Name: 共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ共焦点顕微鏡を用いたGPCR内在化検出法。HEK293細胞でリガンド活性化受容体の動態を可視化し、細胞内シグナル伝達と受容体リサイクルのメカニズム解明に貢献します。

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この論文の著者は、技術支援と機器の使用についてJiayan Xie教授に感謝したいと思います。この研究は、中国国家自然科学基金会(41406137)の財政的支援を受けました。

1.細胞の調製<ol><li> 細胞の回収 <ol><li> 37℃の水浴に液体窒素タンクから凍結保存ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞を移し、1連続振盪 - 2分。 </li><li> 10cmの細胞培養皿に平衡成長培地10ml（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液）を加えます。静かに平衡化した増殖培地に解凍された細胞を追加します。 </li><li> 4時間- 2、95％空気および5％CO 2を含有する加湿雰囲気で37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 </li><li> 2後 - 4時間、細胞が付着していることを確認してください。 48時間 - 別の24のための平衡化増殖培地及び培養を置き換えます。 注：ジメチルスルホキシド（DMSO）を除去し、細胞損傷から保護するために平衡化し、増殖培地を変更しても有用です。 </li></ol></li><li> &lt;強い&gt;セル通路<ol><li> 24後 - 細胞がほぼコンフルエントまで増殖させた場合、48時間、平衡化した増殖培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の2mLで細胞を洗浄します。優しく料理を旋回。 </li><li> PBSを捨て、トリプシン-EDTA（生理食塩水、0.25％トリプシンおよび0.02％EDTA）を1ml加えます。細胞を完全に消化するために、皿を慎重に旋回し、トリプシン-EDTA溶液をオフに吸引します。 3分間37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター内で皿を置きます。 注：この期間中、3新しい10-cmの細胞培養皿を用意し、それぞれに平衡化増殖培地の10 mLを加え。 </li><li>細胞は、皿の底から持ち上げられている場合は光学顕微鏡を用いて、決定します。皿に平衡化した増殖培地の2ミリリットルを追加します。ピペッティングにより混合し、直ちに新しい皿の各細胞懸濁液の0.6mLのをピペット。穏やかにピペッティングすることによって混合し、細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートすることを可能にします。 </li></ol></lI&gt; </ol> 2.細胞播種<ol><li> 24後 - 継代細胞がほぼコンフルエントまで増殖させた48時間、平衡化した増殖培地を廃棄し、2mlのPBSで細胞を洗浄します。優しく料理を旋回。 </li><li> PBSを捨て、トリプシン-EDTAを1mLを加えます。細胞を完全に消化するために、皿を慎重に旋回し、トリプシン-EDTAをオフ吸引。 3分間37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター内で皿を置きます。 注：この期間中に、各ウェルに平衡化した増殖培地2mlを添加することにより、6ウェルプレートを準備します。 </li><li> 、顕微鏡観察下で、細胞をディッシュ底部から持ち上げられたとすれば、皿に平衡化増殖培地1mlを加えます。ピペッティングにより混合し、直ちに調製6ウェルプレート（平衡化増殖培地2mLで細胞レス6ウェルプレート）の各ウェルに細胞懸濁液0.1ml（体積は細胞増殖密度に応じて調整されている）をピペット。静かにピペッティングにより混合した細胞を許可します37℃でインキュベートし、5％CO 2です。 </li></ol> 3.細胞トランスフェクション<ol><li> リポソーム配合物のトランスフェクション方法1、 注：トランスフェクション試薬1 のための材料の表をご参照ください。 <ol><li>翌日、細胞が85であることを確認してください - 95％コンフルエント。 </li><li>滅菌マイクロチューブにプラスミドDNA（500 ng /μLで）および還元血清培地100μLの3μgのを追加し、穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。 </li><li>別のマイクロチューブに試薬1の9μLと減少した血清培地の100μLを用意し、穏やかに混合。室温で5分間インキュベートします。 </li><li>希釈試薬1（総容積= 215μL）で希釈し、プラスミド混合物を組み合わせます。穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。 </li><li>吸引細胞培養プレートから培地、およびFBSを含まない1.5mLの新鮮なDMEMを加えます。 </li><li> DNA-TRANSFの215μLを追加ection試薬を各ウェルに滴下して混合し、プレートを回転させることによって穏やかに混合します。 </li><li> 8時間- 4 37℃でインキュベートし、5％CO 2。 10％FBSを含む新鮮なDMEMと交換してください。 </li><li>任意の実験を実行する前に、48時間-別の24 CO 2、37℃で、5％の細胞をインキュベートします。 </li></ol></li><li> リポソーム配合物のトランスフェクション法2、 注：トランスフェクション試薬2 のための材料の表をご参照ください。 <ol><li>滅菌マイクロチューブにプラスミドDNA2μgの（500 ng /μLで）、試薬2の4μL、100μLを低減血清培地を加えます。穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>滴下様式で細胞にトランスフェクション混合物を加えます。 </li><li>任意の実験を実行する前に、37℃で48時間、5％CO 2 -トランスフェクション後、24細胞をインキュベートします。 </li></ol></li></ol>カバースリップ4.細胞培養<ol><li>再培養6ウェルプレートからの増殖培地を移動させます。 </li><li>カルシウムとマグネシウムを含まないPBS 1mlで細胞単層を洗浄します。 </li><li> 0.5 mLのトリプシン-EDTAを加えます。慎重に料理を旋回し、トリプシンEDTAを吸引します。 37℃で3分間、5％CO 2培養プレートをインキュベートします。実際のインキュベーション時間は、使用される細胞株によって変化します。 注：この期間中、新たな12ウェルプレートを調製し、各ウェルに直径15mmの滅菌カバースリップを追加します。リジン、ラミニン、またはコラーゲンで被覆したカバースリップを容易に取り外すHEK293細胞のための細胞接着を改善することができます。 </li><li>細胞が剥離した場合には、各ウェルに1mLの予め温めた完全増殖培地を加えます。ピペッティングにより混合し、直ちにカバースリップで12ウェルプレートに細胞の必要な数を転送します。 1 mLの総ボリュームを調整するために、各ウェルに新鮮な完全増殖培地を追加</li><li> 37℃で24時間、5％CO 2から 16のための細胞をインキュベートします。 注：30の後に -60分間、細胞の大部分は、滅菌カバースリップに付着しているであろう。 </li></ol> 5.共焦点顕微鏡検出<ol><li> 細胞局在 <ol><li> 16後 - 細胞を12ウェルプレート中の滅菌カバースリップ上でほぼコンフルエントまで増殖させた24時間、5μMの最終濃度を与え、各ウェルに、膜プローブのDiIを加えます。細胞を37℃、5％CO 2で30分間インキュベートすることを可能にします。 </li><li> 30分後、平衡化した増殖培地を除去し、冷PBSで2回細胞を洗浄（2 - 8°C）。 </li><li>各ウェルに（PBS中の）4％パラホルムアルデヒド溶液1mLを添加することによって細胞を固定。ゆっくり15分間攪拌します。 注意：パラホルムアルデヒドは皮膚接触や吸入によって適度に有毒である、と考えられる人間の発癌物質として指定されました。化学物質は、パラホルムアルデヒドの計量及び取り扱い中に使用されるべきであるフード、通気バランスエンクロージャまたは他の保護対策をヒューム。&lt;/ LI&gt; <li> PBSで2回固定した細胞を洗浄します。各ウェルに200〜300 DAPIのμL（4&#39; 、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）溶液（0.5μgの/ ml）を添加し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄します。注意深くプレートからカバースリップを除去し、過剰のPBSをオフ芯。マウンティング培地（50％（v / v）のグリセロール/水）の一滴を装填した顕微鏡スライド上に反転します。スライドから余分なマウンティング培地を除去。 </li></ol></li><li> 細胞内在 <ol><li> 16後 - 細胞を12ウェルプレート中の滅菌カバースリップ上でほぼコンフルエントまで増殖させた24時間、平衡化した増殖培地を除去し、新鮮な追加、DMEM培地（37℃）に温めました。 37℃で1時間、5％CO 2のための細胞をインキュベートします。 </li><li> 、30分間、リガンドの異なる濃度の細胞（0、10 -12、10 -9、および10 -6 M）で処理し、異なる時間、10 -6 Mのリガンドとそれらを扱う（010、30、および60分）。 </li><li> （ - 8℃2）冷PBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに（PBS中の）4％パラホルムアルデヒド溶液1mLを添加することによって細胞を固定。ゆっくり15分間攪拌します。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄します。注意深くプレートからカバースリップを除去し、過剰のPBSをオフ芯。マウンティング培地（50％（v / v）のグリセロール/水）の一滴を装填した顕微鏡スライド上に反転します。スライドから余分なマウンティング培地を除去。 </li></ol></li><li> 共焦点顕微鏡 <ol><li>水銀ランプ電力、PC顕微鏡、スキャナー、及びレーザを含む、共焦点顕微鏡のハードウェアの電源をオン。 、ソフトウェアを起動し、オペレーティングシステムアカウントにログイン設定をチェックし、レーザーを選択します。指示に従って順番に共焦点顕微鏡システムの異なるユニットをオンにします。 </li><li>顕微鏡ステージ上に調製されたスライドを配置します。ステージコントローラを用いて対物レンズの上にサンプルを置き。杉の油の一滴に追加油浸レンズが選択されたときにカバースリップします。レンズに直面してスライドにカバースリップを置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡下で目的の細胞を探します。 </li><li>スキャンモードに切り替えます。レーザパワーと発光蛍光体のスペクトル範囲を選択してください。レーザー強度と他のパラメータを調整することにより、高品質の共焦点画像をキャプチャします。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで提示されたプロトコルは、HEK293細胞で発現GPCR融合タンパク質の細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。技術は容易にそのようなHEK293及びBMNセル16におけるカイコからcorazonin受容体の細胞局在及び内在化用として、多数の異なる遺伝子および細胞タイプに適合させることができます。 この強力なアッセイの成功のアプリケーションは、いくつかの重要な要因に依存しています。何よりも効率的なトランスフェクションとデータ品質のために不可欠である、細胞の健康です。トランスフェクションインキュベーション時間、トランスフェクションおよび他の実験との間の間隔、及びイメージング前スリップをカバーするためにトランスフェクトされた細胞の継代は、培養細胞への損傷が可能であるすべてのステップです。したがって、細胞の健康を維持することが、この実験ではすべてのステップのための重要な前提条件であります。また、密集培養できつく圧縮された細胞を回避することは共焦点顕微鏡を用いて高品質の画像を取得...

