Name: CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶCAPRRESI法によるキメラ遺伝子組み換え技術。制限酵素部位を同義DNA配列に挿入し、PCRと連結反応でタンパク質コード遺伝子を効率的に融合する低コストプロトコルを解説します。

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この作品はConsejo Nacional de Ciencia yTecnología、CONACYT、México（助成金番号154833）およびNacionalAutónomadeMéxicoの支援を受けました。著者はVíctorGonzález、Rosa I.Santamaría、Patricia Bustos、SoledadJuárezに感謝したい。

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

CAPRRESIはPRM 2の代替品として設計されました。元のPRMは強力な技術です。それは、選択された遺伝子の任意の部分に沿ったDNA配列の融合を可能にする。 PRMについては、野生型遺伝子を同じプラスミドにクローニングしなければならない。その後、プラスミド上に見出される野生型および抗生物質耐性遺伝子の内部にオリゴヌクレオチドを設計する。プラスミド破壊は、平滑末端の高忠実度DNAポリメラーゼおよび以前に設計されたオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって達成される。相補的PCR産物のライゲーションは、キメラ遺伝子を組み立て、抗生物質耐性カセットを復元し、機能的プラスミド回収をもたらす。 PRMは、同じプラスミドバックグラウンド上のキメラ遺伝子ライブラリーの構築を可能にする。残念ながら、平滑末端DNA配列のライゲーションは技術的に困難かもしれない。重複するPCRフラグメント1によるキメラアセンブリはまた、DNAポリメラーゼが平滑末端化生成物を産生することを必要とし、各反応のDNA精製。この技術によって組み立てられたキメラ遺伝子は線状DNA産物...

キメラ遺伝子アセンブリは、タンパク質機能を解明するため、および/またはバイオテクノロジー目的のために、分子生物学において広く使用されている。重複するPCR産物増幅1 、プラスミド回収2 、相同組換え3 、CRISPR-Cas9システム4 、部位特異的組換え5 、およびギブソンアセンブリ6のような、遺伝子を融合させるための異なる方法が存在する。これらはそれぞれ異なる技術的利点を提供します。例えば、重複PCR設計の柔軟性、プラスミド回収中の構築物のインビボ選択、またはCRISPR-Cas9およびGibsonシステムの高効率などである。一方、これらの方法のいくつかを実行している間にいくつかの困難が生じることがあります。例えば、最初の2つのアプローチは、平滑末端DNAフラグメントに依存しており、これらのタイプの産物のライゲーションは、sticに比べて技術的に困難であり得るky-endedライゲーション。 部位特異的組換えは、Cre- loxPシステム5のように、オリジナルに余分なDNA配列（傷跡）の痕跡を残す可能性があります。 CRISPR-Cas9は、標的部位4に加えて他のゲノム領域を修飾することがある。 ここでは、プラスミド回収法（PRM）と同義DNA配列に制限酵素部位を挿入し、ライゲーション効率を向上させたタンパク質コード遺伝子を融合させるプロトコールであるプラスミド回収と制限酵素サイト挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを紹介する。アミノ酸配列の完全性を保証するために、制限酵素部位を同義語DNA配列のストレッチ上に挿入する。 CAPPRESIの利点の中には、通常の実験用試薬/ツール（ 例えば 、酵素、コンピテントセル、溶液、サーモサイクラー）を使用して行うことができ、迅速な結果を得ることができるという点が挙げられます。制限に依拠する同義語DNA配列から出現する酵素部位は、目的のタンパク質内の正確な融合点の選択を制限し得る。そのような場合、重複するオリゴヌクレオチドを用いて標的遺伝子を融合させ、制限酵素部位をベクターの耐性遺伝子上に挿入しなければならない。 CAPRRESIは、7つの簡単なステップ（ 図1 ）からなる：1）クローニングベクターpUC18またはpUC19 6の選択 ; 2）融合される野生型配列のin silico分析; 3）キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択; 4）制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成; 5）選択されたプラスミドへの野生型遺伝子の独立したクローニング; 6）PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化;および7）DNA連結および細菌形質転換を用いたプラスミド回収。この技術によって産生されるキメラ遺伝子は、i番目のシーケンス。 pUC18 / 19ベクターは、小型（ すなわち、 2,686塩基対）、高コピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的利用可能性などのクローニングおよびキメラアセンブリーに技術的利点をもたらす。ここでは、 大腸菌（Escherichia coli）宿主を用いて、バクテリアの培養物が安価で増殖が速いため、キメラを組み立てて取り扱う。このことを考慮して、最終標的プラスミドへの融合断片のその後のクローニングが必要となる（ 例えば、細菌におけるpRK415としての発現ベクターまたは哺乳類細胞におけるpCMVとしての発現ベクター）。 CAPRRESIは、2つの主要なシグマ因子遺伝子、 E. colirpoDおよびRhizobium etlisigAを融合させるために試験された。一次シグマ因子は、転写開始に関与するRNAポリメラーゼサブユニットであり、4つのドメイン（ すなわち、 σ1、σ2、σ3、およびσ4） 8からなる 。アミノ酸配列の長さrpoDおよびsigAによってコードされるタンパク質はそれぞれ613および685である。 RpoDとSigAは48％の同一性（98％のカバレッジ）を共有します。これらの一次シグマ因子は、領域σ2とσ3との間で2つの相補的フラグメントに分割された。キメラ01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）およびキメラ02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）の2つのキメラ遺伝子をこのデザインに従って組み立てた。 DNA融合産物は、配列決定によって確認した。

