ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法
2017年5月12日
ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。
このスクリーニングの全体的な目標は、胚性幹細胞の多能性を調節する低分子プロテインキナーゼ阻害剤を同定することです。この方法は、胚性幹細胞の多能性を調節する新規のプロテインキナーゼシグナル伝達経路を特定することにより、胚性幹細胞シグナル伝達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。したがって、この手法の主な利点は、標準的な実験装置と容易に入手可能な試薬を使用してスクリーニングを比較的簡単に実行できることです。
この手法のアイデアを思いついたのは、多能性シグナル伝達経路に関するほとんどの研究がキノームの膨大な波を完全に無視していることに気づいたときでした。10センチのプレートに5ミリリットルの0.1%ゼラチンを追加して、ゼラチンでコーティングされた10センチの皿を準備します。室温で5分間インキュベートした後、ゼラチンを吸引し、プレートを2分間乾燥させます。
次に、100ナノグラム/ミリリットルのGSTタグ付きLIF、10%のウシ胎児血清、および5%ノックアウト血清置換を含む標準的なマウスES細胞培地で、コーティングされた皿に任意の標準マウスES細胞株をプレートします。細胞を摂氏37度で5%CO2で培養し、毎日培地を交換します。マウスES細胞を隔日で約80%のコンフルエント度で継代し、培地を吸引し、プレートあたり5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。
次に、マウスES細胞のプレートあたり1ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシン処理した細胞を4ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞を1200 RPMで5分間遠心分離します。得られた細胞ペレットを5ミリリットルの培地に完全に再懸濁し、ピペッティングで上下させて単一細胞懸濁液を生成します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルーを組み合わせて細胞をカウントします。混合物を細胞計数チャンバーに入れるか、血球計算盤と光学顕微鏡を使用します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、3000マウスES細胞を0.1%ゼラチンコーティング96ウェルプレートに播種し、最終容量の100マイクロリットルの培地にします。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して、キナーゼ阻害剤を1〜100希釈で適用します。培地を静かにピペットで動かして、阻害剤と細胞懸濁液を混合します。次に、細胞を組織培養フードに1時間沈殿させて、めっき表面全体に均等に分布するようにします。
培地を変更せずに細胞を48時間培養します。スクリーニング分析を開始するには、マルチチャンネル吸引器とピペットを使用して、200マイクロリットルのPBSで96ウェルマウスES細胞プレートを洗浄します。洗浄後、細胞抽出物を150マイクロリットルの溶解緩衝液に混合します。
抽出物をV底96ウェルプレートで1500倍Gで30分間遠心分離することにより、抽出物を清澄化します。次に、96ウェル真空ドットプロットマニホールドを使用して、100マイクロリットルの上清をニトロセルロース膜に固定化します。メンブレンを乾燥させ、40ミリリットルのポンソーSで染色して、一貫した転写を確保します。
TBSTでメンブレンを洗浄した後、TBSTと3%ミルクでブロックします。次に、ブロッキングバッファーで1〜1000の希釈でNanogおよびDnmt3b抗体のメンブレンを一晩インキュベートします。翌日、TBSTでメンブレンを10分間3回洗浄します。
次に、ブロッキングバッファー中で1〜10,000の希釈で30ミリリットルの二次抗体にインキュベートします。デジタルイムノブロッティングイメージングシステムを使用してメンブレンを開発します。スクリーニングで同定されたキナーゼ阻害剤は、先に進む前に従来のイムノブロッティングを用いてバリデー
ションすることが重要です。これにより、ダウンストリーム分析を進める前に誤検出を排除できます。スクリーニングデータを分析し、テキストプロトコルに記載されているように、阻害剤が正真正銘の多能性調節因子として検証します。ここに示されているのは、実行した画面からの代表的なNanogドットプロットです。
プライミングされたまたはナイーブな多能性を促進するポジティブコントロール阻害剤が強調表示されています。また、実行した画面からの代表的なDnmt3bドットプロットも示しています。プライミングされたまたはナイーブな多能性を促進するポジティブコントロール阻害剤が再び強調されます。
このプロットでは、阻害剤をNanogとDnmt3bの比率でランク付けしました。NanogとDnmt3bの2倍の比率の閾値を設定して、ナイーブまたはプライミングされた多能性を安定化する阻害剤を特定します。また、Summed Nanog信号とDnmt3b信号も提供されます。
さらに、さらなる検証のために選択されたキナーゼ阻害剤が注目されます。ここに示されているのは、選択されたキナーゼ阻害剤、NanogおよびDnmt3bイムノブロットの従来のイムノブロット検証、ならびにNanogとDnmt3bの比率および全シグナルの提供です。このビデオを見れば、胚性幹細胞の多能性を調節する低分子キナーゼ阻害剤の同定方法について十分に理解できるはずです。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば72時間で完了します。この方法は、多能性を制御するキナーゼシグナル伝達経路についての洞察を提供するだけでなく、胚性幹細胞の分化やエピジェネティックな修飾因子などの他の制御システムにも適用できます。この手順に続いて、エピジェネティックな修飾因子を標的とする低分子阻害剤の他のライブラリーを使用して、多能性調節における新しいプレーヤーを同定することができます。
この技術の開発により、本研究グループは新たな多能性シグナル伝達経路を解明する道を開きました。この手法を使用して、多能性の調節における増幅経路の新たな役割を特定します。
概要
本記事では、ナイーブ状態からプライム状態への多能性転換を制御するキナーゼ調節因子の同定を目的とした、定量的でスケールアップ可能な標的小分子スクリーニングプロトコルを提示します。この手法は、胚性幹細胞のシグナル伝達経路への理解を深めるために設計されています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 幹細胞研究
