Name: パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶマイクロ流体チャネルへの細胞・基質パターニング法。低圧真空を用いて複雑な微細構造に充填し、細胞間・細胞タンパク質相互作用の研究に活用可能です。再現性の高い実験手法を習得できます。

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この研究のための資金調達（FHKに）脊髄研究（NJCSCR）にニュージャージー州委員会によって提供された、（BLFに）CSCR14IRG005を付与し、NIHは（CHCに）R15NS087501を付与し、（ETA）はFMカービー財団。

注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質の一部は有毒で発ガン性があります。毒性または酸/基材を使用した場合、すべての適切な安全対策（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）を使用してください。 フォトリソグラフィを用いて、ソフトリソグラフィのためのマスター金型の1製作<ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）図面ツールを使用してマイクロチャネルのレイアウトを描きます。 </li><li>レーザーマスク描画装置を用いて、マスクブランク板にレイアウトを印刷します。 </li><li>いかなる溶媒をウェハ上に残っていないことを確実にするために窒素エアガンイソプロパノール及びドライ続いアセトンで4インチシリコンウエハをすすぎます。 </li><li> 5分間、200℃のホットプレート上で焼成することにより、ウエハを脱水。 </li><li>マイクロチャネルの所望の高さのために設計されたネガ型フォトレジストを選択します。 Fまたは、例えば、50μmの高さのマイクロチャネルを得るために、ネガティブフォトレジストSU-8 50を使用します。 </li><li>ウェハを室温に戻します、その後、スピンコーターのチャック上にウエハを合わせます。 </li><li>ウェーハの中心に、ネガ型フォトレジストの4mLの（ウェーハの1ミリリットル/インチ直径）を分配します。 </li><li>スピナーを用いた2段階の回転周期にコートにウェハをスピン。まず、10秒間100回転/秒の加速度で500回転の広がりサイクルを適用します。その後、ウエハ上のフォトレジストの50μmのコーティングを得るために、30秒間300回転/秒2の加速度で2000回転の回転サイクルを適用します。 </li><li>ソフトメーカーの指示に従って、ホットプレート上の2つのステップでウェハを焼きます。フォトレジストの50μmのコーティングについては、6分間の65℃でのウエハプリベーク最初にして、すぐに20分間95℃でポストベークするウエハホットプレートの温度を上昇します。 </li><li>ウェハを室温まで冷却した後、ロードしますリソグラフィステージ上にウエハ。 </li><li>マスクアライナを用いてウェハ上にマスクを合わせ、ために必要な220ミリジュール/ cm 2の総UV線量を適用するために146秒間、1.5ミリワット/ cm 2の強度で（製造業者の指示に従って）UV光にウェハを公開フォトレジストの厚さ50μmの層。 </li><li>ホットプレート上の2つのステップでウェハに露光後ベークを適用します。フォトレジストの50μmのコーティングのために、1分間65℃、ウェハプリベーク、直ちに最初のポストベークすること、95℃で5分間、ホットプレートの温度をランプアップ。 </li><li> SU-8現像液にウェハを浸漬し、特徴は、ウェハ上明確になるまで、穏やかに振とうすることにより、ウェーハを開発します。厚さ50μmのフォトレジスト用〜6分間ウェハを開発します。 </li><li>その後、窒素エアガンでウェハを乾燥、イソプロパノール及びエタノールで余剰の現像を洗い流してください。 </li><li>ハード15分間、150℃のホットプレート上にシリコンウェハを焼きます。 </li><li>置きシラン化剤25μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシランでデシケーター中でウェハ。 注：シラン化剤は、腐食性のある、このようにして、適切な個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）と、酸/塩基ドラフト内で使用されるべきです。 </li><li> 5分間の真空を適用し、真空を解除せずに30分間シランの蒸気にウェハを公開します。 </li><li>適切なサイズのペトリ皿にウェハを転送します。 </li></ol>粘着テープを使用したソフトリソグラフィ用のマスター金型の2製作<ol><li> CADの描画ツールを使用して、マイクロチャネルのレイアウトを描き、白い紙に図面を印刷します。 </li><li>イソプロパノールで設計を収容した後、空気銃でスライドを乾燥するのに十分な大きスライドガラスを清掃してください。 </li><li>清浄なガラススライド上に粘着テープを取り付けます。任意の気泡をトラップに注意しないこと。 </li><li> GLAの両側をテープssはテープ側を上にして、デザインを紙の上にスライドさせます。 </li><li>参考として、紙のデザインを使用して、スライドガラス上にテープをカットした後、スライドガラスの不要な領域からテープを剥離するメスを使用してください。 </li><li>イソプロパノールでガラススライドを洗浄した後、エアガンで乾燥。 30分間65℃のオーブン中にスライドガラスを焼きます。 </li><li>穏やかに気泡を除去し、スライドを室温に冷却させるために、ゴムローラーを用いてテープの上に転がります。 </li></ol> PDMSデバイスの3ソフトリソグラフィ製作<ol><li> 10の比でPDMSエラストマーと硬化剤を混合する：1（W：W）、混合物を激しく撹拌し、その後に気泡を混合物に表示されなくなるまで真空チャンバ内に配置することによって混合物を脱気。 </li><li>すべての気泡が消えるまで、PDMSと脱ガスの〜2ミリメートルの厚さの層を得るために、ペトリ皿の中でシラン化されたシリコン型や粘着テープの金型に混合物を注ぎます。 </li><li>オーブンでPDMSを治します2時間65℃。 </li><li>離れの特徴から少なくとも5ミリメートルPDMS層をカットした後、ピンセットを用いて、金型から硬化PDMSを剥離するメスを使用してください。 </li><li>好ましくは、 図2a及び図4bに見られるように、マイクロチャネルのネットワークの端部で、任意の場所にマイクロチャネルに、1mmの生検パンチを備えた単一の入口穴を開ける。 </li><li>デバイス上に吸着ダスト粒子を除去するために、粘着テープでキャストPDMSを清掃してください。滅菌脱イオン（DI）水、続いて70％エタノール溶液ですすぐことにより、PDMSマイクロチャネルデバイス（PDMSキャスト）を滅菌し、30分間UVにさらします。 </li><li>使用するまで滅菌ペトリ皿中の滅菌PDMSデバイスを保管してください。 </li></ol> 4.基板のパターニング<ol><li>滅菌ガラスカバースリップまたはペトリ皿の上にピンセットを用いて鋳造滅菌PDMSを置き、ピンセットの先端を使用して穏やかな圧力を適用します。 注：PDMSキャストはGLと共形が、可逆的シールを作りますお尻のカバースリップまたは任意の接着剤を使用せずにマイクロチャネルを形成するペトリ皿。 </li><li>完全入口孔を覆って、入口に基質溶液の - （40μL20）の液滴を配置します。マイクロチャネルの入口に四ホウ酸ナトリウム緩衝液中のPDLの20μLの液滴を配置することにより、パターンポリ-D-リジン（PDL）。 </li><li> 10分間（生物学研究所内の真空を収容するのに相当）、および気泡の形でチャネルから出てくる空気を観察〜254 mmHgAの真空中でペトリ皿を置きます。 </li><li>真空を解除し、マイクロチャネルに流入基質溶液を観察します。 </li><li>基板密着性のための適切な条件で皿をインキュベートします。 （これらは基板に応じて変化）インキュベーション条件を表1及び表 2を参照のこと。 PDLのパターニングに、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>慎重に滅菌ピンセットを使用してPDMSスタンプをはがしし、DI水で3回カバーガラス上にパターンを洗います。 </li&gt; <li>皿またはガラス製カバースリップをカバーし、37℃で一晩インキュベートするペトリ皿に、1％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を加えます。 注：これはコーティングされていない地域での非特異的付着を軽減します。 </li><li> 1％BSA溶液を吸引除去し、パターニングされた基板を使用する準備が整いました。 </li></ol>細胞の5.間接パターニング<ol><li>無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表1に示します。 </li><li>パターン化されたペトリ皿に細胞懸濁液を添加し、完全に細胞懸濁液中のパターン領域を水没。 </li><li>細胞がパターン化された基板に付着することを可能にするために15分間インキュベーター中で37℃でペトリ皿をインキュベートします。 </li><li>ペトリ皿からの過剰の細胞懸濁液を吸引し、穏やかに付着していない細胞を除去するために10秒間振盪しながらリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でパターン形成細胞を3回洗浄します。 </li><li> Aを追加パターン化された細胞培養物にppropriate培地及びCO 2インキュベーター中37℃でパターン化細胞をインキュベートします。 </li></ol>細胞の6.ダイレクトパターニング注：この方法は、しかし、ステップ5とは異なり、この技術では、細胞を基板コーティングの有無にかかわらず、組織培養表面上にパターン化された手順5で説明した間接的な細胞パターン形成に代わるものです。 <ol><li> DI水、続いて70％エタノールの溶液で洗浄することにより、マイクロ流体デバイスを滅菌します。 </li><li> PDMSへの細胞接着を防止するために、1％BSAの溶液中で一晩デバイスを浸します。 </li><li>室温でデバイスを乾燥させ、組織培養処理ペトリ皿の底に取り付けます。 </li><li>無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表2に示します。 </li><li>満たすのに十分の細胞懸濁液 - （8μL4）、液滴を配置マイクロチャネルは、入口に完全に入口穴をカバーしています。 </li><li> 10分間真空中でペトリ皿を入れ、泡の形でチャネルから出てくる空気を観察します。真空を解除し、マイクロ流路に流入する細胞懸濁液を観察します。 </li><li> 表2に記載された（パターン化細胞のタイプに依存）インキュベーション条件に従って、細胞接着を促進するためのインキュベーターでペトリ皿をインキュベートします。 PDMSデバイスを沈めるシャーレにPBSを追加します。 </li><li>ピールPDMS慎重にピンセットでシャーレを切り、PBSでパターンを洗います。ペトリ皿に細胞培養培地を加え、インキュベーター内で細胞培養を置きます。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