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNAポリメラーゼ ハイフィデリティ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11304011</td><td>ブラント/3'-AオーバーハングエンドPCR産物の混合物を生成</td></tr><tr><td>高純度プラスミド分離キット</td><td>ロシュ</td><td>11754785001</td><td>すべてのプラスミド精製反応に使用</td></tr><tr><td>高純度PCR製品精製キット</td><td>ロシュ</td><td>11732676001</td><td>アガロースゲル</td></tr><tr><td>からのすべてのPCR精製反応に使用AflII制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0520L</td><td>は、配列5'-CTTAAG-3'を認識し、37°でカットします。C</td></tr><tr><td>KpnI-HF制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3142L</td><td>は、シーケンス5'-GGTACC-3'を認識し、37°Cでカットします。C</td></tr><tr><td>SpeI-HF制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3133L</td><td>配列5'-ACTAGT-3'を認識し、37°Cで切断します。C</td></tr><tr><td>XbaI 制限酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>配列 5'-TCTAGA-3' を認識し、37 °C で切断します。C</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A0166-5G</td><td>抗生物質</td></tr>ナ<tr><td>リジクス酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>N8878-5G</td><td>抗生物質</td></tr>酵母<tr><td>エキス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Y1625-1KG</td><td>細菌細胞培養</td></tr><tr><td>カゼインペプトン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>70171-500G</td><td>細菌細胞培養</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S9888-1KG</td><td>塩化ナトリウム</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>細菌細胞培養</td></tr><tr><td>XbaI 制限酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD0684</td><td>高速消化 XbaI 酵素</td></tr><tr><td>KpnI 制限酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD0524</td><td>高速消化 KpnI 酵素</td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M2200S</td><td>Fast DNA ligation kit</td></tr><tr><td>AflII 制限酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD0834</td><td>高速消化 AflII </td></tr><tr><td>enzymeSpeI 制限酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD1253</td><td>高速消化 SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