細胞は、情報、エネルギー、及び他の目的の1、2についての細胞内タンパク質、細胞外物質、例えばリガンド、微生物、栄養素、および膜貫通などを輸送する貨物輸送の機構を有します。それは、細胞の恒常性、組織機能、および全体的な細胞の生存に重要です。蛍光融合タンパク質の細胞ベースの発現は、経路3シグナリングに、そのようなGタンパク質共役受容体（GPCR）のような膜貫通受容体の局在化および内在化を研究するための強力な方法です。 直接蛍光検出技術と組み合わせクラゲオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けされた融合タンパク質の発現は、タンパク質-ターゲティング研究4、5、6で広く受け入れられています。 GFPベースdetecti固定アーティファクト7を回避しながら、生細胞のリアルタイムイメージングを可能にするという利点を有します。汎用性のクローニングベクター一連の種々の細胞8,9にGFPにタンパク質融合物の発現を促進するように構成されています。 pEGFP-N1ベクターは、哺乳動物細胞におけるより明るい蛍光およびより高い発現のために、野生型GFPから最適化された増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードして広く使用され、市販されているプラ​​スミドベクターです。 EGFPの蛍光シグナルは、哺乳動物細胞において発現を観察するために、蛍光顕微鏡は、好ましくは、共焦点顕微鏡では、488 nmでの励起および507 nmでの発光を用いて行われるべきです。 受容体の細胞内局在、およびリガンド媒介性内在化を監視することのGPCR 10のシグナル伝達および機能を調査する一般的な技術であります</s11、&gt;アップ。ほとんどの場合、内在化は、GPCRの脱感作（アゴニストの存在にもかかわらず、刺激応答の減衰）12、13を導きます。内在化受容体は、リソソームおよび劣化に組み込むことができ、またはそれらは、受容体との実験で使用した細胞株の性質に応じて、細胞表面に再循環させることができます。 ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（GnRHRs）はGPCRファミリーに属し、細胞外アミノ末端を有する典型的なGPCRタンパク質構造、細胞内-COOH端子、7つの膜貫通（TM）14ドメインを有します。 （SepiellaジャポニカからGnRHR遺伝子を有する）組換えプラスミドのSJ GnRHR-EGFPのトランスフェクションおよび（HEK293細胞に発現）EGFPタグのSJ GnRHRの共焦点顕微鏡検出をpreviouを報告しました。SLY、そしてGFP蛍光は、膜貫通タンパク質の局在化アッセイ15のためのレポーターとして設立されました。今、S.ジャポニカゴナドトロピン放出ホルモン（SjとのGnRH）によって活性化さSjの GnRHRの内部移行は、共焦点顕微鏡によって時間および用量依存的様式で実証されました。

