ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法
May 12th, 2017
ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。
このスクリーニングの全体的な目標は、胚性幹細胞の多能性を調節する低分子プロテインキナーゼ阻害剤を同定することです。この方法は、胚性幹細胞の多能性を調節する新規のプロテインキナーゼシグナル伝達経路を特定することにより、胚性幹細胞シグナル伝達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。したがって、この手法の主な利点は、標準的な実験装置と容易に入手可能な試薬を使用してスクリーニングを比較的簡単に実行できることです。
この手法のアイデアを思いついたのは、多能性シグナル伝達経路に関するほとんどの研究がキノームの膨大な波を完全に無視していることに気づいたときでした。10センチのプレートに5ミリリットルの0.1%ゼラチンを追加して、ゼラチンでコーティングされた10センチの皿を準備します。室温で5分間インキュベートした後、ゼラチンを吸引し、プレートを2分間乾燥させます。
次に、100ナノグラム/ミリリットルのGSTタグ付きLIF、10%のウシ胎児血清、および5%ノックアウト血清置換を含む標準的なマウスES細胞培地で、コーティングされた皿に任意の標準マウスES細胞株をプレートします。細胞を摂氏37度で5%CO2で培養し、毎日培地を交換します。マウスES細胞を隔日で約80%のコンフルエント度で継代し、培地を吸引し、プレートあたり5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。
次に、マウスES細胞のプレートあたり1ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシン処理した細胞を4ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞を1200 RPMで5分間遠心分離します。得られた細胞ペレットを5ミリリットルの培地に完全に再懸濁し、ピペッティングで上下させて単一細胞懸濁液を生成します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルーを組み合わせて細胞をカウントします。混合物を細胞計数チャンバーに入れるか、血球計算盤と光学顕微鏡を使用します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、3000マウスES細胞を0.1%ゼラチンコーティング96ウェルプレートに播種し、最終容量の100マイクロリットルの培地にします。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して、キナーゼ阻害剤を1〜100希釈で適用します。培地を静かにピペットで動かして、阻害剤と細胞懸濁液を混合します。次に、細胞を組織培養フードに1時間沈殿させて、めっき表面全体に均等に分布するようにします。
培地を変更せずに細胞を48時間培養します。スクリーニング分析を開始するには、マルチチャンネル吸引器とピペットを使用して、200マイクロリットルのPBSで96ウェルマウスES細胞プレートを洗浄します。洗浄後、細胞抽出物を150マイクロリットルの溶解緩衝液に混合します。
抽出物をV底96ウェルプレートで1500倍Gで30分間遠心分離することにより、抽出物を清澄化します。次に、96ウェル真空ドットプロットマニホールドを使用して、100マイクロリットルの上清をニトロセルロース膜に固定化します。メンブレンを乾燥させ、40ミリリットルのポンソーSで染色して、一貫した転写を確保します。
TBSTでメンブレンを洗浄した後、TBSTと3%ミルクでブロックします。次に、ブロッキングバッファーで1〜1000の希釈でNanogおよびDnmt3b抗体のメンブレンを一晩インキュベートします。翌日、TBSTでメンブレンを10分間3回洗浄します。
次に、ブロッキングバッファー中で1〜10,000の希釈で30ミリリットルの二次抗体にインキュベートします。デジタルイムノブロッティングイメージングシステムを使用してメンブレンを開発します。スクリーニングで同定されたキナーゼ阻害剤は、先に進む前に従来のイムノブロッティングを用いてバリデー
ションすることが重要です。これにより、ダウンストリーム分析を進める前に誤検出を排除できます。スクリーニングデータを分析し、テキストプロトコルに記載されているように、阻害剤が正真正銘の多能性調節因子として検証します。ここに示されているのは、実行した画面からの代表的なNanogドットプロットです。
プライミングされたまたはナイーブな多能性を促進するポジティブコントロール阻害剤が強調表示されています。また、実行した画面からの代表的なDnmt3bドットプロットも示しています。プライミングされたまたはナイーブな多能性を促進するポジティブコントロール阻害剤が再び強調されます。
このプロットでは、阻害剤をNanogとDnmt3bの比率でランク付けしました。NanogとDnmt3bの2倍の比率の閾値を設定して、ナイーブまたはプライミングされた多能性を安定化する阻害剤を特定します。また、Summed Nanog信号とDnmt3b信号も提供されます。
さらに、さらなる検証のために選択されたキナーゼ阻害剤が注目されます。ここに示されているのは、選択されたキナーゼ阻害剤、NanogおよびDnmt3bイムノブロットの従来のイムノブロット検証、ならびにNanogとDnmt3bの比率および全シグナルの提供です。このビデオを見れば、胚性幹細胞の多能性を調節する低分子キナーゼ阻害剤の同定方法について十分に理解できるはずです。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば72時間で完了します。この方法は、多能性を制御するキナーゼシグナル伝達経路についての洞察を提供するだけでなく、胚性幹細胞の分化やエピジェネティックな修飾因子などの他の制御システムにも適用できます。この手順に続いて、エピジェネティックな修飾因子を標的とする低分子阻害剤の他のライブラリーを使用して、多能性調節における新しいプレーヤーを同定することができます。
この技術の開発により、本研究グループは新たな多能性シグナル伝達経路を解明する道を開きました。この手法を使用して、多能性の調節における増幅経路の新たな役割を特定します。
概要
この記事では、ナイーブ-プライムド多能性移行のキナーゼレギュレーターを特定することを目的とした、標的小分子スクリーニングのための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示します。この方法は、胚性幹細胞のシグナル伝達経路の理解を深めるように設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 幹細胞研究
- シグナル伝達
背景
- 胚性幹細胞の多能性は様々なシグナル伝達経路によって調節されています。
- 過去の研究ではキノームの多くの構成要素が見過ごされていました。
- 新しいキナーゼ阻害剤を特定することで、多能性調節に関する洞察が得られます。
- この研究は、幹細胞におけるキナーゼシグナリングに関する現在の知識のギャップを埋めることを目的としています。
研究の目的
- 胚性幹細胞の多能性を調節する小分子タンパク質キナーゼ阻害剤を特定すること。
- 多能性に関与する新しいタンパク質キナーゼシグナル伝達経路を解明すること。
- 標準的な実験室機器を使用した簡単なスクリーニング方法を開発すること。
使用した方法
- 細胞培養用のゼラチンコーティング皿の準備。
- マウス胚性幹細胞の播種とキナーゼ阻害剤の適用。
- イムノブロット技術によるスクリーニング分析。
- 特定されたキナーゼ阻害剤の従来の方法による検証。
主要な結果
- ナイーブまたはプライムド多能性を安定させるキナーゼ阻害剤の成功的な特定。
- データ分析により、阻害剤選択のためのNanogからDnmt3bへの2倍の比率の閾値が明らかになりました。
- 選択された阻害剤の検証により、多能性調節におけるそれらの役割が確認されました。
- 得られた洞察は、他の調節システムや分化プロセスにも適用できます。
結論
- 開発されたプロトコルにより、キナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングが可能になります。
- この方法は胚性幹細胞の分化を研究するために適応できます。
- 将来の応用には、多能性調節におけるエピジェネティック修飾子の探索が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
