケタミン</td><td>施設のガイドラインを参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解液</td><td></td><td></td><td>8,29ml H2Oで8,29g NH4Cl(シグマ、セントルイス、米国A-9434)、1g KHCO3(Prolabo 26 733.292)および37.2mg EDTA(シグマ、セントルイス、米国E5134)を希釈します。pHを7.2〜7.4に調整し、H2Oで1Lまで完成させます。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD</td><td></td><td></td> コ<td>ラゲナーゼ 1g コラゲナーゼを 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%) -EDTA (0.5%)</td><td></td><td></td> で希釈し、<td>5 mL EDTA 0.1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) と 20ml FCS を 1ml PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td> に添加します。<td></td><td></td><td>希釈50&マイクロ;90μのCFDA SE(成分A)のg(= 1バイアル)。l DMSO(成分B)溶液で10mMのストック溶液を得た。次に、ストック溶液をPBS 1Xで1/20,000で希釈して、0.5&μ;</td></tr><tr><td>共培養</td><td></td><td></td>用M溶液完全培地 <td>500ml 完全RPMI-1640培地 5 ml ペニシリン (80 unit/ml)-ステプトマイシン (80 mg/ml)、5 ml L-グルタミン、5 ml 非必須アミノ酸 (100X)、5ml ピルビン酸ナトリウム (100mM)、5 ml HEPES 緩衝液 (1M)、2.5 ml b メルカプトメタノール (7 ml 2-bmercaptoethanol ストックを 10 ml RPMI で希釈)、10% FCS</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>ふる</td><td></td><td></td><td></td>い</tr><tr><td>コーニングプラスチック培養皿</td><td>VWR、ペサック</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&micro;mおよび60&micro;m tissue filters</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td><td>#03-100/44 and #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 wells U bottom plates for coculture</td><td>&nbsp;Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>96 wells V bottom plates for FACS staining</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>96 wells flat bottom ELISA plates</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringue for spleen crush</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>ELISA reader</td><td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td><td>SPARK 10M、テカン、スイス</td><td></td></tr>、<tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bain marie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X線照射器</td><td>イギリス リンコルシャー</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>ソーラーアジテーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnet</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific Inc、米国</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

体外と体内の t, b, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

移植の主な関心事は、細胞の誘導を介して特定のトレランスを達成するためにです。トレランスのメカニズムの理解には、信頼性の高いモデルが必要です。ここでは、共刺激が引き起こす信号の封鎖すること遺伝子導入による免疫制御分子の発現によって誘導されるラットの心臓移植への耐性のモデルについて述べる。これらの各モデルは、制御性 T 細胞 (Treg)、B 細胞 (Bregs) や骨髄性細胞 (RegMCs) など細胞の生体内で生成できます。本稿で述べる特定し、寛容誘導と保守.に彼らの責任を決定するための in vitroとin vivoの規制細胞活性の定義に使用されている 2 つの相補的なプロトコルまず、体外抑制アッセイは用量依存的にエフェクター免疫応答の抑制能力を持つ細胞の迅速な同定を可能し、サイトカイン測定や細胞毒性などさらに分析に使用することができます。第二に、新しく照射接木された受信者に寛容な扱われた受信者からセルの養子転送監督移植免疫反応を制御するおよび/または新しい細胞 (の変換でこれらの細胞性免疫寛容を強調表示呼ばれる感染性トレランス)。これらのメソッドは、表現型の既知のマーカーとセルに制限されておらず、任意のセル人口を拡張することができます。さらに、ドナー監督 allospecificity 細胞 (フィールドで重要な目標) の第三者によるドナーの細胞を使用して評価することができますまたは体外か体内に移植します。最後に、これらの細胞の特定の免疫寛容の容量を調べるには、体液性抗ドナー抗体と受信者の新しいまたは元の知られている抗原に対する体液性応答を開発する能力を評価するためのプロトコルを提供します。説明耐性のモデルはさらに新しいバイオ マーカーと免疫制御分子を識別するために細胞を特徴付けるために使用ことができます、他の移植モデルまたは齧歯動物または人間の自己免疫疾患に適応。

(図 2)、同時に Apc (図 1)、細胞および Treg の並べ替えに続く抑制の活動の評価、または個別に (図 4)、他の推定上規制セル (図 3) ができ完了生体内で直接注入する細胞と体外CFSE 明るさ (図 5) の測定によって。ドナー (図 6) や (図 7と8) 外因性の抗原に対する受信者の体液性応答のステータスは評価生体外で描かれる生体内での予防接種も可能です。
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ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin vivo評価プロトコルを提案します。

