パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法
2017年2月26日
このレポートは、低圧真空を使用して、生物学的研究のための細胞と基質でマイクロ流体チャネルを充填するためのシンプルで実行しやすい技術について説明しています。
この手順の全体的な目標は、ほとんどの生物学研究室で利用可能なシンプルなベンチトップツールを使用して、細胞または基質を複雑で長く閉じたマイクロチャネルに分散させることにより、細胞または基質をパターン化することです。この方法は、細胞間および細胞とタンパク質の相互作用に関する生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、実行が簡単で、ほとんどの生物学研究所ですぐに利用できるツールのみが必要なことです。
一般に、この方法に不慣れな個人は、研究者が選択した細胞と基質のインキュベーション条件を最適化する必要があるため、苦労するでしょう。PDMSスタンプと溶液を適切に配置することで、実験の再現性が大幅に向上しるため、このメソッドの視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。まず、CAD描画ツールを使用してマイクロチャネルのレイアウトを描画します。
次に、図面を白い紙に印刷します。次に、イソプロパノールを使用して、デザインに対応するのに十分な大きさのスライドガラスをクリーニングします。次に、スライドをエアガンで乾かします。
清掃したスライドガラスに、気泡が溜まらないように注意して粘着テープを貼り付けます。次に、スライドガラスの側面をデザインの紙にテープで固定し、テープ面が上を向くようにします。紙のデザインを参考にして、メスを使ってスライドガラスのテープを切り取ります。
カットしたら、スライドガラスの不要な部分からテープをはがします。次に、スライドガラスをイソプロパノールですすいで、残留接着剤を取り除きます。次に、エアガンを使用して表面を乾燥させます。
パターンを付けて清掃したら、スライドガラスを摂氏65度のオーブンで30分間焼きます。次に、ゴムローラーでテープをそっと転がして気泡を取り除き、スライドをペトリ皿で室温まで冷まします。まず、PDMSエラストマー10部とその硬化剤1部を混合し、混合物を激しく攪拌します。
次に、混合物を真空チャンバーに入れて、気泡がなくなるまで混合物を脱気します。厚さ2mmの混合物を粘着テープの型に流し込み、すべての気泡が消えるまで型を脱気します。冷却したら、メスを使用して、フィーチャから少なくとも5mm離れたPDMSレイヤーを切断します。
次に、硬化したPDMSをピンセットを使用して型から剥がします。1mmの生検パンチで、できればマイクロチャネルのネットワークの端に、単一の入口穴を開けます。次に、PDMSキャストを粘着テープで清掃し、デバイスからほこりの粒子を取り除きます。
PDMSマイクロチャネルデバイスを70%エクタノールの溶液ですすぎ、続いて滅菌脱イオン水で滅菌し、UV光に30分間さらして滅菌します。ピンセットを使用して、滅菌済みPDMSキャストを滅菌済みガラスカバースリップに置き、ピンセットの先端を使用して穏やかな圧力をかけます。次に、ポリDリジンの液滴を四ホウ酸ナトリウムバッファーにマイクロチャネルの入口に置きます。
ペトリ皿を真空に10分間置きます。この間、気泡の形でチャネルから出てくる空気を観察します。真空を解除し、マイクロチャネルに流入する基質溶液を観察し、皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、滅菌ピンセットを使用してPDMSスタンプを慎重に剥がし、脱イオン水でパターンを3回洗います。ガラスカバースリップに1%BSA溶液を添加して非特異的な接着を減らし、サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、BSA溶液を吸引します。
細胞の間接的なパターニングを開始するには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、無血清培養培地で細胞懸濁液を調製します。パターン化されたシャーレに細胞懸濁液を添加し、パターン化された領域を細胞懸濁液に完全に浸します。次に、ペトリ皿をインキュベーター内で摂氏37度で15分間インキュベートし、細胞がパターン化された基質に付着できるようにします。
インキュベーション後、ペトリ皿から余分な細胞懸濁液を吸引し、パターン化された細胞をPBSで3回洗浄し、10秒間穏やかに振とうして付着していない細胞を取り除きます。次に、パターン化した細胞培養物に適切な培地を加え、パターン化した細胞を二酸化炭素緩衝インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。細胞を直接パターニングするには、まず、マイクロ流体デバイスを70%エタノールの溶液ですすいで、続いて脱イオン水で滅菌します。
