共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

この実験の全体的な目標は、哺乳類細胞で発現したGPCR融合タンパク質の細胞内局在と内在化を検出するための効率的で容易に解釈可能な方法を提供することです。この方法は、受容体の内在化やリサイクルなど、細胞内タンパク質の局在化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、簡単かつ効率的に使用できることです。

したがって、この方法はGPCRの監視と位置特定に関する洞察を提供します。また、細胞質や核タンパク質などの他のシステムにも適用できます。テキストプロトコルに従ってHEK293細胞を回収し、継代した後、細胞がほぼ合流点まで成長したら、平衡化した増殖培地を廃棄し、2ミリリットルのPBSを加え、皿を渦巻いて細胞を洗浄します。

PBSを捨て、1ミリリットルのトリプシンEDTAを追加します。.細胞を完全に消化するには、皿を慎重に回転させ、溶液を吸引します。次に、この摂氏37度のウォータージャケット付きC02インキュベーターに皿を3分間入れます。

細胞をインキュベートしている間に、各ウェルに2ミリリットルの平衡化増殖培地を加えて、6ウェルプレートを調製します。次に、細胞が皿の底から浮き上がったら、平衡化した増殖培地1ミリリットルを皿に加えます。ピペッティングで混合し、直ちに0.1ミリリットルの細胞懸濁液を調製した6ウェルプレートの各ウェルに移します。

懸濁液をウェル内で静かにピペットで動かし、細胞を摂氏37度、CO2 5%でインキュベートします。翌日、セルが85〜95%コンフルエントであることを確認します。次に、2本の滅菌マイクロ遠心チューブに、3マイクログラムのプラスミドDNAと100マイクロリットルの還元血清培地を1本のチューブに加えます。

その間に、試薬1の9マイクロリットルと還元血清培地の100マイクロリットルを別のチューブに追加します。チューブを室温で5分間インキュベートします。希釈したプラスミド混合物を希釈した試薬と組み合わせます。

次に、溶液を穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。細胞の培地を吸引し、FBSを含まない1.5ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。次に、各ウェルに215マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬混合物を滴下し、プレートを渦巻かせて穏やかに混合します。

プレートを摂氏37度、CO25%で4〜8時間インキュベートします。次に、培地を10%FBSの新しいDMEMと交換します。実験を実行する前に、細胞をさらに24〜48時間インキュベー

トランスフェクション効率は、細胞株によって大きく異なります。したがって、堆積におけるシットとスタブの最適化は、使用する特定の細胞タイプによっては必要になる場合があります。増殖培地を6ウェル培養プレートから取り出します。

次に、1ミリリットルのPBSを使用して細胞単層を洗浄します。0.5ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、皿を渦巻き、溶液を吸引します。次に、培養プレートを摂氏37度で3分間インキュベートします。

インキュベーション中に、直径15mmの滅菌カバースリップを12ウェルプレートの各ウェルに挿入します。細胞を少量の新鮮完全増殖培地に再懸濁し、必要な数の細胞をカバースリップ付きの12ウェルプレートに移します。その後、細胞を16〜24時間インキュベー

インキュベーションの16〜24時間後、細胞がほぼ合流点まで成長したら、メンブレンプローブディルの5マイクロモルを各ウェルに加え、細胞をインキュベーターに30分間戻します。平衡化した増殖培地を取り出し、冷たいPBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、各ウェルに1ミリリットルの4%PFAを加え、細胞を15分間攪拌して細胞を固定します。

PBSでは、固定細胞を2回洗浄し、各ウェルに200〜300マイクロリットルのDAPIを加え、プレートを室温で10分間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄した後、プレートからカバースリップを慎重に取り除き、余分なバッファーを吸い取ります。カバースリップを、1滴の封入剤を充填した顕微鏡スライドに反転させます。

次に、スライドから余分な封入剤を取り除きます。ほぼコンフルエントまで増殖した細胞を使用して、平衡化した増殖培地を取り出し、新たに加温したDMEMを添加します。細胞を1時間インキュベートします。

異なる濃度のリガンドで細胞を30分間処理します。そして、ここに示されているさまざまな時間、細胞を10から負の6モルリガンドで処理します。冷たくしたPBSを使用して細胞を2回洗浄し、各ウェルにPBS中の4%PFAを1ミリリットル加えてから、細胞を15分間穏やかに撹拌します。

細胞をPBSで2回洗浄した後、プレートのウェルからカバースリップを慎重に取り外し、このビデオで前述したようにマウントします。共焦点顕微鏡検査を行うには、水銀ランプ電源、PC顕微鏡、スキャナー、レーザーなど、共焦点顕微鏡のハードウェアをオンにします。ソフトウェアを起動し、構成を確認してレーザーを選択します。

指示に従って、共焦点顕微鏡システムのさまざまなユニットの電源を入れます。準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、ステージコントローラーを使用してサンプルを対物レンズ上に配置します。油浸レンズの場合は、カバーガラスに杉油を1滴加え、カバーガラスをレンズに向けてスライドを向けます。

蛍光下で目的の細胞を見つけ、スキャンモードに切り替えて、蛍光蛍光色素のレーザー出力とスペクトル範囲を選択します。レーザー強度やその他のパラメータを調整することにより、高品質の画像をキャプチャします。この図は、HEK293細胞におけるpEGFP-N1の発現を示しています。

GFPシグナルは細胞質と核で検出されました。ここでは、S-Japonica(SjGnRHR)由来のゴナドトロピン放出ホルモン受容体のHEK293細胞における細胞内局在を示しています。EGFP受容体は緑色で、細胞膜を強調するDil染色は赤色です。

受容体は原形質膜に局在しているのが見られます。SjGnRHRの内在化を視覚化するために、細胞を異なる濃度のゴナドトロピン放出ホルモンで処理しました。ここで見られるように、受容体の内在化は用量依存的に進行し、受容体は細胞表面から10からマイナス6モルのリガンドで完全に内在化されました。

10からマイナス6モルのリガンドで異なる期間処理した場合、アゴニストシミュレーションの10分後には内在化したSjGnRHRが検出され、60分後には極端な内在化が起こりました。HEK293細胞で示されたように、両実験において、蛍光SjGnRHR EGFP融合タンパク質は主に細胞膜に局在し、細胞内に劇的かつ迅速に内在化した。この手順を試みる際には、細菌、真菌、マイコプラズマに汚染されていない細胞を適切な状態に保つことを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、細胞のチェックや固定化などの方法を実行して、タンパク質受容体のパスVの2番目のような追加の質問に答えることができます。開発のたびに、この技術は、細胞生物学および生化学の分野の研究者が、さまざまな細胞株における膜貫通型受容体の局在化と内在化を探求する道を開きました。