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

移植における免疫寛容の誘導は、しばしば調節細胞集団の出現を伴います。これは、ドナーに対する免疫反応が消失しながらも、外来抗原に対する免疫能は維持されている状態です。本ビデオでは、任意の調節細胞サブセットの抑制能およびホストの体液性免疫応答の状態を、in vitroおよびin vivoで評価するための異なるプロトコルを紹介します。ドナーとなるLewis 1Wラットを、イソフルランO2吸入および5分後のN20 1%添加により麻酔します。動物を背臥位にし、腹部をベタジンで消毒して開胸術を行います。下大静脈と上大静脈をクランプし、結紮した後、切断します。次に肺動脈と大動脈を切断し、移植片を冷たい0.9% NaClに保存します。8〜12週齢の150gのLewis 1Aレシピエントラットを、N2O 1%を添加したイソフルランO2吸入法で麻酔します。動物を背臥位にし、ベタジンで腹部を消毒して頭側から恥骨まで開腹します。腸管を体外にだし、腹部の血管をクランプします。移植された大動脈と腹部大動脈との間で末端側側端吻合を行います。肺動脈と腹部大静脈の間のクランプを取り除きます。筋層と皮膚を縫合し、ベタジンで消毒します。メロキシカムを皮下注射し、テラマイシンとブプレノルフィンを筋肉内注射した後、動物が覚醒するまでヒートランプの下に置きます。同系他個体（アログラフ）の拒絶反応を軽減するため、選択した薬剤を用いてさらに処理を進めます。未処理のLewis 1Wラットから脾臓を採取し、冷PBS 1xで保存します。脾臓をディッシュに移し、PBSを除去して5 mLのCollagenase Dで灌流します。酵素の作用を高めるため、脾臓を小さく切り分け、37 °Cで15分間インキュベートします。0.1 molar EDTAを500 microliters加えます。脾臓の断片をふるいに移し、滅菌済みのペスティルで脾臓をすり潰して細胞を分散させます。チューブに移し、50 millilitersのPBSで細胞を洗浄します。430 Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、赤血球と血小板を除去します。脾細胞のペレットを10 mLの低張溶液に再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。その後、PBSで洗浄し、190 Gで10分間遠心分離します。上清を捨てます。100 µmの組織フィルターでろ過し、コラーゲン繊維を除去します。細胞数をカウントし、PBS（CS 2%、EDTA 0.5 mM）を用いて細胞濃度を5 × 10⁷ cells/mLに調整します。T細胞をラベルするためのanti-TCR alpha/betaおよびanti-TCR gamma/delta、B細胞をラベルするためのanti-CD45RA、およびNK細胞をラベルするためのanti-CD161と共に、4 °Cで15分間インキュベートする。PBS

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明...

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。...

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

我々は潜在的に移植片拒絶反応のリスク上昇せずに移植後免疫抑制の撤退を決定するために使用することができる貴重な診断アッセイを記述します。アッセイは、遅延型過敏の原則を使用し、受信者によってマウントされたドナーの特定のエフェクターと規制免疫応答の両方の正確な評価を提供します。...

抗原特異的規制用のトランス生体内遅延型過敏アッセイ

インビボで詳細に T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答の我々の理解の開発のために重要である。ここでは、フローサイトメトリーで同時に&gt; 250のパラメータを評価するin vivoでの T細胞アッセイにおける蛍光の標的配列（のFTA）の使用を記載している。...

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

この論文は、イメージングフローサイトメトリーを使用して、T細胞の混合集団におけるアロ反応性を測定するための方法を記載しています。...

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

標準的な免疫学的技術のアプリケーションをご紹介 (CFSE 染色 OT-私増殖) 急速に補助を介した細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の生成をモニターするつもり体内。CTL...

急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics...

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance...

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

移植片対宿主病は、同種骨髄移植後の主要な合併症である。樹状細胞は、移植片対宿主病の病因において重要な役割を果たす。現在の記事では、移植片対宿主病の発症における樹状細胞の役割と移植片対白血病効果を調査するための新しい骨髄移植プラットフォームについて説明しています。...

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

この研究は、皮外(EC)免疫を通じてマウスの免疫応答を調節する皮膚の役割を示しています。タンパク質抗原によるEC免疫は、接触過敏症の免疫応答を抑制したり、病原体に関連する分子パターンと組み合わせることで皮膚誘発性の抑制を逆転させることができます。EC免疫は、針を使わない効果的な免疫療法として有望視されています。...

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このプロトコルは、調節T細胞がエフェクターT細胞の増殖および分化に与える影響を調査するための in vitro...

in vitro 調節T細胞の機能分析:増殖と分化に焦点を当てる

学ぶ移植免疫学における制御性細胞サブセットの抑制活性評価法。ラット心臓移植モデルを用いてin vitroとin vivoの両方で免疫寛容誘導と体液性応答を評価する手法を解説します。

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

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