従来のフォトリソグラフィは、ソフトリソグラフィ用の金型を作成するための十分に確立された技術、設備、材料、従来のフォトリソグラフィを使用するために必要なスキルですが、ほとんどの研究室に容易に入手できません。これらのリソースへのアクセスのない研究室のために、我々は、マイクロ流体デバイスのための比較的単純な機能を備えた金型を作成する方法として、粘着テープの製造を提示しています。この方法は、任意の研究室が作成し、容易に入手可能なツールと研究目的のためのマイクロ流体デバイスを利用することができます。粘着テープ法は、低コストのデスクトップビニルカッター31とを向上させることができます。デスクトップビニルカッターは、再現性、解像度、並びにレイアウトの複雑さを増加させることができます。これらのオプションは、従来のフォトリソグラフィ、デスクトップカッター、または粘着テープ製造の各異なる機能と制限や研究者を持って、慎重に十分であろう方法を検討する必要があります自分のニーズのために。 硬化したPDMSは、ジメチルシロキサンの長いポリマー鎖は、空気分子<su...

組織工学とバイオセンシングでは、ミクロンスケールのタンパク質や細胞の空間的な組織を制御する能力は、最後の四十年1、2、3の上にますます重要になってきています。タンパク質および細胞の正確な空間的な組織は、研究者は、細胞増殖を誘導すること、およびバイオセンサー4、5、6、7、8の製造のために生体分子を固定化するために、細胞の同様のまたは異なる種類を含む細胞と基板の間の相互作用を調べることを可能にしました9。 パターニングタンパク質の現在の方法は、光パターン及びマイクロコンタクト印刷が挙げられます。フォトパターンはultrに曝露されると架橋されている感光材料を利用しますバイオレット（UV）光。 （UV光の透過を防止するために、暗い領域と透明な領域からなる）、フォトマスクに向けられたUV光は、生体材料またはセル10,11の後続の結合のために使用することができる特定の領域に架橋させます。この方式は非常に正確であり、培養表面のトポグラフィーを正確に制御することができるが、それは、UV放射12によってパターニングすることができるUV感受性生体分子に限定されます。マイクロコンタクトプリント法は、特定のタンパク質13、14をパターニングする別の一般的な方法です。この方法では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプは、選択された生体分子の基質の溶液に浸漬される前に、表面改質剤の様々な治療されます。次に、それを静かにこのように培養表面上に生体分子を「スタンプ」カバーガラスまたは他の表面に押し付けられます。ホーweverは、スタンプはPDMS 15をスタンプの表面への生体分子の濡れ性と同様に転写することができる材料の種類に限定されます。 細胞の直接パターニングがより困難になり、そのような特定の細胞接着分子16、17と切り替え可能基板、ステンシルベースの方法、またはパターニングのような複雑な方法に依存していることができます。これらの方法は、原因互換性細胞接着基板の欠如、敏感な生体細胞および制約で動作するプロセスの不適合、パターニング再生の矛盾、及び手順の複雑さにパターン細胞の能力が制限されています。例えば、切替可能な基質と、カスタム基板は、&lt;、プロセス17において使用されるUV光及び熱への暴露時に劣化することなく、特定の細胞型への付着を切り替え、すべての細胞型のために設計される必要があります<html> SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 18、19、20。ステンシルベースのパターニング方法は、パターンのセルにその能力に多目的です。しかしながら、使用16、21のために適切な厚さでPDMSステンシルを製造することは困難です。 1）マイクロ流体チャネルの製造及び2に容易に）多くの異なる細胞と基質のための適性：PDMSマイクロ流体チャネルへの細胞の直接注射は、次のようないくつかの利点を持っています。しかし、注入プロセス中に気泡の捕捉の流行問題は、気泡を減少させるプラズマ洗浄、または他の方法を使用せずにPDMSの疎水性のために、それが困難一貫ガラスまたはプラスチック表面21上にパターン化された細胞を作製することができます。 この作品は、毛細管マイクロモールド22、23と膨張します小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 24、25、26およびマイクロチャネルへのタンパク質や細胞懸濁液を注入する方法を報告します。ここで使用される方法は、基板のパターン形成および特定の細胞型の両方の直接的および間接的なパターニングを示しています。この技術は、PDMSの高い疎水性を克服し、PDMS 27のガス透過性を利用して基板または細胞のいずれかの注入時の気泡の存在を排除します。本稿では、いくつかの異なる基質と細胞型と技術の使用を示しています。記事はまた、従来のフォトリソグラフィと同様に、リソースの限定された設定28、29で有用なシンプルかつ低コストの粘着テープ法を用いたソフトリソグラフィ用の金型の製造を強調しています。