<table><tbody><tr><td>HEK293細胞株&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/高グルコース</td><td>ハイクロン</td><td>SH30022.01</td><td>高グルコース 4.0 mM L-グルタミン ウ</td></tr><tr><td>シ胎児血清 (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>ゲノム</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ゲノム</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン & 0.02% EDTA</td><td>ゲノム</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>試薬 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA トランスフェクション試薬</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>試薬 2</td></tr><tr><td>DAPI 染色液</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>褪色防止封入剤</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 細胞培養</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 インキュベーター</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)は、高コントラストイメージングのための光学イメージング技術です。これは、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光融合タンパク質を可視化し、その発現、局在、機能を決定するための強力なアプローチです。標的タンパク質の細胞内局在は、同定、特性評価、および機能解析にとって重要です。インターナリゼーションは、刺激に対する適切な細胞応答を確保するために、Gタンパク質共役受容体(GPCR)シグナル伝達を制御する主要なメカニズムの1つです。ここでは、HEK293細胞におけるGPCRの細胞内局在と内在化を共焦点顕微鏡で検出する実験方法について説明します。さらに、この実験では、細胞培養とトランスフェクションについていくつかの詳細が得られます。このプロトコールは、広く入手可能なさまざまな蛍光マーカーと互換性があり、大多数のタンパク質の細胞内局在の可視化、およびGPCRの内在化の可視化に適用できます。この技術により、研究者は哺乳類細胞株におけるGPCR遺伝子発現を効率的に操作できるようになり、GPCRの細胞内局在とインターナリゼーションに関する研究が促進されるはずです。

図1は、共焦点顕微鏡システムの一例を示しています。 図2は、HEK293細胞内のpEGFP-N1の発現を示しています。 GFPシグナルは、細胞質および核において検出されました。 図3は、我々の以前に公表された結果15と一致し、HEK293細胞におけるS.ジャポニカからGnRHRの細胞内局在を示します。場合CLSM下Sjに GnRHR（Sjに GnRHR-EGFP）のC末端にEGFPタグを有する融合タンパク質は、この実験では緑色に見えました。 DAPIで染色した核が青色で明らかになりました。 DiI染色は赤で、細胞膜を強調しました。マージされた画像中の細胞表面上の黄色信号Sjの GnRHRの原形質膜局在を示す、赤と緑の一致を示しました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

このプロトコルは、哺乳動物細胞におけるGタンパク質共役受容体（GPCR）内在化の共焦点顕微鏡検出を記載します。これは、基本的な細胞培養、トランスフェクション、および共焦点顕微鏡手順を含み、融合発現GPCRの細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