次に、デバイスを1%BSAの溶液に一晩浸して、PDMSへの非特異的細胞の接着を防ぎます。デバイスを室温で乾燥させた後、組織培養処理したペトリ皿の底に取り付けます。マイクロチャネルを満たすのに十分な4〜8マイクロリットルの細胞懸濁液を入口に置き、穴を完全に覆います。
次に、ペトリ皿を真空チャンバーに10分間入れます。真空を解除し、マイクロチャネルに流れ込む細胞懸濁液を観察します。ペトリ皿を37°Cで二酸化炭素緩衝インキュベーターで最大1時間インキュベートします。
次に、インキュベーターから皿を取り出し、ピンセットを使用してPDMSを皿から慎重に剥がします。パターンをPBSで洗浄し、細胞培養培地をペトリ皿に加えます。終了したら、細胞をインキュベーターに戻します。
ここに示されているのは、ポリDリジンおよびラミニン表面上にパターン化されたラットの胚性皮質ニューロンです。細胞の位置は、パターン化された領域への一般的な付着と、PDLおよびラミニンストライプに沿った成長を示しています。ここには、より高い倍率で示されているのは、C2C12筋芽細胞です。
この細胞型は、パターン化された領域にも付着し、多核筋管への融合を示します。この技術は、ここで線維芽細胞で示されているように、直接的な細胞パターニングにも適応されています。この直接細胞パターニング法は、細胞の生存に悪影響を及ぼしません。
この手順に続いて、タンパク質の局在化や細胞と基質の相互作用に関する追加の質問に答えるために、蛍光顕微鏡などの他の方法を実行できます。この手順を試行する際には、細胞の液滴または基質溶液をインレイ全体を覆うように適切に配置することが成功のために重要であることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が網膜生物学における視細胞軸索ガイダンスを探求する道を開きました。
このビデオを見れば、負圧を使用してガス透過性PDMSマイクロ流体デバイスで細胞と基板をパターン化する方法について十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。
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概要
本レポートでは、低圧真空を用いてマイクロ流路に細胞および生物学的研究用の基質を充填する、簡便で容易に実施可能な手法について解説します。この手法は、細胞間相互作用や細胞とタンパク質の相互作用に関する生物学分野の重要な課題を解決するのに役立ちます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物学的研究
- マイクロフルイディクス
- 細胞間相互作用
背景
- この手法では、マイクロチャネルへの充填に低圧真空を利用します。
- 汎用的な研究室器具を用いて使用できるように設計されています。
- 本手法を適切に適用するには、インキュベーション条件の最適化が必要です。
- 視覚的な実演により、この手法の再現性が向上します。
研究目的
- マイクロチャネル内に細胞または基板をパターニングする。
- 細胞間相互作用の研究を促進する。
- 研究者に簡便な手法を提供する。
使用方法
- 低圧真空を用いてマイクロ流路に液体を充填する方法。
- CADツールを用いたマイクロチャネルのレイアウト設計。
- 結果を向上させるためのPDMSスタンプの配置。
- 特定の細胞および基質に対する条件の最適化。
主な結果
- 細胞および基質によるマイクロチャネルへの充填の成功。
- 適切な手法による再現性の向上。
- 生物学的相互作用の研究における有効性の実証。
- 生物学研究室の研究者が利用可能な手法。
結論
- この手法は実施が容易であり、生物学的研究に有効です。
- 細胞と基材の複雑なパターン形成が可能です。
- 適切に実施するためには、視覚的な補助資料が不可欠です。
よくある質問
産業界への実用的関連性
本手法では、汎用的な実験器具を用いて、複雑なマイクロ流体ジオメトリ内におけるタンパク質および細胞の精密な空間制御が可能となり、細胞-基質間および細胞-細胞間の相互作用に関するメカニズム研究を支援します。専用の装置や特殊な材料を必要としないため、初期探索段階におけるターゲットバリデーションおよびアッセイ開発の技術的なハードルを下げることができます。また、メカニズム的なリスク低減のために、再現性のある疾患関連マイクロ環境を構築できるため、表現型スクリーニングにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどの基質を制御して提示し、細胞接着およびシグナル伝達を評価することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 神経細胞株や線維芽細胞を含む複数の細胞種をパターニングし、パスウェイ特異的な応答を評価することで、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 予測的価値： 定義されたタンパク質パターン上の細胞挙動を直接比較することを可能にし、ターゲットへの信頼性を向上させることで、生物学的なリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物が細胞の接着、伸展、または分化に及ぼす影響を定量的に評価するための、標準化されたタンパク質パターン基材を調製します。