ここでは、プラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。 CAPRRESIは、元のプラスミド回収法の多くの利点から利益を得、制限酵素消化を導入してDNAライゲーション反応を容易にする（キメラアセンブリに必要とされる）。このプロトコルでは、ユーザーは野生型遺伝子を同じプラスミド（pUC18またはpUC19）にクローニングします。キメラが組み立てられるべきアミノ酸配列領域のin silico選択の後、ユーザーはそれらをコードするすべての同義語DNA配列を得る。 Ad Hoc Perlスクリプトを使用すると、ユーザーはすべてのシノニムDNA配列を決定できます。このステップの後、別のPerlスクリプトは、すべての同義語DNA配列上の制限酵素部位を検索する。このin silico分析はまた、pUC18 / 19プラスミド上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）を用いて行われる。ユーザは、野生型およびampR遺伝子をPCRによって破壊するために同義語領域内のオリゴヌクレオチドを設計する。 obtの後相補的なDNA断片を精製し、精製し、制限酵素消化を行う。適切な相補的DNA断片を連結することにより、キメラ構築が達成される。 CAPRRESIのために、小さいサイズ（2,686塩基対）、高いコピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的入手可能性などの技術的利点を提供するため、pUC18 / 19ベクターが選択される。キメラ構築のための制限酵素の使用は、平滑末端生成物を産生するDNAポリメラーゼの必要性を排除する。 CAPRRESIは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

図1に CAPRRESIを示します。この方法を用いて、2つの細菌の一次シグマ因子（ すなわち、大腸菌 RpoDおよびR. etli SigA）のドメインを交換することによって、2つのキメラ遺伝子を組み立てた。 rpoDおよびsigA遺伝子のDNA配列は、それぞれGenBankゲノムファイルNC_000913およびNC_007761からArtemis Genome Browser 14を使用して得た。 pUC18ベクターのDNA配列は、NCBIサーバーのヌクレオチドデータベースから得た。 インシリコ（in silico）分析は、REsearch.pl Perlスクリプト（ステップ1.2.2参照）を実行することにより、DNA配列に対して制限酵素部位を分析した。これらの結果をオリゴヌクレオチド設計に使用した（工程1.2.3）。外部オリゴヌクレオチドは、野生型遺伝子をpUC18多重クローニング部位にクローニン...

ここでは、同義語DNA配列への制限酵素部位の挿入および機能的プラスミド回収に基づくプロトコルであるプラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。このプロトコールは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