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD描画ツール</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CADツール マイクロ流体デバイスのレイアウトを描くために使用</td></tr><tr><td>レーザープリンター HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>粘着テープ技術のためのマイクロ流体デバイスのレイアウトを印刷するために使用</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>PDMS混合物</td></tr><tr><td>の脱気に使用粘着スコッチテープ</td><td>3M 製品、MN</td><td>テープ 600</td><td>粘着テープの製造に使用 マスター</td></tr><tr><td>PDMS シルガード 184</td><td>ダウ コーニング、ミシガン州</td><td>1064291</td><td>鋳造ポリマー</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州</td><td>08-772-23</td><td>PDMSで鋳造する金型を保つために使用</td></tr><tr><td>ブレード付き ステンレス鋼メス (#11)</td><td>フェザーセーフティカミソリ株式会社</td>日本 <td>2976#11</td><td>PDMSをカットするために使用されます</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>テッド・ペラ、CA</td><td>5627-07</td><td>ピーリング中にキャストされたPDMSの取り扱いに使用</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、MA</td><td>12-546-2</td><td>基板をパターン化する表面として使用</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、MA</td><td>12-544-4</td><td>基板をパターン化する表面として使用</td></tr><tr><td>ラバーローラー</td><td>ディックブリックアートマテリアルズ、イリノイ</td>州<td>40104-1004</td><td>気泡を挟まずにガラスに粘着テープを貼る使用</td></tr><tr><td>レーザーマスクライター</td><td>ハイデルベルク・インスツルメンツ社(ドイツ</td>) <td>DWL66fs</td><td>フォトリソグラフィー製造工程で使用されるクォーツマスクの作製に使用</td></tr><tr><td>EVGマスクアライナー(フォトリソグラフィーUV露光ツール)</td><td>EVGグループ(ドイツ</td>)<td>EVG 620T(B)</td><td>フォトレジストを紫外線にさらすために使用</td></tr><tr><td>スピンコーター Headway</td><td>Headway Research Inc.(テキサス州</td><td>)PWM32-PS-CB15PL</td><td>シリコンウェーハにフォトレジストをスピンコーティングするために使用されます</td></tr><tr><td>フォトレジスト SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>金型製造に使用されるネガフォトレジスト</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>フォトレジスト開発者</td></tr><tr><td>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシラン</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>PDMSの付着を避けるために金型をコーティング</td></tr>します<tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>洗浄溶剤</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>滅菌溶剤</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩 (PDL)</td> <td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL 溶液は、四ホウ酸ナトリウムバッファー</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td> <td>で 0.1 mg/mL で調製されますLamininは10&microに分注されました。Lアリコートと20&microに希釈。g/&micro;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州</td><td>BP1605100</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>C2C12筋芽細胞llineATCC</td><td>、VA、</td><td>CRL-1722</td><td>C2C12パターニング</td></tr><tr><td>PC12細胞株</td><td>ATCC、VA</td><td>CRL-1721</td><td>PC12パターニングのデモンストレーションに使用</td></tr><tr><td>コラーゲン1型、ラットテール</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>馬血清, 熱不活化</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ファロイジン-テトラメチルローダミン B イソチオシアネート (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>細胞を標識するには</td></tr><tr><td>Calcein-AM 生死細胞 アッセイキット</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>細胞生存率アッセイ</td></tr><tr><td>生検 穴パンチ</td><td>テッド・ペラ,CA</td><td>15110-10</td><td>PDMS のパンチ穴</td></tr></tbody></table>

パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

基板および細胞のパターニング技術は、細胞と細胞、および細胞と基板の相互作用を研究するために細胞生物学で広く使用されています。従来のパターニング技術は、単純な形状、小さな領域、および選択された生体材料でのみうまく機能します。この記事では、負圧を使用して、細胞懸濁液と基質溶液を複雑で長い閉(行き止まり)ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルに分配する方法について説明します。この方法により、研究者はフィブロネクチン、コラーゲン、抗体(Sal-1)、ポリ-D-リジン(PDL)、ラミニンなどの複数の基質をパターン化できます。基質のパターニングにより、さまざまな細胞を間接的にパターニングすることができます。C2C12筋芽細胞、PC12神経細胞株、胚ラット皮質ニューロン、両生類の網膜ニューロンを試験しました。さらに、この手法は、細胞懸濁液に低真空を短時間適用することにより、マイクロ流体チャネル内の線維芽細胞を直接パターン化できることを示しています。低真空は、細胞生存率アッセイで示されているように、細胞生存率を有意に低下させません。この分析法をさまざまな細胞型および基質型に適用するための修飾について説明します。この技術により、研究者はエキゾチックな材料や機器を必要とせずに、細胞やタンパク質を特定パターンでパターン化することができ、真空状態のどの研究室でも行うことができます。

この方法は、タンパク質およびマスターモールドが行われた後、ほぼすべての生物学研究室では10μmと利用可能な機器と小さい寸法のデッドエンドマイクロ流体チャネルを用いた細胞の間接的なパターニングのパターニングを可能にします。この技術は、伝統的なソフトフォトリソグラフィ、または粘着テープの製造（ 図1）28、29で作成されたPDMSマイクロ流体チャネルとを使用して作成されたPDMSマイクロ流体チャネルと共に利用することができます。我々は以前30、光受容体4における軸索ガイダンスの評価のための神経細胞の間接的なパターニングで、この手順を使用することを実証している今、様々な起源のいくつかの追加の細胞型においてその使用を実証しました。ポリ-D-リジン（PDL）上にパターン化胚性ラット皮質ニューロンとラミニンの表面は、一...