この実験の全般的な目的は、哺乳類細胞において発現したGPCR融合タンパク質の細胞内局在および内部移行を検出するための、効率的で解釈が容易な手法を提供することです。本手法は、受容体の内部移行やリサイクリングなど、細胞内タンパク質局在分野における重要な課題の解明に寄与します。この技術の主な利点は、簡便かつ効率的に利用できることです。したがって、この手法はGPCRのモニタリングおよび局在解析に有用な知見を提供することができます。また、細胞質タンパク質や核タンパク質など、他のシステムにも適用可能です。テキストのプロトコルに従ってHEK293細胞を回収し、継代した後、細胞がほぼコンフルエントに達したら、平衡化した増殖培地を除去し、2 mLのPBSを加えてディッシュを回転させ、細胞を洗浄します。PBSを除去し、trypsin EDTAを1 mL添加します。細胞を完全に消化させるため、ディッシュを注意深く回転させ、溶液を吸引します。その後、ディッシュを37 °Cのウォータージャケット付きCO2インキュベーターに3分間入れます。細胞をインキュベートしている間に、6ウェルプレートの各ウェルに平衡化した増殖培地を 2 mL ずつ加えて準備します。その後、細胞がディッシュの底から剥離したら、ディッシュに平衡化した増殖培地を 1 mL 加えます。ピぺッティングで混合し、直ちに細胞懸濁液 0.1 mL を準備した6ウェルプレートの各ウェルに分注します。懸濁液をウェルに静かに分注し、37°C、5% CO2条件下で細胞をインキュベートする。翌日、細胞のコンフルエンシーが85-95%であることを確認する。次に、2本の滅菌マイクロ遠心チューブを用意し、そのうちの1本に3 µgのプラスミドDNAと100 µLの低血清培地を加える。その間に、別のチューブに試薬1を9 µLと還元血清培地を100 µL加えます。チューブを室温で5分間インキュベートします。希釈したプラスミド混合液と希釈した試薬1を合わせます。次に、溶液を穏やかに混ぜ、室温で20分間インキュベートします。細胞の培地を吸引し、FBS不含の新鮮なDMEMを1.5 milliliters添加します。その後、各ウェルにDNAトランスフェクション試薬混合液を215 microlitersずつ滴下し、プレートを回転させて穏やかに混ぜ合わせます。プレートを37°C、5% CO2条件下で4〜8時間インキュベートします。その後、培地を10% FBS含有の新鮮なDMEMに交換します。実験を行う前に、細胞をさらに24〜48時間インキュベートしてください。トランスフェクション効率は細胞株によって大きく異なる場合があります。そのため、使用する特定の細胞型に応じて、「sit and stab」法による導入の最適化が必要になる場合があります。6ウェル培養プレートから増殖培地を除去します。次に、1 mLのPBSを用いて細胞単層を洗浄します。0.5 mLのtrypsin EDTAを加え、ディッシュを回転させて混ぜた後、溶液を吸引して取り除きます。その後、培養プレートを37 °Cで3分間インキュベートします。インキュベーション中に、直径15 mmの滅菌済みカバーガラスを12ウェルプレートの各ウェルに挿入します。細胞を少量の新鮮な完全増殖培地で再懸濁し、必要な細胞数をカバーガラスが入った12ウェルプレートに播種します。その後、細胞を16〜24時間インキュベートします。16〜24時間インキュベーションし、細胞がほぼコンフルエントに到達した後、各ウェルに5 µMの膜プローブDiIを添加し、細胞をインキュベーターに戻して30分間置きます。平衡化した培地を除去し、冷PBSを用いて細胞を2回洗浄します。その後、各ウェルに1 mLの4% PFAを加え、細胞を15分間攪拌して固定します。PBSで固定した細胞を2回洗浄し、各ウェルに200〜300 µLのDAPIを加えて、プレートを室温で10分間インキュベートします。PBSで細胞を2回洗浄した後、プレートからカバーガラスを慎重に取り出し、余分なバッファーを吸い取ります。封入剤を1滴載せた顕微鏡スライドの上に、カバーガラスを反転させて載せます。次に、スライドから過剰な封入剤を取り除きます。ほぼコンフルエントにまで増殖した細胞を用い、平衡化した増殖培地を除去して、温めておいた新鮮なDMEMを加えます。細胞を1時間インキュベートします。異なる濃度のリガンドで細胞を30分間処理します。また、ここに示す異なる時間、10⁻⁶ Mのリガンドで細胞を処理します。冷PBSを用いて細胞を2回洗浄し、各ウェルにPBSで調製した4% PFAを1 mL添加した後、細胞を15分間緩やかに攪拌します。細胞をPBSで2回洗浄した後、プレートのウェルからカバーガラスを慎重に取り出し、このビデオの最初の方で示した方法で封入します。