- 信号伝達
背景
- 胚性幹細胞の多能性は、さまざまなシグナル伝達経路によって調節されています。
- これまでの研究では、キノームの多くの構成要素が見落とされてきました。
- 新規のキナーゼ阻害剤を同定することで、多能性調節に関する知見を得ることができます。
- 本研究は、幹細胞におけるキナーゼシグナル伝達に関する現在の知見の空白を埋めることを目的としています。
研究目的
- 胚性幹細胞の多能性を調節する低分子プロテインキナーゼ阻害剤を同定すること。
- 多能性に寄与する新規のプロテインキナーゼシグナル伝達経路を解明すること。
- 標準的な実験設備を用いた簡便なスクリーニング手法を開発すること。
使用方法
- 細胞培養用ゼラチンコートディッシュの調製。
- マウス胚性幹細胞の播種およびキナーゼ阻害剤の添加。
- 免疫ブロット法によるスクリーニング解析。
- 従来法を用いた同定キナーゼ阻害剤の検証。
主な結果
- ナイーブまたはプライムドな多能性を安定化させるキナーゼ阻害剤の同定に成功した。
- データ解析により、阻害剤選択のためのNanogとDnmt3bの比率の閾値が2倍であることが明らかになった。
- 選択した阻害剤の検証により、多能性調節におけるそれらの役割が確認された。
- 得られた知見は、他の調節系や分化プロセスに応用可能である。
結論
- 開発されたプロトコルにより、キナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングが可能になります。
- この手法は、胚性幹細胞の分化研究に適応させることができます。
- 今後の応用として、多能性制御におけるエピジェネティック修飾因子の探索などが考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
この手法により、バイオ医薬品の研究開発チームは、幹細胞ベースの治療法開発における重要な転換点である多能性転移を制御するキナーゼシグナル伝達ネットワークを体系的に解析することが可能になります。ターゲットのデリスク（リスク低減）のためのスケーラブルで試薬効率の高いプラットフォームを提供することで、初期段階の仮説検証および細胞運命制御に関するメカニズム的な洞察をサポートします。また、キナーゼ調節を定義された多能性バイオマーカーに結びつけることで、ターゲット選択における予測信頼性を高め、再生医療や疾患モデリングパイプラインにおけるポートフォリオの優先順位付けに寄与します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ナイーブ状態からプライム状態への多能性転換の根底にある、キナーゼ依存的なメカニズムの解析を可能にする。
- 運用の価値：標準的な細胞培養および免疫ブロット法の設備を利用するため、特殊な機器の必要性を最小限に抑えられる。
- 予測的価値：多能性バイオマーカー（Nanog/Dnmt3b）を調節するキナーゼ阻害剤を特定し、標的仮説の検証をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： キナーゼを標的としたスクリーニングにおけるヒット化合物の同定のため、定量的なイムノブロット読み取り値（Nanog、Dnmt3b、およびその比率）を算出します。
- 運用上の価値： 96ウェル形式およびマルチチャンネルピペットに対応しており、中スループットの化合物評価が可能です。
- アッセイの有用性： 正規化された再現性の高いシグナルを生成し、プレート間の比較や、閾値に基づくヒット化合物の選択（例：Nanog/Dnmt3b比が2倍以上）を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的連続性：キナーゼ活性を、疾患モデリングや再生医療への応用に重要な多能性状態へと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：主要な多能性因子の上流にあるシグナル伝達経路を明確にし、標的メカニズムにおける曖昧さを軽減します。
- 前臨床的な関連性：分化または組織特異的アッセイに先立ち、幹細胞由来モデルにおけるキナーゼ標的の検証をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は早期創薬ワークフローに適合し、測定可能なバイオマーカー出力を通じて、ターゲット仮説の検証からアッセイ開発および前臨床検証までを連携させます。
- 探索生物学： キナーゼライブラリの仮説駆動型スクリーニングをサポートし、多能性調節におけるシグナリングノードを解明します。
- スクリーニング： 入手しやすい試薬と検出法を用いて、ESCモデルにおける標準化および再現可能な化合物スクリーニングを可能にします。
- 分析： 定量化および標準化されたイムノブロットデータ（信号強度、比率）を提供し、多能性への影響に基づいてヒット化合物の優先順位を決定します。
- トランスレーショナルリサーチ： キナーゼ調節を幹細胞の状態遷移に結びつけ、その後の分化や疾患モデルへの関連性に情報を提供します。
- 企業の再利用： 本プラットフォームは、他の低分子化合物ライブラリ（例：エピジェネティック修飾因子）や、多能性スクリーニング以外の幹細胞コンテクストにも適応可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：バイオマーカーに関連付けられた表現型リードアウトを通じて、キナーゼと標的の多能性関係におけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：標準的な研究室設備（インキュベーター、遠心機、イムノブロットシステム）を活用することで、さまざまな探索チームにおける広範なアクセシビリティを実現する。
- 戦略的価値：生理学的に関連のあるシステムにおいてキナーゼ標的の早期機能検証を提供し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：定義された多能性状態を調節するキナーゼを特定することで、リスク調整後の標的優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 規定の条件下での胚性幹細胞の培養および維持に関する専門知識が必要です。
- イムノブロッティングの設備および検証済み抗体（例：Nanog、Dnmt3b）へのアクセスに依存します。
- アッセイの再現性を確保するため、細胞播種密度、阻害剤の投与量、およびインキュベーション時間の標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適応させる場合、コーティング、培地、および継代プロトコルの最適化が必要になることがあります。
- 偽陽性率については、ターゲットへの結合と特異性を確認するために、直交的な検証（例：従来のイムノブロット）が必要です。