このレポートは、低圧真空を使用して、生物学的研究のための細胞と基質でマイクロ流体チャネルを充填するためのシンプルで実行しやすい技術について説明しています。

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

この手順の全体的な目的は、ほとんどの生物学研究室で利用可能な簡便なベンチトップツールを用いて、細胞または基質を複雑な長い閉鎖マイクロチャネルに分配し、パターン化することです。この手法は、細胞間相互作用および細胞とタンパク質の相互作用に関する生物学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、操作が簡単であり、ほとんどの生物学研究室で容易に入手可能なツールのみで実施できる点にあります。一般的に、この手法に慣れていない方は、研究者が選択した細胞や基質に応じたインキュベーション条件の最適化が必要となるため、苦労することがあります。PDMSスタンプと溶液を適切に配置することで実験の再現性が大幅に向上するため、この手法を視覚的に提示することが不可欠です。まず、CAD描画ツールを用いてマイクロチャネルのレイアウトを作成することから始めてください。次に、図面を白い紙に印刷します。続いて、デザインを収容するのに十分な大きさのガラススライドをイソプロパノールで洗浄します。その後、エアガンでスライドを乾燥させます。洗浄済みのガラススライドに、気泡が入らないように注意しながら粘着テープを貼り付けます。次に、テープ面を上に向けた状態で、ガラススライドの側面をデザインが描かれた紙にテープで固定します。紙のデザインを基準にして、メスでガラススライド上のテープを切り出します。カットした後、ガラススライドの不要な部分からテープを剥がします。次に、残った接着剤を取り除くため、ガラススライドをイソプロパノールで洗浄します。その後、エアガンを使用して表面を乾燥させます。パターニングと洗浄後、ガラススライドをオーブンで65 °Cで30分間加熱します。次に、ゴムローラーでテープの上を軽く転がして気泡を取り除き、ペトリ皿の中でスライドを室温まで冷却させます。まず、PDMSエラストマー10部に対して硬化剤1部の割合で混合し、混合物を激しく攪拌します。次に、混合物を真空チャンバーに入れ、気泡がなくなるまで脱気します。混合物を粘着テープの型の上に厚さ2mmの層になるように注ぎ、すべての気泡が消えるまで型を脱気します。冷却後、メスを使用して、構造物から少なくとも5mm離れた位置でPDMS層を切り出します。次に、ピンセットを使用して、硬化したPDMSをモールドから剥がします。1 mmのバイオプシーパンチを用いて、好ましくはマイクロチャネルネットワークの末端に、単一の入口穴を開けます。その後、粘着テープでPDMSキャストを洗浄し、デバイスから塵埃粒子を除去します。PDMSマイクロチャネルデバイスを70%エタノール溶液で洗浄し、続いて滅菌脱イオン水で洗浄して滅菌させ、さらにUVライトに30分間曝露します。ピンセットを使用して滅菌済みPDMSキャストを滅菌済みのガラスカバースリップ上に配置し、ピンセットの先で軽く圧力をかけます。次に、マイクロチャネルの入口にテトラホウ酸ナトリウム緩衝液中のポリ-D-リシンの一滴を滴下します。ペトリ皿を10分間真空状態にします。この間、気泡となってチャネルから空気が抜けていくことを確認します。真空を解除し、基質溶液がマイクロチャネル内に流入する様子を確認します。その後、ペトリ皿を37°Cで1時間インキュベートします。次に、滅菌ピンセットを用いてPDMSスタンプを慎重に剥がし、パターンを脱イオン水で3回洗浄します。非特異的吸着を抑制するため、ガラスカバースリップに1% BSA溶液を添加し、サンプルを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、BSA溶液を吸引して除去します。細胞の間接的なパターニングを開始するために、付属のテキストプロトコルに従い、無血清培養液で細胞懸濁液を調製します。パターニングされたペトリ皿に細胞懸濁液を加え、パターニング領域が完全に細胞懸濁液に浸るようにします。その後、細胞をパターニング基板に接着させるため、ペトリ皿をインキュベーター内で37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、ペトリ皿から過剰な細胞懸濁液を吸引し、パターン形成した細胞をPBSで3回洗浄します。その際、未接着細胞を除去するために10秒間静かに振とうしてください。次に、パターン形成した細胞の培養液に適切な培養基を加え、二酸化炭素緩衝インキュベーター内で37 °Cでインキュベートします。細胞のダイレクトパターニングを行う場合は、まず70%エタノール溶液でマイクロ流体デバイスをすすぎ、続いて脱イオン水で洗浄して滅菌します。次に、PDMSへの細胞の非特異的な接着を防ぐため、デバイスを1% BSA溶液に一晩浸します。デバイスを室温で乾燥させた後、組織培養処理済みのペトリ皿の底面に固定します。マイクロチャネルを満たすのに十分な量である4〜8 µLの細胞懸濁液を、注入口に穴を完全に覆うように滴下します。次に、ペトリ皿を真空チャンバーに10分間入れます。真空を解除し、細胞懸濁液がマイクロチャネルに流れ込む様子を観察します。ペトリ皿を二酸化炭素バッファー完備のインキュベーターにて、37 °Cで最大1時間インキュベートします。次に、ディッシュをインキュベーターから取り出し、ピンセットを用いてPDMSをディッシュから慎重に剥がします。パターンをPBSで洗浄し、ペトリディッシュに細胞培養培地を加えます。完了後、細胞をインキュベーターに戻します。ここでは、ポリ-D-リシンおよびラミニン表面でパターニングされたラット胚性皮質ニューロンを示しています。細胞の配置から、パターニング領域への一般的な接着と、PDLおよびラミニンストライプに沿った成長が確認できます。ここでは、より高倍率でC2C12筋芽細胞を示しています。この細胞型もパターン形成された領域に接着し、多核筋管への融合を示します。この手法は、ここでは線維芽細胞を用いて示されているように、直接的な細胞パターニングにも適応されています。この直接細胞パターニング法は、細胞の生存に悪影響を及ぼしません。この手順に従った後、タンパク質の局在や細胞と基質の相互作用に関するさらなる疑問を解決するために、蛍光顕微鏡観察などの他の手法を実施することができます。本手順を試みる際は、インレイ全体を覆うように細胞液または基質溶液を適切に滴下することが、成功の鍵となる重要な点であることを忘れないでください。この手法の開発により、神経科学分野の研究者が網膜生物学における光受容体軸索の誘導について探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、負圧を用いたガス透過性PDMSマイクロ流体デバイスを用いて、細胞と基質をパターニングする方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、基板上に所望の位置にセルを配置するための簡単​​な方法を示しています。このメソッドは、パターン基板上への細胞で満たされたマイクロウェルを含有するシリコーンチップを反転して細胞を。このメソッドは、セル間の拡散性とjuxtacrineシグナリングを変調する新しい方法を提供します。...