共焦点顕微鏡観察を行うには、水銀ランプの電源、顕微鏡PC、スキャナー、レーザーを含む共焦点顕微鏡のハードウェアの電源を入れます。ソフトウェアを起動し、構成を確認してレーザーを選択してください。取扱説明書に従って、共焦点顕微鏡システムの各ユニットの電源を入れます。準備したスライドを顕微鏡ステージに載せ、ステージコントローラーを使用して、対物レンズの直下にサンプルを配置します。油浸レンズを使用する場合は、カバーガラスの上にシダーオイルを1滴滴下し、カバーガラスがレンズ側を向くようにスライドを配置してください。蛍光下で目的の細胞を探し、スキャンモードに切り替えて、放出蛍光色素のレーザー強度とスペクトル範囲を選択します。レーザー強度およびその他のパラメータを調整して、高品質な画像を撮影してください。この図は、HEK293細胞におけるpEGFP-N1の発現を示しています。GFP信号は細胞質および核で検出されました。ここでは、S-Japonica由来のゴナドトロピン放出ホルモン受容体（SjGnRHR）のHEK293細胞における細胞内局在を示しています。EGFP受容体は緑色で、細胞膜を強調するDil染色は赤色で示されています。受容体が細胞膜に局在しているのがわかります。SjGnRHRsの内部移行を可視化するため、細胞を異なる濃度のゴナドトロピン放出ホルモンで処理しました。ここで示されているように、受容体の内部移行は用量依存的に進行し、10⁻⁶ Mのリガンドでは受容体が細胞表面から完全に内部移行しました。10⁻⁶ Mのリガンドで異なる時間処理したところ、アゴニスト刺激から10分後にSjGnRHRsの内在化が検出され、60分までには極めて高度な内在化が起こりました。HEK293細胞で示された通り、両方の実験において、蛍光SjGnRHR EGFP融合タンパク質は主に細胞膜に局在しており、その後、劇的かつ迅速に細胞内へと内在化しました。この手順を行う際は、細菌、真菌、およびマイコプラズマの汚染がない適切な条件下で細胞を維持することが重要です。本手順に従い、細胞の確認や固定化などの手法を行うことで、タンパク質受容体のパスVの2番目の問いのような追加の疑問に答えることが可能です。各段階の開発を経て、本技術は、細胞生物学および生化学分野の研究者が、さまざまな細胞株における膜貫通受容体の局在化および内部移行を探索するための道を切り拓きました。

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡イメージングシステムを採用することにより、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）効率のピクセルレベルのマップは、ホモオリゴマー複合体を形成するために仮定膜受容体を発現する細胞に対して得られる。効率マップをFRETから、我々が検討されてオリゴマー複合体に関する化学量論的情報を推定することができます。...

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。...

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。...

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

ここで説明する蛍光に基づくカルシウム動員アッセイは、オーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の機能的に活性化するリガンド（単数または複数）の同定のための培地スループット逆薬理スクリーニングシステムである。...

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。...

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

ここでは、アンジオテンシンII治療によって開始エンドサイトーシスの間に緑色蛍光タンパク質タグ付きアンジオテンシン1a型受容体を発現画像セルにプロトコルを提示します。この技術は、第二の蛍光マーカーで標識リソソームを含み、その後時間をかけて立体的に受容体とリソソームの共局在を分析するためのソフトウェアを利用します。...

共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

学ぶ共焦点顕微鏡を用いたGPCR内在化検出法。HEK293細胞でリガンド活性化受容体の動態を可視化し、細胞内シグナル伝達と受容体リサイクルのメカニズム解明に貢献します。

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

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