- 運用の価値： 真空駆動による長い閉鎖型PDMSマイクロチャネルへの充填により、基材コーティングのばらつきを抑え、アッセイの再現性を向上させます。
- 拡張性： 最小限の再ツール準備で、異なる細胞や基材タイプにわたってプラットフォームの再利用が可能であり、スクリーニングへの適応力を高めます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的な連続性：一次ニューロンおよび幹細胞由来ニューロン（例：ラット胚皮質、両生類網膜）をパターニングし、前臨床段階のターゲット評価に向けた疾患関連ニューラルネットワークをモデル化します。
- メカニズムによるリスク低減：パターニングされたラミニンまたはPDL上での神経突起の伸長および軸索誘導の研究を可能にし、神経治療薬の有効性の予測モデリングを支援します。
- リスク調整後の推進：基材の事前コーティングによる多様な細胞型の間接的なパターニングを可能にし、ターゲットエンゲージメント研究におけるモデル間の整合性を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的仮説の検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、化合物スクリーニング前にメカニズムの解析を可能にします。
- 探索生物学：基質にパターンを形成することで、制御された微小環境においてインテグリン介在性シグナル伝達やニューロン誘導キューを単離し、経路の解明を支援します。
- スクリーニング：蛍光顕微鏡法と組み合わせることで、細胞と基質の相互作用を定量的に空間分解能を持って読み取ることができ、条件間の比較を可能にします。
- 分析：イメージングに適したパターンを生成し、表現型のエンドポイントとして、細胞の配向、融合（例：筋管形成）、またはニューライトの長さの形態計測分析をサポートします。
- トランスレーショナル研究：疾患に関連するニューロンにパターンを形成し、基質依存的な生存や成熟を評価することで、前臨床研究へと繋げます（出典による裏付けがある場合に限る）。
- 企業内での再利用：複数のプロジェクトに適応可能なパターニングモジュールとして機能し、専門的な微細加工コア施設への依存度を低減させます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞と基質の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを軽減することで、ターゲット検証における予測の信頼性を高めます。
- 運用的価値：真空支援充填により、タンパク質沈着におけるユーザー依存のばらつきを最小限に抑え、再現性と標準化を向上させます。
- 戦略的価値：生理学的に関連のある環境下で、化合物が接着や形態に及ぼす影響を早期に評価可能にすることで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：リード最適化に多額の投資を行う前に、ターゲット結合に関するメカニズム的なデータを提供することで、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- マイクロ流体設計、PDMSの取り扱い、および細胞培養への適用における無菌操作の専門知識が必要です。
- 最適化および実行には、真空チャンバー、CADツール、および標準的な細胞培養インキュベーターへのアクセスが必要です。
- ユーザー間での再現性を確保するため、インキュベーション時間、真空処理時間、および基質濃度のチーム間標準化が必要です。
- 条件最適化の必要性にある通り、新しい細胞型やマトリックスタンパク質へ拡張する際の適応に関する検討事項が含まれます。
- マイクロチャネルネットワークを完全に満たすための精密なドロップレット配置の必要性など、成功率に影響を与える実用的な制限があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Fabrication of Master Molds for Soft Lithography Using Adhesive Tape
2:32
Soft Lithography Fabrication of PDMS Devices
4:02
Substrate Patterning
5:22
Indirect Patterning of Cells
6:29
Direct Patterning of Cells
8:05
Results: Direct and Indirect Patterning of Cells
8:56
Conclusion