バイオフリップチップを用いた胚性幹細胞のパターニング

マイクロコンタクトプリンティングは、材料の表面にパターンの蛋白質と他の分子に広く使用されています。我々は、ガラス上にフィブロネクチンのパターンをスタンプする、このプロセスの基本的な手順を示します。...

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。...

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

このプロトコルは、SiO 2のセルパターニングのための微細加工と互換性のある方法を記載している。事前に定義されたパリレン-Cの設計は、フォトリソグラフィによってSiO 2のウェハ上に印刷されています。血清（または他の活性化溶液）とのインキュベーション後の細胞を特異的に接着し（との適合性に応じて成長する）はSiO 2領域によって撃退されながら、基礎となるパリレン-C、。...

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

ここで提示する方法は、マイクロパターニングと定量イメージングを使用して、哺乳類培養における空間的組織を明らかにする。この技術は、標準的な細胞生物学研究室で確立することが容易であり、インビトロでのパターニングを研究するための扱いやすいシステムを提供しています。...

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

私たちの全体的な目的は、細胞が指示された軸方向の成長につながる細胞外の手がかりを感知する方法を理解することです。ここでは、軸ゾンの成長と経路検査を支配する特定の事象を研究するために、細胞外マトリックス成分の定義されたマイクロパターンを生成するために使用されるタンパク質の光誘導分子吸着の方法論について説明する。...

細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞応答を研究するためのマイクロパターニングのためのPRIMOシステムを用いてタンパク質の光誘導分子吸着

ここでは、DNAプログラム付着を用いた単細胞分解能でマイクロパターン細胞に対するプロトコルを提示する。このプロトコルは、ベンチトップフォトリソグラフィプラットフォームを使用して、ガラススライド上にDNAオリゴヌクレオチドのパターンを作成し、市販の相補オリゴヌクレオチドを有する細胞膜にラベルを付けます。オリゴのハイブリダイゼーションは、プログラムされた細胞接着をもたらす。...

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。...

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。...

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

学ぶマイクロ流体チャネルへの細胞・基質パターニング法。低圧真空を用いて複雑な微細構造に充填し、細胞間・細胞タンパク質相互作用の研究に活用可能です。再現性の高い実験手法を習得できます。

パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法

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