インビトロイメージングと蛍光標識のGnRH類似体の薬物ターゲティング効率の定量化で

本手順の目的は、ヒトがん細胞培養におけるGnRHベースの薬剤輸送システムの有効性を調査および予測することです。この手法は、異なる種類のヒトがん細胞がGnRH標的抗がん剤をどの程度の効率で取り込むかなど、標的抗がん療法分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、共焦点顕微鏡観察とフローサイトメトリー分析を同時に利用可能にする、新しい蛍光標識GnRHアナログを使用している点にあります。

GnRH受容体はいくつかの癌細胞種に高度に発現しているため、この手法を応用することで、それらを選択的に標的とした抗癌療法への展開が期待されます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるBianka Gurbiが行います。まず、播種済みの顕微鏡スライドの7つのウェルから、それぞれ培養液を除去します。

次に、あらかじめ温めておいた完全培地 250 µLを陰性対照ウェルに、また温めておいたGnRH fit seed処理培地 250 µLを残り6つの各ウェルに加えます。スライドをインキュベーターに入れ、37 °C、5% CO2条件下で5時間インキュベートします。5時間のインキュベーション後、各ウェルから培地を吸引し、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。

続いて、各ウェルに250 µLの固定液を加え、スライドを室温で10分間インキュベートします。細胞が固定されたら、固定液を除去し、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。PBSで調製した5 µMの蛍光プローブ溶液を各ウェルに250 µLずつ加え、スライドを室温で10分間インキュベートします。

蛍光プローブ溶液を除去した後、250 µLのPBSで細胞を2回丁寧に洗浄します。最後に、各ウェルに封入剤を3〜4滴加えます。顕微鏡で観察するまで、スライドを室温の暗所に保存してください。

播種済みの顕微鏡スライドの5つのウェルから、それぞれ培養液を除去します。次に、陰性対照ウェルと未処理細胞が入った2番目のウェルに、あらかじめ加熱した完全培地を250 µLずつ加えます。残りの3つのウェルの細胞を、10 µM GnRH FITCを含む加熱済みの処理培地で前処理します。

スライドを37°C、5% 二酸化炭素のインキュベーター内で1時間インキュベートします。その後、処理した細胞から培地のみを除去し、あらかじめ温めておいた完全培地 250 µL で細胞を洗浄します。次に、洗浄用培地を除去します。

次に、あらかじめ温めておいた完全培地 250 µLを3つのウェルのそれぞれに加えます。スライドを37 °C、5% CO2のインキュベーターで1時間インキュベートします。インキュベート後、5つすべてのウェルから培地を除去し、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。

次に、PBSを除去し、250 µLの固定液を用いて室温で10分間細胞を固定します。続いて、固定液を捨て、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。各ウェルに250 µLのブロッキング溶液を加え、スライドを室温で1時間インキュベートします。

ネガティブコントロール以外の各ウェルからブロッキング溶液を吸引除去します。250 µLのPBSで細胞を洗浄した後、各ウェルに250 µLの一次抗体溶液を加えます。スライドを室温の暗所で1時間インキュベートします。

5つのウェルそれぞれから溶液を除去し、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。次に、PBSを除去し、250 µLの二次抗体溶液を加えます。スライドを室温、暗所で1時間インキュベートします。

各ウェルから溶液を吸引し、250 µLのPBSで細胞を洗浄します。洗浄に使用したPBSを除去し、次に5 µMの蛍光プローブを含む250 µLのPBSを各ウェルに加えます。スライドを室温で10分間インキュベートします。

各ウェルから蛍光プローブ溶液を除去し、250 µLのPBSで細胞を注意深く2回洗浄します。最後に、各ウェルに封入剤を3〜4滴加えます。顕微鏡で観察するまで、スライドを室温の暗所で保管してください。

倒立共焦点レーザー走査顕微鏡下で細胞をイメージングします。488 nmと633 nmのレーザーを点灯させます。レーザー増幅とピンホールのサイズを確認してください。

陰性対照サンプルの画像を取得します。核で観察される信号を最適化し、FITCおよびAlexa 546の信号がゼロに近くなるように調整します。その後、同一のパラメータを用いて、処理済みサンプルの画像を取得します。

播種済みの培養プレートの全7ウェルから完全培地をすべて除去します。次に、陰性対照ウェルに1 mLの予熱した完全培地を加え、残りの6ウェルに1 mLの予熱した処理培地を加えます。プレートを37 °C、5% CO₂のインキュベーター内で5時間インキュベートします。

すべてのウェルから培地を除去した後、2 mLのPBSで細胞を2回注意深く洗浄します。PBSを除去し、各ウェルに500 µLのTrypsin EDTA溶液を加えます。細胞が剥離するまで、37 °Cでプレートをインキュベートします。これには約10分かかります。

完全培地1 mLを用いて、各ウェルのトリプシンを中和し、プレートを振盪します。その後、穏やかにピペッティングして細胞を懸濁します。懸濁液を個別のFACSチューブに移し、4°Cで150 ×g、4分間遠心分離します。

上清を注意深くデカンテーションして除きます。次に、各FACSチューブに氷冷したPBSを500 µL加え、細胞を穏やかに再懸濁します。FACSで解析するまで、チューブを氷上に保持してください。

ここでは、咽頭癌細胞におけるGnRHの取り込み解析について提示します。1 µMの蛍光GnRH複合体で5時間処理した結果、咽頭癌細胞内に局在する緑色蛍光シグナルとして、わずかではあるが識別可能な取り込みが認められました。複合体の投与量をさらに増加させると取り込みが亢進し、咽頭癌細胞におけるGnRH取り込みの用量依存性が示されました。

肺癌細胞におけるGnRHの受容体依存性取り込みおよび受容体に対するリガンドの細胞内分布を、蛍光GnRH複合体による処理と、タイプ1 GnRH受容体および核の染色の同時実施によって解析しました。その結果、タイプ1 GnRH受容体は細胞膜に局在し、一方でGnRHタンパク質は細胞内に取り込まれ、細胞質に留まることが示されました。また、FACS解析を用いて、咽頭癌細胞におけるGnRHの取り込みについても検討しました。

結果から、細胞に1 $\mu$MのGnRHコンジュゲートを処理した際に観察されたGnRHの取り込みは、投与量を10 $\mu$Mに増加させると強力に増強されることが示されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで8時間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、処理済みのサンプルおよび蛍光色素を直射光から保護することが重要です。

この手順に従い、細胞生存率試験やアポトーシスアッセイなどの他の手法を実施することで、GnRH標的薬が特定の種類の癌細胞の増殖をどの程度効率的に抑制できるかといった、さらなる疑問を検証することが可能です。この展開を経て、本手法は癌治療分野の研究者が、癌細胞への接着におけるGnRHベースの薬物輸送システムの有効性を探索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、蛍光標識されたGnRH複合体を用いて、癌細胞のGnRH標的治療に対する感受性を探索する方法について、十分な理解が得られるはずです。