このビデオでは、プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ（Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion：CAPRRESI）と呼ばれる手法を実演します。この手法では、シノニムDNAに特定の制限酵素部位を導入し、その後DNA配列を切断・交換することで、2つのキメラ遺伝子を作製します。CAPRRESIでは、まず目的の野生型遺伝子を同一ベクターのマルチクローニングサイトに挿入します。次に、各遺伝子においてアミノ酸配列が同一である切断領域を選択し、併せてアンピシリン耐性遺伝子の切断領域を選択します。各ブレーク領域について、制限酵素サイトを含む同義配列を決定するためにPerlスクリプトを使用します。特別に設計したオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、目的の制限酵素サイトを持つ同義DNAを含む4つの相補的な断片を作製します。得られたPCR産物を精製および消化し、その後、ライゲーションしてキメラ配列を構築します。この手法の主な利点は、遺伝子融合を容易にできることです。この方法は、目的のタンパク質酵素の機能は何かといった、分子生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順を開始する前に、目的の遺伝子をベクターのマルチクローニングサイトに挿入しておいてください。ここでは、RNA合成の開始に必要な細菌シグナル因子をコードするrpoDおよびsigA遺伝子を、付随する本文に詳述されている通り、それぞれpUC18にクローニングしています。キメラタンパク質を産生するためのオリゴヌクレオチドを設計するには、まずtranslate.pl Perlスクリプトを実行し、rpoD、sigA、およびampR遺伝子のアミノ酸配列を取得してください。次に、MUSCLEウェブサーバーを使用して、rpoDとsigAのアミノ酸配列をアラインメントします。それぞれの配列について、同一の3〜6個のアミノ酸配列を持つブレイク領域を選択してください。これらの配列をregions.fasというファイルに保存します。次に、ampR遺伝子内から3〜6アミノ酸長の配列を選択し、この配列をregions.fasファイルに保存します。すべての同義DNA配列を決定するために、perlスクリプトのsynonym.plを実行します。その後、どの制限酵素が同義配列を切断するかを調べるため、resynonym.plスクリプトを実行します。次に、同義のDNA配列を用いて、rpoDおよびsigAの切断領域に同一の制限酵素サイトを組み込んだオリゴヌクレオチドを設計します。また、異なる制限酵素サイトを組み込んだampR遺伝子を破壊するためのオリゴヌクレオチドを設計します。フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドは、制限酵素サイトの部分で重複するようにします。オリゴヌクレオチドは21〜27ヌクレオチドの範囲とし、シトシンまたはグアニンを含み、制限酵素部位を有している必要があります。フォワードオリゴヌクレオチドは、テンプレートDNA上の標的領域と同じ配列を持ちます。リバースオリゴヌクレオチドは、テンプレートDNA上の標的領域の相補的な逆向き配列（リバースコンプリメンタリー配列）となります。DNA合成業者にオリゴヌクレオチドを注文します。オリゴヌクレオチドが届いたら、rpoDおよびsigA pUC18構築物をテンプレートDNAとして使用し、PCRを行います。これにより、各構築用の2つの相補的なパーツが作製されます。PCRの後、アガロースゲル電気泳動を行い、PCR産物をDNAテンプレートから分離します。親プラスミドによる汚染を避けるため、相補的なプラスミド断片を精製することが極めて重要です。親プラスミドは、ここで実演するようにゲル精製によって除去するか、あるいはDpnI制限酵素消化を用いて親プラスミドを断片化することで排除できます。電気泳動後、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色します。染色したゲルを300 nanometerのUVチャンバーに置き、バンドを可視化します。ゲルへのUV照射時間は最小限に留めてください。次に、PCR産物が含まれるバンドを切り出し、マイクロ遠心チューブに入れます。キットを使用してDNAサンプルを精製し、適切な高速消化制限酵素を用いて、すべての相補的DNA断片に対してダブルダイジェスト（二重消化）を行います。プラスミドの相補的部分を融合させるために、AFL2およびSPE1を使用します。消化反応液を37 °Cで15分間インキュベートします。次に、製造元のガイドラインに従って制限酵素を不活化します。例えば、AFL2およびSPE1は80 °Cで20分間加熱して不活化します。次に、適切なDNA断片をライゲーションバッファー、水、およびT4 DNAリガーゼと混合します。ライゲーション反応を25 °Cで10分間行います。これにより、ampR遺伝子の完全性が回復し、機能的なタンパク質が生成されます。ライゲーション後、キメラアセンブリのライゲーション反応液を3〜5 µL用い、E.Coli DH5 alphaに形質導入します。形質導入した細胞をLBアンピシリンX-gal IPTGプレートに播種し、37 °Cで一晩培養します。翌日、白色の形質導入E.Coliコロニーを選択し、新しいLBアンピシリンプレートにストリークします。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。シーケンシングの候補を選択するために、コロニーPCRを行います。前述と同様に電気泳動を行い、1%から2%のアガロースゲルでバンドを可視化します。適切なサイズのDNAバンドを示す候補コロニーを選択し、培養を開始します。翌日、キットを使用して、それらからプラスミドDNAを抽出します。プラスミド精製後、サンプルをシーケンシングに提出します。rpoD sigA キメラ構築物は、このビデオで詳しく説明した方法で作成しました。シークエンシングの後、muscle ソフトウェアを使用して野生型およびキメラ遺伝子ののアライメントを行いました。その後、ここで示すように mura ソフトウェアを用いてキメラ遺伝子配列をアセンブルしました。同義置換配列は黒色で示され、AFL2部位には下線が引かれています。このシーケンシングデータは、キメラ構築物の作製においてCAPRRESI法が有効に活用できたことを示しています。このビデオを視聴することで、遺伝子セグメントを融合させるための優れた手法を習得できるはずです。

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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